楊開興

(邵武將石省級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，福建 邵武 354000)

1 引言

金線蓮是一種蘭屬多年生草本植物，是能夠全草入藥的具有清熱解毒、祛風(fēng)祛濕等功效的名貴中草藥。隨著中醫(yī)藥研究的深入有效應(yīng)用于高血壓、糖尿病、心臟病、肺炎、肝炎等慢性高發(fā)病率疾病的控制治療中，具有獨(dú)特療效。自然生長(zhǎng)條件下的金線蓮因?qū)ιL(zhǎng)環(huán)境要求較高，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，加之金線蓮生長(zhǎng)環(huán)境遭到人為破壞和隨意采挖，野生的金線蓮數(shù)量稀少，難以滿足現(xiàn)代疾病治療的需求[1]。蘭科植物種子細(xì)小，并且使用人工無性繁殖難度系數(shù)高，雖然試管培養(yǎng)初見成效，但是組培苗出瓶栽培困難依據(jù)很多。分析自然界蘭科植物的生長(zhǎng)環(huán)境可知，所有的蘭科植物都與真菌共生，真菌通過自身的生長(zhǎng)代謝為蘭科植物提供生長(zhǎng)所必須的碳水化合物[2]。金線蓮的生長(zhǎng)發(fā)育與內(nèi)生真菌密不可分，內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)金線蓮形態(tài)發(fā)育、體內(nèi)代謝產(chǎn)物累積，提高植物抗性，對(duì)金線蓮的生長(zhǎng)、代謝、抗病性和品質(zhì)有著非常重要的影響。由于金線蓮根際真菌環(huán)境復(fù)雜，不同種類的共生真菌對(duì)金線蓮的促進(jìn)效應(yīng)具有潛在特異性。

基于以上內(nèi)容，本文將從野生金線蓮根際分離內(nèi)生真菌，回接金線蓮組培苗進(jìn)行人工栽培。通過觀察組培苗的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，探究?jī)?nèi)生真菌對(duì)金線蓮栽培生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為提高人工栽培金線蓮的內(nèi)在質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)選擇來自4個(gè)不同產(chǎn)地的野生金線蘭植株各5株，作為金線蓮內(nèi)生真菌的分離和純化的操作對(duì)象。金線蓮生長(zhǎng)培養(yǎng)影響研究材料為無菌實(shí)驗(yàn)室中人工栽培的無菌試管苗共60株，無菌試管苗的苗高2～3 cm，根長(zhǎng)0.5～1.5 cm。

野生金線蓮內(nèi)生真菌菌株的篩選儀器和試劑：超凈工作臺(tái)、立式壓力蒸汽滅菌器、凈水器、光照培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、生物顯微鏡、離心機(jī)、含蔗糖和瓊脂的MS培養(yǎng)基、無水乙醇以及試管、錐形瓶若干[3]。

內(nèi)生真菌影響金線蓮組培苗生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)試用到的儀器和試劑：超凈工作臺(tái)、立式壓力蒸汽滅菌器、光照培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鎂、肌醇、無水乙醇、蔗糖、瓊脂、不含蔗糖和瓊脂的MS培養(yǎng)基以及培養(yǎng)皿、錐形瓶若干[4]。

2.2 實(shí)驗(yàn)菌株的分離和純化

選用來自4個(gè)不同產(chǎn)地的新鮮野生金線蓮植株作為實(shí)驗(yàn)菌株提供來源。去除新鮮野生金線蓮的根、莖、葉表面的泥土、腐爛葉片、雜草等雜質(zhì)，并在自來水下沖洗干凈。用無菌濾紙吸干金線蓮植株表面的水分，分別針對(duì)植株的根、莖、葉進(jìn)行表面消毒處理。按照1 min 75%乙醇、4 min 2.5%次氯酸鈉、1 min 75%乙醇的順序?qū)τ诮鹁€蓮植株的根部表面進(jìn)行消毒；按照1 min 75%乙醇、3 min 2.5%次氯酸鈉、1 min 75%乙醇的順序?qū)τ诮鹁€蓮植株的莖進(jìn)行消毒；按照1 min 75%乙醇、1 min 2.5%次氯酸鈉、30 s 75%乙醇的順序?qū)τ诮鹁€蓮植株的葉片表面進(jìn)行消毒[5]。

對(duì)金線蓮的根、莖、葉表面消毒后，無菌水沖洗4次并吸干表面水分。使用無菌工具在不同金線蓮植株的各個(gè)部位取一定大小的組織塊，將組織塊放在青霉素濃度為50 mg/L的PDA培養(yǎng)基中。在25℃的恒溫環(huán)境下培養(yǎng)真菌[6]。當(dāng)培養(yǎng)基中的組織塊切面長(zhǎng)出肉眼可見的菌落后，挑取菌絲于干凈的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)挑取培養(yǎng)步驟，得到純化后的金線蓮內(nèi)生真菌菌株。將不同菌落的內(nèi)生真菌菌株標(biāo)號(hào)，以便于后期分析。

2.3 菌株轉(zhuǎn)接至金線蓮組培苗處理

金線蓮組培苗在分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，通過調(diào)整培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)成分含量，得到處于瓶苗、小苗、中苗三個(gè)不同分化時(shí)期的金線蓮組培苗[7]。

金線蓮組培苗與內(nèi)生真菌的共培養(yǎng)配置組分為：825 mg/L的硝酸銨、950 mg/L硝酸鉀、185 mh/L的硫酸銨、100 mg/L的肌醇、蔗糖15 g/L、瓊脂14 g/L，將上述組分融合后調(diào)整pH值為5.8。以上無機(jī)培養(yǎng)組分占培養(yǎng)基基體成分的1/3，剩余2/3為MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分[8]。

將純化后的金線蓮內(nèi)生真菌菌株按照不同菌株種類分別接種至培養(yǎng)瓶中央，在培養(yǎng)瓶中與金線蓮組培苗共培養(yǎng)。設(shè)置不接種內(nèi)生真菌菌株只培養(yǎng)金線蓮組培苗作為對(duì)照空白組[9]。將共培養(yǎng)的內(nèi)生真菌菌株和金線蓮組培苗放置在24～26 ℃、光照強(qiáng)度為1500 lux、光照周期為12 h的條件下，培養(yǎng)14 d，每天觀察內(nèi)生真菌及組培苗的生長(zhǎng)狀況。14 d后，移栽繼續(xù)種植。

2.4 不同時(shí)期金線蓮組培苗處理

將所有共培養(yǎng)金線蓮組培苗中成活的苗按照不同苗期進(jìn)行移植栽培處理。將成活的瓶苗煉苗，并用在120 ℃高壓2 h滅菌后的苔蘚植入穴盤中種植。移植前稱量瓶苗鮮重，移植后150 d統(tǒng)計(jì)移植苗的成活率、成活苗的鮮重[10]。

將腐殖質(zhì)和蛭石按照3∶1的比例，并混入一定量的棟樹葉片和固態(tài)菌株配置為小苗和中苗的盆栽基質(zhì)。將配置好的盆栽基質(zhì)等量裝入盆口直徑為10 cm、盆底直徑6 cm,盆高7 cm的帶孔花盆中。將共培養(yǎng)后的小苗和中苗的固體培養(yǎng)基成分沖洗干凈，并消毒小苗和中苗的根、莖、葉表面。將花盆中的基質(zhì)澆水后，按照小苗每盆2株、中苗每盆1株的標(biāo)準(zhǔn)分別移栽小苗和中苗。將移栽后的金線蓮放入溫室中，在溫度為24 ℃、濕度93±1%、光照強(qiáng)度為1300 lux的條件下培養(yǎng)盆栽苗[11]。金線蓮苗體移栽前，稱量苗體鮮重，并在培養(yǎng)100 d后，統(tǒng)計(jì)移植苗的成活率、成活苗的鮮重。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

在對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的分離和純化過程中，共獲取5種金線蓮內(nèi)生真菌。將4種金線蓮內(nèi)生真菌分別標(biāo)記為01～05號(hào)菌。將內(nèi)生真菌與不同生長(zhǎng)周期的金線蓮共培養(yǎng)，觀察金線蓮生長(zhǎng)狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)金線蓮生長(zhǎng)相關(guān)數(shù)據(jù)并分析處理后得到相應(yīng)結(jié)論。

3.1 內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮瓶苗的生長(zhǎng)發(fā)育影響

金線蓮瓶苗和不同種類內(nèi)生真菌共培養(yǎng)150 d，在培養(yǎng)期間，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組金線蓮瓶苗的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，以及培養(yǎng)結(jié)束后，兩組金線蓮苗的干重增加量、苗高增加量、鮮重增加量、氣生根和基生根數(shù)量變化數(shù)據(jù)如下表所示，分析表1中數(shù)據(jù)，研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)金線蓮瓶苗的生長(zhǎng)發(fā)育影響。

表1 內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮瓶苗的生長(zhǎng)發(fā)育影響數(shù)據(jù)

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)計(jì)算，與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)的金線蓮植株的成活率為96.2%，對(duì)照組未與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)的金線蓮植株的成活率為43.7%。從與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)的金線蓮植株共生基表面部分呈現(xiàn)的形態(tài)上來看，在02和03號(hào)菌的作用下，金線蓮瓶苗的生長(zhǎng)速度處于本次實(shí)驗(yàn)所有組別的中的偏下。02和03號(hào)菌的菌落在共培養(yǎng)60 d后，菌落約占培養(yǎng)基的1/2，與對(duì)照組金線蓮植株相比較為粗壯，黃色葉片數(shù)量較少。與01和05號(hào)菌共培養(yǎng)的金線蓮瓶苗生長(zhǎng)速度最快，在共培養(yǎng)40 d后，01和05號(hào)菌的菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。但是與對(duì)照組瓶苗相比較，與01和05號(hào)菌共培養(yǎng)的金線蓮瓶苗的黃葉相對(duì)較多。與04號(hào)菌共培養(yǎng)的金線蓮瓶苗生長(zhǎng)速度中等，菌落在共培養(yǎng)85 d時(shí)長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，并且與04號(hào)菌共培養(yǎng)的瓶苗生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)最好、氣生根發(fā)達(dá)。與5種內(nèi)生真菌共培養(yǎng)時(shí)，金線蓮瓶苗的鮮重、干重都有顯著提高。5種內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮瓶苗的氣生根有非常明顯的促進(jìn)作用，其中作用效果最佳的共生培養(yǎng)組相比增加了約43.8%。5種內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮瓶苗基生根的促進(jìn)作用有限，但相比對(duì)比組仍有所提升。

內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮瓶苗的成活率有明顯的促進(jìn)作用，并且能夠促進(jìn)瓶苗氣生根的發(fā)育、鮮重的增加，提高瓶苗的抗性。移栽后的瓶苗長(zhǎng)勢(shì)依舊良好，表明內(nèi)生真菌能夠保護(hù)金線蓮生長(zhǎng)、促進(jìn)金線蓮吸收營養(yǎng)物質(zhì)。

3.2 內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮小苗的生長(zhǎng)發(fā)育影響

不同內(nèi)生真菌與金線蓮小苗共同培養(yǎng)后，在小苗盆栽階段通過噴灑添加菌種的藥劑對(duì)小苗重復(fù)接種相同種類的菌種。統(tǒng)計(jì)金線蓮小苗的各項(xiàng)生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，具體的數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮小苗的生長(zhǎng)發(fā)育影響數(shù)據(jù)

驗(yàn)證組金線蓮小苗在生長(zhǎng)過程中繼續(xù)噴灑不同種類的內(nèi)生真菌溶劑，小苗移栽至花盆栽培的100 d內(nèi)，驗(yàn)證組小苗的整體長(zhǎng)勢(shì)都好于對(duì)照組金線蓮小苗。噴灑了內(nèi)生真菌的小苗植株根、莖相比對(duì)照組更加粗壯，葉片數(shù)量明顯多于對(duì)照組小苗，而且驗(yàn)證組金線蓮小苗的黃葉數(shù)量少于對(duì)照組小苗。對(duì)于噴灑了不同種類內(nèi)生真菌的對(duì)照組金線蓮小苗，生長(zhǎng)過程噴灑了01和04號(hào)內(nèi)生真菌的小苗鮮重和干重增加量相比較多，且噴灑兩種內(nèi)生真菌的小苗氣生根增加量較多。而實(shí)際的小苗生長(zhǎng)狀態(tài)也可發(fā)現(xiàn)，噴灑了兩種真菌的小苗生長(zhǎng)速度明顯快于噴灑了其它種類菌種的小苗；噴灑02號(hào)和03號(hào)內(nèi)生真菌的小苗生長(zhǎng)速度、干鮮重增加量、氣生根增加量都相比于對(duì)照組其它小苗較少，但是其基生根的增加量較多，整體小苗的根系在花盆中生長(zhǎng)深度較深；噴灑05號(hào)內(nèi)生真菌的小苗鮮重和干重增加量處于中等，氣生根增加量較少，但相比其它對(duì)照組小苗，該組小苗的黃葉比例最低，植株高度雖相比較矮，但是植株的莖部相比更加粗壯。在100 d移植培養(yǎng)后，噴灑了01和04號(hào)內(nèi)生真菌的小苗已經(jīng)進(jìn)入下一生長(zhǎng)周期，植株生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)優(yōu)于噴灑其它種類真菌。綜上所述，01和04號(hào)內(nèi)生真菌能夠有效縮短金線蓮小苗的生長(zhǎng)周期、促進(jìn)小苗的快速生長(zhǎng)；02號(hào)和03號(hào)真菌能夠促進(jìn)金線蓮小苗基生根向栽培基質(zhì)更深處生長(zhǎng)；05號(hào)真菌能夠促進(jìn)金線蓮小苗的莖、葉生長(zhǎng)，使得植株莖部粗壯、葉片更加健康。

3.3 內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮中苗的生長(zhǎng)發(fā)育影響

不同組金線蓮中苗在4種內(nèi)生真菌的分別作用下，生長(zhǎng)發(fā)育的具體數(shù)據(jù)如表3所示。分析表3中數(shù)據(jù)，結(jié)合植株生長(zhǎng)情況，得出相應(yīng)結(jié)論。

表3 內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮小苗的生長(zhǎng)發(fā)育影響數(shù)據(jù)

金線蓮中苗在移植并噴灑不同內(nèi)生真菌溶劑栽培100 d后，苗體長(zhǎng)勢(shì)略微優(yōu)于對(duì)照組中苗的苗體長(zhǎng)勢(shì)，對(duì)照組之間對(duì)比，噴灑了03號(hào)真菌的金線蓮中苗的長(zhǎng)勢(shì)相比較好。噴灑其它4種內(nèi)生真菌的金線蓮中苗生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)相差不多。以上數(shù)據(jù)表明，在金線蓮中苗的生長(zhǎng)過程中，噴灑內(nèi)生真菌的植株長(zhǎng)勢(shì)有一定提升，03號(hào)真菌的促進(jìn)生長(zhǎng)作用較強(qiáng)。

綜合以上3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮中苗的生長(zhǎng)作用非常有限，遠(yuǎn)不及對(duì)金線蓮瓶苗、小苗生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)效果。

4 結(jié)語

內(nèi)生真菌廣泛存在于蘭科植物中，為高質(zhì)量、大規(guī)模地人工培養(yǎng)出品質(zhì)良好的金線蓮，本文研究了內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮栽培生長(zhǎng)發(fā)育的影響。在本次實(shí)驗(yàn)中提取的內(nèi)生真菌對(duì)金線蓮不同時(shí)期的植株生長(zhǎng)都有一定的促進(jìn)作用，但是野生金線蓮根際微生物環(huán)境復(fù)雜，仍需要更多的研究數(shù)據(jù)為人工栽培金線蓮提供理論支撐。為深入研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)金線蓮生長(zhǎng)發(fā)育的影響，未來將進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生真菌復(fù)合作用以及數(shù)量對(duì)金線蓮不同時(shí)期植株的生長(zhǎng)發(fā)育影響。