王 康, 崔玉琳, 高政權, 孟春曉, 秦 松

微藻基因工程在高價值化合物生產上的應用

王 康1, 2, 崔玉琳1, 3, 高政權4, 孟春曉4, 秦 松1, 3

(1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物學與生物資源保護重點實驗室, 山東 煙臺 264003; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071; 4. 濱州醫(yī)學院 藥學院, 山東 煙臺 264003)

微藻在生產蛋白質、油脂、色素等方面具有作為細胞工廠的潛力, 在解決傳統(tǒng)生物量生產和市場未來的一些局限性方面發(fā)揮著推進作用?；蚬こ檀龠M了微藻的改良, 推動了微藻的產業(yè)化進程。本文綜述了近年來微藻基因工程的研究進展以及基因工程在微藻生產生物燃料、醫(yī)藥等方面的應用。本文能為基因工程技術在微藻中的研究及應用提供思路, 從而使微藻以及微藻產品變得更具有經濟競爭力。

微藻; 細胞工廠; 高價值化合物; 基因工程

微藻是一類分布廣泛的光合自養(yǎng)單細胞生物的總稱, 包括了許多原核和真核的種類, 它們通過細胞代謝可以產生多糖、蛋白質、色素、脂質等多種高價值化合物, 這使其在食品保健、醫(yī)藥、生物燃料等領域具有很好的開發(fā)前景。微藻的規(guī)?；B(yǎng)殖在解決傳統(tǒng)生物量生產和市場未來的一些局限性方面發(fā)揮著推進作用, 例如, 從微藻中提取高價值副產品使基于微藻的可再生能源成為經濟可行的選擇[1]。此外, 工業(yè)上用于生物量生產的一些綠藻在國際市場上被認為是安全的, 這說明直接以微藻細胞為原料, 通過簡單的處理和加工來生產微藻產品是可行的[2]。然而, 直接利用微藻生產高價值化合物較為困難且產量低[3], 這使得大多數(shù)的微藻產品經濟效益低下。為了改變這一現(xiàn)狀, 通過基因工程技術引入外源基因來提高細胞代謝物的含量已經成為高產藻株選育的一種重要的手段。本文綜述了微藻基因工程的研究進展及基因工程在高價值微藻產品生產上的應用, 以期基因工程技術在提高微藻產品經濟競爭力中發(fā)揮重要的作用。

1 微藻的基因工程

單細胞微藻在學術研究和工業(yè)生物技術應用方面具有獨特的優(yōu)勢, 其原因主要有三點: 1) 微藻以光合固碳為主的生活方式; 2) 細胞內可合成多種高價值的天然產物; 3) 對高通量技術的適應性[4]。微藻的基因工程從一個基因開始, 操作或導入該基因就會獲得所需要的表型[5], 這種技術可以改善藻類的代謝, 并通過引入外源基因以獲得所需要的高價值化合物, 如重組蛋白質、色素以及其他代謝產物[6]。將基因元件(啟動子、轉錄調控區(qū)域、核糖體結合位點、開放閱讀框、終止子等)有機地連接起來, 便形成了功能基因模塊[7], 把功能基因模塊導入已有生物網絡, 異源表達出底盤細胞不能合成的產物或對已有的產物進行優(yōu)化, 在藥物、能源、食品等方面已有突出進展。

1.1 原核微藻的基因工程

原核微藻是地球上最古老的一類生物之一, 主要以藍藻(也被稱為藍細菌)為主, 螺旋藻、集胞藻等都屬于原核微藻。相對于真核微藻, 原核微藻更容易獲得高的生物量積累, 這是建立生產高價值化合物細胞工廠的有利條件。目前, 在一些藍藻中已經建立了成熟的遺傳轉化體系, 包括合適的外源基因插入位點、基因表達調控元件、篩選標記基因以及轉化方法等。

螺旋藻具有很高的蛋白質含量, 且適合規(guī)?；B(yǎng)殖。目前, 我國的螺旋藻生物量產量能夠達到10 000 t/a(細胞干重)。但是, 螺旋藻細胞內較高的核酸酶活性抑制了外源基因的整合, 使螺旋藻遺傳轉化體系的構建變得極為困難。集胞藻擁有一套天然的轉化系統(tǒng)且遺傳背景清晰, 在集胞藻中可以通過同源重組的方法將外源基因整合到染色體上, 是目前基因工程研究最常用的藻株之一[8]。

1.2 真核微藻的基因工程

由外源基因編碼的蛋白質通常在細胞核或葉綠體中表達, 建立高效的轉化體系有利于提高微藻潛在的應用價值, 因此許多科學家和公司正向這樣的方向發(fā)展。在對微藻進行設計時, 應考慮兩個轉化系統(tǒng)的特性, 選擇合適的轉化系統(tǒng)達到自己的目的。目前, 萊茵衣藻()是最先進的微藻平臺, 其有兩套成熟的轉化系統(tǒng): 核轉化系統(tǒng)及葉綠體轉化系統(tǒng), 并在科學研究中得到了廣泛的應用[9]。外源基因表達的難題促進了微藻基因工程領域的研究, 加快了啟動子及篩選標記在轉基因微藻中的應用速度。但是, 目前已成功實現(xiàn)外源基因轉化的微藻種類仍然有限。對于新的藻種的轉化, 特別是具有重要商業(yè)價值的微藻, 將有更多的工作有待進一步開展。

1.2.1 核轉化

微藻的遺傳操作需要穩(wěn)定的核轉化, 并且能夠高效地表達重組蛋白質或關鍵酶以提高目標化合物的產量。但是外源DNA核表達的低效一直是難以解決的問題, 目前, 已經提出位置效應、RNA沉默、過度緊湊的染色質結構和非常規(guī)的表觀遺傳效應作為杜氏藻中外源蛋白核表達低效的可能原因[10]。此外, 也有報道稱低表達水平可能是由于外源DNA的隨機整合[11], 這種現(xiàn)象也被認為是外源DNA的染色質結構或調節(jié)元件對宿主基因組中整合位點產生的影響[10], 基因編輯技術的應用將會促進這一問題的解決。

1.2.2 葉綠體轉化

葉綠體轉化利用 DNA 同源重組機制, 在外源基因兩個側翼加入底盤細胞葉綠體基因組中兩段相鄰的同源序列, 從而較精確地控制外源基因插入葉綠體基因組中的功能基因之間, 避免產生位置效應。并且該轉化系統(tǒng)表達的重組蛋白質不需要翻譯后修飾[12], 可以成功地在葉綠體基因組中獲得外源蛋白質的高產率。

要進行微藻葉綠體的穩(wěn)定轉化, 必須選擇合適的基因插入位點, 外源基因的插入應當不影響微藻的正常生存。目前, 已有許多微藻的葉綠體基因組完成測序, 為外源基因在葉綠體的精確定位奠定了基礎。然而, 藻類葉綠體作為一個新興的轉基因平臺, 其進展大部分都集中在重組蛋白質的研究上, 對其他高價值化合物的研究較少, 取得的進展也不多。

2 基因工程的應用: 微藻細胞工廠的產品

2.1 生物燃料

微藻因高碳水化合物、高脂質含量、生長速度快、對環(huán)境適應性強等優(yōu)勢, 已經成為生物燃料生產的替代原料之一[1, 13]。對能源需求的不斷增加和生物燃料生產路線不斷進步增加了微藻作為第3代生物燃料潛力的研究[14]。但是, 微藻生物燃料的商業(yè)化由于經濟特性差而受到阻礙, 基因工程技術在生物燃料生產中顯示出了很有前景的結果, 是目前克服這一挑戰(zhàn)最有希望的策略之一[15]。

2.1.1 生物柴油

在同樣的條件下, 微藻的光合生產率要比高等植物高數(shù)十倍, 這也使一些微藻細胞中的脂肪酸合成反應異?；钴S, 能夠在細胞中形成高達70%的油脂含量[16]。單細胞的微藻不僅具有較高的生物量生產力和快速積累油脂的能力, 還能夠解決傳統(tǒng)油料作物與糧食作物關于土地競爭的問題, 使其成為大規(guī)模生產生物柴油的資源[17-19]。通過基因工程和代謝工程改善微藻的脂質含量是生產具有經濟競爭力的微藻生物燃料的先決條件[20], 許多研究已經實現(xiàn)了微藻中脂質的過量生產[21]。

脂肪酸的生物合成途徑是以丙酮酸合成的乙酰輔酶A為底物, 經乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的催化后進入脂肪酸合成途徑。因此, Li等[20]在三角褐指藻()葉綠體中過表達了ACCase, 從而使細胞中的脂質過量生產, 這種方法為工業(yè)上利用微藻生物反應器生產高價值化合物提供了強有力的技術支撐。然而, 之前有研究報道了乙酰輔酶A羧化酶基因在硅藻(和)的表達導致了ACCase活性的增加, 但沒有顯著的脂質增加[22], 這可能是由于靶基因的隨機整合和ACCase在胞漿而非葉綠體中的非特異性表達以及ACCase的抑制作用所致[11]?；蚓庉婥RISPR/Cas9技術在微藻能源領域的應用也取得了令人鼓舞的成果, 有研究者應用 CRISPR/Cas9技術對微擬球藻()的一個轉錄調控因子(ZnCys)作了基因敲除和部分沉默, 使突變株的脂質產率比野生型提高了一倍, 其原因在于 ZnCys 的敲除導致了部分蛋白合成受阻, 而相應的碳源轉而用于脂類合成[19]。

脂肪酸合成酶(FAS)的核心酰基載體蛋白(ACP)與硫酯酶(TE)的相互作用調控著脂肪酸的釋放, 這決定了脂肪酸鏈的長度和性質[23]。Blatti等[23]以萊茵衣藻為模型, 證明了ACP和TE之間相互作用控制藻類葉綠體內脂肪酸的水解機制。表征藻類FAS的結構域及不同蛋白質之間的相互作用將會對優(yōu)化微藻中脂肪酸生物合成酶的異源表達發(fā)揮重要的作用, 從而顯著改變轉基因藻株的脂肪酸譜。事實上, 短鏈脂肪酸更適于生物柴油的生產, 因為較高的短鏈脂肪酸含量能夠改善生物柴油的冷流特性[24], 因此, Liu 等[25]將對短鏈脂肪酸特異的酰基-ACP硫酯酶基因轉入野生型集胞藻(sp. PCC 6803)中,顯著提高了藻細胞短鏈脂肪酸含量。

目前, 藻類學家正致力于在微藻細胞中過表達脂肪酸合成相關基因, 以及下調脂肪酸β-氧化和脂肪酶水解相關基因的研究[16]。這些研究將有助于提高細胞內脂肪酸的含量, 以在不久的將來更加經濟地生產藻類生物柴油。

2.1.2 生物乙醇

近年來報道了很多用于生產生物乙醇的藻類, 比如紫球藻()、四肩突四鞭藻()、鏈帶藻(sp.)以及工程藍藻。其中, 利用工程藍藻(如sp. PCC 6803和sp. PCC 7992)直接生產乙醇的方法已經取得了很大的進展, 在大腸桿菌和釀酒酵母中生產生物乙醇的研究促進了這一進程[14]。

微藻細胞內通過光合作用積累的碳水化合物有利于生物乙醇的產生, 然而,“光發(fā)酵”在自然界是行不通的, 需要通過基因工程方法對微藻原有的生物化學途徑進行遺傳改造, 從而有效地生產生物乙醇。Dexter等[8]利用同源重組系統(tǒng)將來源于運動發(fā)酵單胞菌()的丙酮酸脫羧酶(PDC)和乙醇脫氫酶(ADH Ⅱ)基因整合到集胞藻PCC 6803染色體中, 促進了生物乙醇的生產。為了提高光合藍藻系統(tǒng)中的乙醇產量, 需要解決的一個問題是藍藻細胞的低乙醇耐受性。Song等[26]在集胞藻PCC 6803中發(fā)現(xiàn)了一個與乙醇耐受性直接相關的轉錄因子, 該基因可以作為基因工程的有價值靶標, 以進一步改善集胞藻對乙醇的耐受性。此外, Yoshikawa等[27]通過代謝工程研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺輔酶[NAD(P)H]脫氫酶基因的敲除顯著提高了乙醇產量, 敲除該基因的藻株較對照藻株提高了145%。研究微藻生物乙醇的關鍵是要提高微藻生產乙醇的能力, 在經濟上減小化石能源的優(yōu)勢, 使微藻生物乙醇成為可行的選擇。

2.1.3 生物氫

不同于生物柴油和生物乙醇, 氫氣的燃燒僅產生水(H2O), 不會產生污染物質和二氧化碳(CO2), 能夠緩解全球變暖和污染問題[28]。微藻在陽光下通過葉綠體氫化酶(HydA1和HydA2)催化從H2O中提取質子(H+)和電子(e–)并將其利用直接制氫[29]。有報道表明氧氣(O2)的存在會不可逆地抑制葉綠體氫化酶的活性[30-32], 并且也對轉錄和蛋白質成熟也有抑制作用[33]。

目前已經確定了產生耐O2氫化酶的策略, 即一方面改造耐受O2的藻類內源性氫化酶[34], 另一方面可以在微藻中異源表達O2耐受性氫化酶[35]。定點突變可用于內源性氫化酶的修飾[36], 隨機和定點突變都有助于獲得具有高O2耐受性氫化酶的微藻突變株[37]。Xu等[35]將桃紅莢硫菌 ()的O2耐受性氫化酶基因和轉入集胞藻PCC 7942中, 得到了一種重組藍藻產氫系統(tǒng)。然而, 能夠轉入微藻的O2耐受性氫化酶基因太少。于是, Xu等[38]在萊茵衣藻中引入了一條消耗O2新的途徑, 即將大腸桿菌的丙酮酸氧化酶(PoX, 消耗O2催化丙酮酸脫羧成乙酰磷酸和CO2)轉入衣藻, 在不影響生長的情況下將H2的產量增加到野生型的2倍。另外, 在微藻葉綠體中引入O2的螯合劑也可以有效地清除細胞中的O2。固氮根瘤菌() 中的豆血紅蛋白(leghemoglobins, LbA)可以螯合并運輸O2, 且已經證明(豆血紅蛋白基因)的表達可以提高H2的產率[39], 因此, 將(亞鐵螯合酶)基因和基因整合到衣藻葉綠體中獲得了高表達的HemH-LbA蛋白, 從而通過增強呼吸速率提高了藻類H2產量[40]。了解H2生產途徑的分子基礎以及基因工程技術的應用可以增強微藻生物氫的產生, 以促進微藻生物氫的工業(yè)化生產。

2.2 醫(yī)藥與保健功能食品

商業(yè)上用于食品和膳食補充劑生產的微藻在國際上被認為是安全的[2], 因此, 微藻及微藻產品在醫(yī)藥工業(yè)中的應用正逐步受到人們的重視。近年來, 一些重組治療蛋白質已經在微藻中成功表達, 微藻中一些重要藥用成分的應用也被廣泛研究。

2.2.1 重組治療蛋白質

重組蛋白質通常在藻類葉綠體基因組中表達。在藻類葉綠體中表達的重組蛋白質之所以特別有吸引力, 是因為該細胞器含有適于使用合成生物學方法進行遺傳操作的最小基因組, 并且轉基因可以精確定位于特定的基因組位點, 適合重組蛋白質高水平、可調節(jié)和穩(wěn)定的表達[41]。近幾年, 重組治療性蛋白質在微藻葉綠體表達的技術已經日趨成熟。研究重點已經轉移到生物技術的應用和微藻葉綠體作為蛋白質工廠的開發(fā)上, 并通過在質體中添加新的基因來制造有價值的重組產品, 比如單克隆抗體、免疫毒素等蛋白質產品。

到目前為止, 單克隆抗體的生產成本一直是非常昂貴的。利用基因工程技術在原核或真核表達系統(tǒng)中生產單克隆抗體不僅能夠降低成本, 還可以最大程度降低抗體的鼠源性, 從而降低甚至消除人體對抗體的排斥反應。Hempel等[42]在三角褐指藻中引入外源基因以產生針對馬爾堡病毒()核蛋白的單克隆IgG抗體, 并經過多種測試證實了抗體的安全性和耐受性; 另外, 有研究者利用細胞結合實驗和表面等離子體共振對三角褐指藻產生的抗乙型肝炎重組IgG分別與兩個人類Fcγ受體(FcγRI 和FcγRIIIa)的結合能力進行了表征, 結果表明藻源性抗體可與FcγRI和FcyRIIIa結合, 并且其與FcyRIIIa的親和力是正常人IgG1的3倍[43]; 這些研究突出了微藻作為單克隆抗體的穩(wěn)定和低成本表達平臺的潛力。此外, 微藻還是生產免疫毒素的極具吸引力的宿主, Tran等[44]設計了一種由B細胞表面分子CD22的單鏈抗體(scFv)與銅綠假單胞菌()外毒素A(PE40)的結構域Ⅱ和結構域Ⅲ融合而成免疫毒素基因, 經過修飾的毒素無法與細胞結合, 產生的免疫毒素的毒性比天然外毒素A低100倍, 因此更加安全。目前, 藻類學家們正致力于重組蛋白質遺傳工具和生產條件的優(yōu)化[45-49], 以提高微藻葉綠體外源蛋白表達的產量。

選擇一個高活性的啟動子是實現(xiàn)重組蛋白質高效表達的關鍵, 因此許多研究集中在通過研究啟動子的效率來提高微藻中的重組蛋白質產量[10, 50]。對于微藻中的外源基因表達, 已開發(fā)出多種不同的啟動子, 但大多數(shù)是組成型啟動子或內源性誘導啟動子, 它們的應用僅限于目標宿主和產品, 且調控能力有限。因此, Lee等[50]在萊茵衣藻中成功開發(fā)出了一種由調節(jié)蛋白質AlcR和控制基因表達的啟動子(P)組成的可用于重組蛋白質生產的外源誘導型啟動子AlcR-P系統(tǒng), 使靶基因的表達響應乙醇的誘導。盡管重組蛋白質表達水平較低, 但這個系統(tǒng)的開發(fā)對于重組蛋白質的生產具有重要的意義。

傳統(tǒng)蛋白質生物制品的生產成本昂貴且對技術要求苛刻, 需要精密的發(fā)酵設備, 昂貴的下游加工、冷藏和運輸成本以及無菌輸送方法[41]。相比之下, 微藻重組治療蛋白質的生產更加經濟可持續(xù)。目前, 在微藻中生產的生物藥物已經被批準用于商業(yè)生產, 并且少數(shù)藥物已經在動物實驗中進行了測試[51]。然而, 在微藻基因工程藥物完全取代傳統(tǒng)表達系統(tǒng)的生物藥物之前, 還需要大量的基礎研究對微藻生物藥物的安全性進行驗證。

2.2.2 保健功能食品

微藻可作為功能性產品的來源。研究表明, 微藻及微藻產品有增加人體免疫力、抗腫瘤和對心血管系統(tǒng)保健的作用, 對一些疾病有預防和治療作用。微藻作為食品的開發(fā)已有幾十年的歷史, 隨著對微藻營養(yǎng)作用的不斷闡明, 人們越來越重視微藻保健功能食品的開發(fā)與利用。以類胡蘿卜素為例, 微藻來源的天然β-胡蘿卜素比人工合成的更容易被人體吸收, 在醫(yī)藥行業(yè)中更令人關注。為了提高β-胡蘿卜素產量, Chen等[52]合成了編碼297個氨基酸的基因(891 bp), 并在柵藻(sp. CPC2)中表達, 使重組藻株β-胡蘿卜素含量提高了3倍; 酮類胡蘿卜素(ketocarotenoids)作為膳食補充劑需求量是很大的, 但是大多數(shù)藻類和高等植物沒有胡蘿卜素酮酶活性, 不合成酮類胡蘿卜素。因此, 將來源于雨生紅球藻()的一些基因轉入其他藻株(如衣藻、鹽藻)中表達以合成酮類胡蘿卜素是未來工廠化的一種很有前景的方法[53]。編碼β-胡蘿卜素酮酶和β-胡蘿卜素羥化酶的和基因, 是雨生紅球藻蝦青素合成所必需的關鍵酶基因, Zheng等[54]將含有和基因的兩種載體共轉化到萊茵衣藻中, 獲得了比野生型多累積34%的蝦青素。這表明外源和基因在藻細胞中成功表達, 并負責催化轉基因藻類中蝦青素的生物合成。Anila等[55]也通過轉基因的方法驗證了杜氏鹽藻生產蝦青素的可行性。然而, 在具有生長優(yōu)勢的藻株中表達蝦青素的研究處于起步階段, 存在的問題依舊是產量低下, 還需要不斷地優(yōu)化以提高產量。本實驗室在集胞藻PCC 6803中構建了便于表達外源基因的遺傳轉化體系, 在此基礎上, 轉化了來源于雨生紅球藻的和基因并檢測到較高的蝦青素產率, 但是還需要進一步優(yōu)化以提高微藻積累蝦青素的能力[56]。

2.3 動物飼料和飼料添加劑

微藻是昆蟲幼蟲、幼魚及貝類的天然餌料。因此, 藻類學家提出了把經過基因改造的衣藻和眼點微擬球藻()用于向有害昆蟲(如蚊子幼蟲)經口傳遞毒素或將疫苗和生長激素遞送到養(yǎng)殖的魚類和貝類體內[57-59]。這不僅可以提高養(yǎng)殖魚類和貝類幼體的成活率, 還避免了對抗生素產生抗性的病原體與廢水一起傳播, 從而造成嚴重的環(huán)境污染的風險。同樣地, 一些工業(yè)化微藻的安全性和營養(yǎng)價值也為家禽和家畜提供了“功能化飼料”的可能性, 例如, 在衣藻中表達的植酸酶(磷酸六肌醇酶)提高了家禽和家畜對植酸的利用效率并減少了植酸的排泄[60-61], 這證明了在不需要蛋白質純化的情況下可以直接利用轉基因微藻作為食品添加劑提供膳食酶。目前, 本實驗室正在建立等鞭金藻()轉基因體系, 在金藻中表達抗菌肽, 提高金藻的餌料價值, 為水產養(yǎng)殖開辟新途徑[62]。

3 微藻基因工程的瓶頸與展望

盡管藻類是生產各種高價值化合物的最有前景的資源, 但其大規(guī)模應用還存在一些環(huán)境和經濟上的瓶頸。例如, 目前僅有少數(shù)微藻產品能夠以生態(tài)友好和經濟可行的方式進行規(guī)?；a, 而使用微藻作為化石燃料替代原料的所有實踐都是不成功的。到目前為止, 還沒有任何工業(yè)規(guī)模的設施能夠同時滿足環(huán)境友好和經濟可行而進行大規(guī)模藻類生物燃料的生產。有研究者已經提出從微藻中提取高價值的副產品以提高基于微藻的生物燃料的經濟性[1]; 也可以從篩選優(yōu)勢藻株出發(fā), 開發(fā)穩(wěn)定高產的藻株以維持低成本的規(guī)?；B(yǎng)殖并改進上下游工藝、完善發(fā)酵工藝, 從而提高經濟效益。除此之外, 還必須寄希望于微藻領域的初創(chuàng)企業(yè)對微藻生物燃料以及其他高價值產物的突破, 這可能需要更多的研究和開發(fā)資金支持并通過公共補貼與較低成本的傳統(tǒng)產業(yè)形成競爭。

高效率且穩(wěn)定的遺傳轉化體系仍是制約微藻基因工程的瓶頸問題, 需要通過嘗試不同的轉化方法、優(yōu)化轉化條件、篩選合適的表達載體和啟動子來提高轉化效率。隨著高通量測序技術的不斷進步, 更多藻株的基因組將會被解碼, 許多未知功能的基因也會被注釋, 這會促進科學家們對藻類的研究以及微藻基因工程的發(fā)展。值得一提的是, 基因編輯CRISPR/Cas9技術在微藻研究領域的應用也取得了令人鼓舞的成果, 研究者已經實現(xiàn)了對靶基因的精確敲除或敲低[63-66]。有理由相信, CRISPR/Cas9 技術將幫助人們以更快的速度來對目的基因進行編輯, 不僅僅是理解它們的功能, 更重要的是對目標基因的改造?？偠灾? 在微藻的合成生物學未取得實質性進展之前, 基因工程仍然是改造微藻的最有效手段。

[1] JAGADEVAN S, BANERJEE A, BANERJEE C, et al. Recent developments in synthetic biology and metabo-lic engineering in microalgae towards biofuel production[J]. Biotechnology for Biofuels, 2018, 11(1): 185- 205.

[2] NORZAGARAY-VALENZUELA C D, GERMAN-BAEZ L J, VALDEZ-FLORES M A, et al. Establishment of an efficient genetic transformation method inmediated by[J]. Journal of Microbiological Methods, 2018, 150: 9-17.

[3] 張學成, 楊官品. 微藻基因工程及微藻產品高值化[J]. 海洋科學, 2000, 24(11): 24-26.

ZHANG Xuecheng, YANG Guanpin. Microalgal gene engineering and product advancement[J]. Marine Sciences, 2000, 24(11): 24-26.

[4] SCAIFE M A, SMITH A G. Towards developing algal synthetic biology[J]. Biochemical Society Transactions, 2016, 44(3): 716-722.

[5] HLAVOVA M, TUROCZY Z, BISOVA K. Improving microalgae for biotechnology—From genetics to synthetic biology[J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(6): 1194-1203.

[6] RASALA B A, MAYFIELD S P. Photosynthetic biomanufacturing in green algae; production of recombinant proteins for industrial, nutritional, and medical uses[J]. Photosynthesis Research, 2015, 123(3): 227-239.

[7] 李偉, 吳廣畏, 楊玉萍, 等. 后基因組時代的真菌天然產物發(fā)現(xiàn)[J]. 菌物學報, 2015, 34(5): 914-926.

LI Wei, WU Guangwei, YANG Yuping, et al. Discovery of fungal natural product in the post-genomic era[J]. Mycosystema, 2015, 34(5): 914-926.

[8] DEXTER J, FU P C. Metabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production[J]. Energy and Environ-mental Science, 2009, 2(8): 857-864.

[9] SCAIFE M A, NGUYEN G T, RICO J, et al. Establi-shingas an industrial biotechnology host[J]. Plant Journal, 2015, 82(3): 532-546.

[10] AKBARI F, ESKANDANI M, KHOSROUSHAHI A Y. The potential of transgenic green microalgae; a robust photobioreactor to produce recombinant therapeutic proteins[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014, 30(11): 2783-2796.

[11] HUERLIMANN R, HEIMANN K. Comprehensive guide to acetyl-carboxylases in algae[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2013, 33(1): 49-65.

[12] RAVI A, GUO S, RASALA B, et al. Separation options for phosphorylated osteopontin from transgenic microalgae[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(2): 585-600.

[13] SHUBA E S, KIFLE D. Microalgae to biofuels: ‘Promising’ alternative and renewable energy, review[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2018, 81: 743-755.

[14] DE FARIAS SILVA C E, BERTUCCO A. Bioethanol from microalgae and cyanobacteria: a review and technological outlook[J]. Process Biochemistry, 2016, 51(11): 1833-1842.

[15] RANDHAVA K S, RELPH L E, ARMSTRONG M C, et al. Biofuel production: tapping into microalgae despite challenges[J]. Biofuels, 2017, 8(2): 261-271.

[16] MILANO J, ONG H C, MASJUKI H H, et al. Microalgae biofuels as an alternative to fossil fuel for power generation[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2016, 58: 180-197.

[17] DASGUPTA C N, SUSEELA M R, MANDOTRA S K, et al. Dual uses of microalgal biomass: An integrative approach for biohydrogen and biodiesel production[J]. Applied Energy, 2015, 146: 202-208.

[18] MANDOTRA S K, KUMAR P, SUSEELA M R, et al. Fresh water green microalga: a potential feedstock for high quality biodiesel production[J]. Bioresource Technology, 2014, 156(2): 42-47.

[19] AJJAWI I, VERRUTO J, AQUI M, et al. Lipid production inis doubled by decreasing expression of a single transcriptional regulator[J]. Nature Biotechnology, 2017, 35: 647-652.

[20] LI D W, XIE W H, HAO T B, et al. Constitutive and chloroplast targeted expression of acetyl-CoA carboxylase in oleaginous microalgae elevates fatty acid biosynthesis[J]. Marine Biotechnology, 2018, 20(5): 566- 572.

[21] XUE J, NIU Y F, HUANG T, et al. Genetic improvement of the microalgafor boosting neutral lipid accumulation[J]. Metabolic Engineering, 2015, 27: 1-9.

[22] DUNAHAY T G, JARVIS E E, ROESSLER P G. Gene-tic transformation of the diatomsand[J]. Journal of Phycology, 1995, 31(6): 1004-1012.

[23] BLATTI J L, BELD J, BEHNKE C A, et al. Manipulating fatty acid biosynthesis in microalgae for biofuel through protein-protein interactions[J]. PloS One, 2012, 7(9): e42949.

[24] TEO W S, LING H, YU A Q, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid short- and branched-chain alkyl esters biodiesel[J]. Biotechnology of Biofuels, 2015, 8(1): 1-9.

[25] LIU X, SHENG J, CURTISS III R. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(17): 6899-6904.

[26] SONG Z, CHEN L, WANG J, et al. A transcriptional regulator Sll0794 regulates tolerance to biofuel ethanol in photosyntheticsp. PCC 6803[J]. Molecular and Cellular Proteomics, 2014, 13(12): 3519- 3532.

[27] YOSHIKAWA K, TOYA Y, SHIMIZU H. Metabolic en-gineering ofsp. PCC 6803 for enhanced ethanol production based on flux balance analysis[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2017, 40(5): 791-796.

[28] SINGH H, DAS D. Biofuels from microalgae: biohydrogen[M]. Cham: Springer, 2018: 201-228.

[29] KRUSE O, RUPPRECHT J, BADER K P, et al. Impro-ved photobiological H2production in engineered green algal cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(40): 34170-34177.

[30] STRIPP S T, GOLDET G, BRANDMAYR C, et al. How oxygen attacks [FeFe]-hydrogenases from photosynthetic organisms[J]. Proceedings of the National Aca-demy of Sciences, 2009, 106(41): 17331-17336.

[31] MULDER D W, BOYD E S, SARMA R, et al. Stepwise [FeFe]-hydrogenase H-cluster assembly revealed in the structure of HydAΔEFG[J]. Nature, 2010, 465(7295): 248-251.

[32] MILRAD Y, SCHWEITZER S, FELDMAN Y, et al. Green algal hydrogenase activity is outcompeted by carbon fixation before inactivation by oxygen takes place[J]. Plant Physiology, 2018, 177(3): 918-926.

[33] OEY M, SAWYER A L, ROSS I L, et al. Challenges and opportunities for hydrogen production from microalgae[J]. Plant Biotechnology Journal, 2016, 14(7): 1487-1499.

[34] CHANG C H, KING P W, GHIRARDI M L, et al. Atomic resolution modeling of the ferredoxin: [FeFe] hydrogenase complex from[J]. Biophysical Journal, 2007, 93(9): 3034-3045.

[35] XU Q, YOOSEPH S, SMITH H O, et al. Development of a novel recombinant cyanobacterial system for hydrogen production from water[C]// Washington D C. DOE Genomics: GTL Contractor-Grantee Workshop III. Rockville: J. Craig Venter Institute, 2005: 63.

[36] LONG H, KING P W, GHIRARDI M L, et al. Hydrogenase/ferredoxin charge-transfer complexes: effect of hydrogenase mutations on the complex association[J]. Journal of Physical Chemistry A, 2009, 113(16): 4060- 4067.

[37] GHIRARDI M L, ZHANG L, LEE J W, et al. Microalgae: a green source of renewable H2[J]. Trends Biotechnology, 2000, 18(12): 506-511.

[38] XU F Q, MA W M, ZHU X G. Introducing pyruvate oxidase into the chloroplast ofincreases oxygen consumption and promotes hydrogen production[J]. International Journal of Hydrogen Energy, 2011, 36(17): 10648-10654.

[39] WU S, HUANG R, XU L, et al. Improved hydrogen production with expression ofandgenes in chloroplast of[J]. Journal of Biotechnology, 2010, 146(3): 120-125.

[40] WU S, Xu L, HUANG R, WANG Q. Improved biohydrogen production with an expression of codon-opti-mi-zedandgenes in the chloroplast of[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(3): 2610-2616.

[41] TAUNT H N, STOFFELS L, PURTON S. Green biologics: The algal chloroplast as a platform for making biopharmaceuticals[J]. Bioengineered, 2018, 9(1): 48- 54.

[42] HEMPEL F, MAURER M, BROCKMANN B, et al. From hybridomas to a robust microalgal-based production platform: molecular design of a diatom secreting monoclonal antibodies directed against thenucleoprotein[J]. Microbial Cell Factories, 2017, 16(1): 131-140.

[43] VANIER G, STELTER S, VANIER J, et al. Alga-made anti-Hepatitis B antibody binds to human Fcγ receptors[J]. Biotechnology Journal, 2018, 13: 1700496.

[44] TRAN M, HENRY R E, SIEFKER D, et al. Production of anti-cancer immunotoxins in algae: ribosome inactivating proteins as fusion partners[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2013, 110(11): 2826-2835.

[45] GIMPEL J A, HYUN J S, SCHOEPP N G, et al. Production of recombinant proteins in microalgae at pilot greenhouse scale[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2015, 112(2): 339-345.

[46] RAMOS-MARTINEZ E M, FIMOGNARI L, SAKURAGI Y. High-yield secretion of recombinant proteins from the microalga[J]. Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(9): 1214-1224.

[47] LAUERSEN K J, HUBER I, WICHMANN J, et al. Investigating the dynamics of recombinant protein secretion from a microalgal host[J]. Journal of Biotechnology, 2015, 215: 62-71.

[48] BRAUN-GALLEANI S, BAGANZ F, PURTON S. Improving recombinant protein production in thechloroplast using vivid Verde Fluorescent Protein as a reporter[J]. Biotechnology Journal, 2015, 10(8): 1289-1297.

[49] CARRERA-PACHECO S E, HANKAMER B, OEY M. Optimising light conditions increases recombinant protein production in,, chlo-roplasts[J]. Algal Research, 2018, 32: 329-340.

[50] LEE S, YONG J L, CHOI S, et al. Development of an alcohol-inducible gene expression system for recombinant protein expression in[J]. Journal of Applied Phycology, 2018, 30(4): 1-8.

[51] DYO Y M, PURTON S. The algal chloroplast as a synthetic biology platform for production of therapeutic proteins[J]. Microbiology, 2018, 164(2): 113-121.

[52] CHEN C Y, KAO A L, TSAI Z C, et al. Expression of synthetic phytoene synthase gene to enhance β-carotene production insp. CPC2[J]. Biotechnology Journal, 2017, 12(11): 1700268.

[53] VILA M, GALVAN A, FERNANDEZ E, et al. Ketocarotenoid biosynthesis in transgenic microalgae expressing a foreign β-C-4-carotene oxygenase gene[M]. Totowa: Humana Press, 2012: 283-295.

[54] ZHENG K J, WANG C G, XIAO M, et al. Expression ofandgenes fromin transgenic[J]. Science China Life Sciences, 2014, 57(10): 1028-1033.

[55] ANILA N, SIMON D P, CHANDRASHEKAR A, et al. Metabolic engineering offor production of ketocarotenoids[J]. Photosynthesis Research, 2016, 127(3): 321-333.

[56] LIU Y, CUI Y, CHEN J, et al. Metabolic engineering ofsp. PCC6803 to produce astaxanthin[J]. Algal Research, 2019, 44: 101679.

[57] KANG S, ODOM O W, THANGAMANI S, et al. Toward mosquito control with a green alga: Expression of Cry toxins ofsubsp.(Bti) in the chloroplast of[J]. Journal of Applied Phycology, 2017, 29(3): 1377-1389.

[58] SIRIPORNADULSIL S, DABROWSKI K, SAYRE R. Microalgal vaccines[J]. Advances in Experimental Me-dicine and Biology, 2007, 616: 122-128.

[59] LI S S, TSAI H J. Transgenic microalgae as a non- antibiotic bactericide producer to defend against bacterial pathogen infection in the fish digestive tract[J]. Fish and Shellfish Immunology, 2009, 26(2): 316-325.

[60] YOON S M, KIM S Y, LI K F, et al. Transgenic microalgae expressingAppA phytase as feed additive to reduce phytate excretion in the manure of young broiler chicks[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 91(3): 553-563.

[61] ERPEL F, RESTOVIC F, ARCE-JOHNSON P. Deve-lop-ment of phytase-expressingfor monogastric animal nutrition[J]. BMC Biotech-nology, 2016, 16(1): 29-35.

[62] BO Y, WANG K, WU Y, et al. Establishment of a chlo-roplast transformation system in[J]. Journal of Applied Phycology, 2020, 32: 2959-2965.

[63] JIANG W, BRUEGGEMAN A J, HORKEN K M, et al. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in[J]. Eukaryotic Cell, 2014, 13(11): 1465-1469.

[64] SHIN S E, LIM J M, KOH H G, et al. CRISPR/Cas9- induced knockout and knock-in mutations in[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 27810.

[65] HU G R, FAN Y, ZHENG Y L, et al. Photoprotection capacity of microalgae improved by regulating the antenna size of light-harvesting complexes[J]. Journal of Applied Phycology, 2020, 32(2): 1027-1039.

[66] WANG Q, LU Y, XIN Y, et al. Genome editing of model oleaginous microalgaespp. by CRISPR/ Cas9[J]. Plant Journal, 2016, 88(6): 1071-1081.

Application of microalgae genetic engineering in the production of high-value compounds

WANG Kang1, 2, CUI Yu-lin1, 3, GAO Zheng-quan4, MENG Chun-xiao4, QIN Song1, 3

(1. Key Laboratory of Coastal Biology and Biological Resource Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. School of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China)

Microalgae has the potential to be a cell factory in the production of proteins, oils, and pigments and is crucial in solving problems of traditional biomass production and future market. Genetic engineering promotes the improvement and industrialization of microalgae. In this paper, the research progress of microalgae genetic engineering and genetic engineering application in the microalgae production of biofuels and medicines are reviewed. This article can provide some ideas for the research and application of genetic engineering technology in microalgae, thereby facilitating microalgae and microalgae products to become more economically competitive.

microalgae; cell factory; high-value compounds; genetic engineering

Nov. 22, 2019

Q-3

A

1000-3096(2021)12-0142-08

10.11759/hykx20191122003

2019-11-22;

2020-09-16

國家自然科學基金(31972815)

[National Natural Science Foundation of China, No. 31972815]

王康(1995—), 男, 山東濟寧人, 博士研究生, 主要從事微藻代謝工程和分子遺傳學的研究, 電話: 13258052731, E-mail: wangkangsdut@126.com; 孟春曉(1976—),通信作者, 女, 山東淄博人, 教授, 主要從事微藻生理學和微藻分子遺傳學的研究, E-mail: mengchunxiao@126.com; 秦松(1968—), 通信作者, 男, 山東掖縣人, 研究員, 主要從事分子藻類學研究, E-mail: sqin@yic.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)