陰 迪，王一涵，王奕丹，黃鈺雯，劉麗梅，夏 薇

北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林吉林 132013

肝癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。有研究表明，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸或者旁分泌的方式影響腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的形成與發(fā)展[1-2]，然而其自身生長(zhǎng)調(diào)節(jié)方式與行為改變模式還不清晰。外泌體是細(xì)胞分泌的一類30～100 nm的微小囊泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含蛋白成分與核酸成分，已有研究表明，外泌體參與細(xì)胞通訊，是細(xì)胞間溝通的重要媒介[3]。因此，本研究推測(cè)腫瘤細(xì)胞的外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞會(huì)存在某種影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證該推測(cè)，本研究從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、核酸分析等角度，探討了肝癌細(xì)胞HepG2外泌體對(duì)其自身細(xì)胞的增殖、遷移、周期及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

1 資料與方法

1.1儀器與試劑 肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CD63抗體、CD9抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP-羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、HRP-羊抗鼠IgG、超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物均購(gòu)自美國(guó)Boster公司；Transwell細(xì)胞板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；DiI紅色熒光探針購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；碘化丙啶試劑購(gòu)自德國(guó)BioFroxx公司；RNA提取與反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑均購(gòu)自日本Takara公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀、超速離心機(jī)均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；透射電子顯微鏡購(gòu)自日本Hitachi公司；納米粒度儀購(gòu)自美國(guó)Microtrac公司；垂直板電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

高壓氧治療可有效提高血氧含量和血氧彌散半徑，提高腦組織細(xì)胞氧供應(yīng)和利用，維持腦神經(jīng)細(xì)胞的能量供應(yīng)，增加對(duì)病灶區(qū)的供血，使受壓萎縮的腦組織血流量增加、腦回體積增大［12］，同時(shí)高壓氧治療具有清除自由基作用、減少缺血區(qū)腦組織的凋亡，促進(jìn)腦組織復(fù)張；縮小腦組織與顱骨之間的間隙，解除硬膜下血腫的腦微循環(huán)障礙及微血管痙攣［13］，改善腦供血不足及升高顱內(nèi)壓，減少內(nèi)膜再出血，加速膠質(zhì)細(xì)胞的分化增生，避免或減輕外傷后的腦萎縮，促進(jìn)病變區(qū)域毛細(xì)血管的再生和側(cè)支循環(huán)的建立［14］，明顯改善微循環(huán)，促進(jìn)血腫的吸收和神經(jīng)功能恢復(fù)，減少術(shù)后積液的發(fā)生［15］，有效減少血腫復(fù)發(fā)率、提高了治愈率。

按照國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)和職能劃分，口岸出入境貨物監(jiān)管查驗(yàn)工作主要由海關(guān)部門負(fù)責(zé)，進(jìn)出境貨物、人員由檢驗(yàn)檢疫部門負(fù)責(zé)的質(zhì)量和疫情檢驗(yàn)工作；進(jìn)出境人員出入境手續(xù)以及違禁品的查驗(yàn)由邊檢站負(fù)責(zé)；地方口岸辦負(fù)責(zé)口岸建設(shè)管理規(guī)劃和保障服務(wù)工作。[注]引自二連浩特市口岸辦：《二連浩特口岸建成成效及困難》，2015年6月24日。權(quán)責(zé)明確，分工有序。

2) 楊莊東街與晉元莊路交叉口：①原有配時(shí)方案中，未考慮晉元莊路東向北右轉(zhuǎn)對(duì)南向北直行車輛的影響，造成通行時(shí)間浪費(fèi)；②晉元莊路東向南左轉(zhuǎn)車輛相對(duì)較少，給予的綠燈時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成綠時(shí)浪費(fèi)較為嚴(yán)重.

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞HepG2用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入10%的胎牛血清和1%的青霉素鏈霉素混合雙抗，放至5%CO2、37 ℃、濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待第2天胰酶消化后傳代。

1.2.2外泌體的提取 外泌體提取之前，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基處理48 h，收集上清液，用0.22 μm濾器過(guò)濾后進(jìn)行4 ℃差速離心提取[4]，過(guò)程如下：將收集好的細(xì)胞上清液以3 000 r/min離心30 min，棄沉淀；將上清液轉(zhuǎn)移至聚碳酸酯管中，35 000 r/min離心90 min，棄上清液；加1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗內(nèi)壁沉淀；轉(zhuǎn)移至1.5 mL小型離心管中，渦旋振蕩15 min后，10 000 r/min離心30 min，棄沉淀；將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，35 000 r/min離心120 min，棄上清液，加90 μL PBS混勻。

1.2.3外泌體的鑒定 透射電鏡拍照：將樣品置于銅網(wǎng)上，3%磷鎢酸溶液20 μL負(fù)染5 min后濾紙吸干，置于透射電鏡樣品室內(nèi)觀察形態(tài)并拍照。粒徑檢測(cè)：先用無(wú)菌PBS將參數(shù)調(diào)零，擦干后加200 μL的外泌體懸液到樣品室內(nèi)，時(shí)間設(shè)置90 s，3次平行檢測(cè)液體中粒徑大小。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)CD63和CD9兩種蛋白：選擇10%的分離膠和4%的濃縮膠制備聚丙烯酰胺凝膠電泳，裂解液裂解外泌體蛋白，另裂解細(xì)胞總蛋白做陽(yáng)性對(duì)照；將兩組樣品與4×Loading buffer混合，95 ℃煮樣15 min，冷卻后上樣，上樣量為30 μg，濃縮膠以電壓80 V電泳，進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為100 V，跑到底部即可停止；采用半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)膜，陽(yáng)極到陰極的放置順序?yàn)楹駷V紙、聚偏二氟乙烯膜、膠、厚濾紙，25 V轉(zhuǎn)膜15 min；轉(zhuǎn)膜后把膜放在5%的脫脂奶粉中室溫?fù)u床封閉3 h，取出膜置于1∶1 000的一抗稀釋液中4 ℃搖床過(guò)夜，5%脫脂奶粉搖床洗3次，每次10 min；置于1∶4 000的二抗稀釋液中室溫?fù)u床1 h，5%脫脂奶粉搖床洗5 min，PBS搖床洗2次，每次5 min；按說(shuō)明書(shū)配制發(fā)光底物，加入作用底物后用成像系統(tǒng)顯影。

1.2.6細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24 h后，胰酶消化并計(jì)數(shù)2×104個(gè)細(xì)胞接種于上室，實(shí)驗(yàn)組上室加入100 μL溶有外泌體的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組上室只加入100 μL DMEM培養(yǎng)基。下室均加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μL。兩組平行，分別培養(yǎng)24、48 h后，將上室取出，下室液體棄去，吉姆薩染液染色30 min后PBS沖洗干凈，觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，鏡下拍照，實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在24孔板中每孔接種1×104個(gè)肝癌細(xì)胞HepG2，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，棄上清液，用普通標(biāo)準(zhǔn)黃槍頭進(jìn)行劃痕，保持槍頭垂直，保證各孔劃痕基本一致；用PBS洗去脫落的細(xì)胞和漂浮在孔內(nèi)的細(xì)胞碎片；向各孔中加入DMEM培養(yǎng)基，第1孔加入100 μL PBS作為對(duì)照組，第2孔加入100 μL的外泌體懸液(0.5 mg/mL)作為實(shí)驗(yàn)組，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)；取時(shí)間點(diǎn)6、12 h觀察細(xì)胞分布狀態(tài)并進(jìn)行鏡下拍照；以劃痕面積占圖片面積的比例來(lái)計(jì)算細(xì)胞的增殖率，實(shí)驗(yàn)平行3次。

智能調(diào)度系統(tǒng)是提升電網(wǎng)安全、抵御風(fēng)險(xiǎn)的重要保障。充分利用信息通信技術(shù)、大數(shù)據(jù)分析決策技術(shù)，提升電網(wǎng)建模和分析技術(shù)，重點(diǎn)研發(fā)交直流大電網(wǎng)智能調(diào)度、經(jīng)濟(jì)運(yùn)行與安全防御技術(shù)。

1.2.4腫瘤細(xì)胞對(duì)自身外泌體的攝取 制備細(xì)胞爬片備用，將無(wú)菌清潔的小玻片(1 cm×1 cm)放于24孔板中，計(jì)數(shù)3×104個(gè)細(xì)胞接種至24孔板，培養(yǎng)細(xì)胞至貼壁。使用DiI染料按說(shuō)明書(shū)標(biāo)記外泌體[5]，使用PBS洗兩遍后，超高速離心濃縮外泌體，用DMEM培養(yǎng)基將沉淀重懸備用。第1孔加入100 μL PBS作為對(duì)照組，第2孔加入100 μL混有標(biāo)記好外泌體的DMEM培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組。為排除非特異性染色，將最后一遍清洗的PBS上清液取100 μL加入第3孔，培養(yǎng)箱孵育12 h后將24孔板取出，用熒光染核劑Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞核，用多聚甲醛避光固定細(xì)胞20 min，PBS洗兩遍。三乙烯二胺封片，倒置熒光顯微鏡觀察。

2.2HepG2對(duì)熒光標(biāo)記自身外泌體的攝取 倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片，并對(duì)圖片進(jìn)行融合，結(jié)果顯示紅色小顆粒熒光的外泌體進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)，圍繞于藍(lán)色大顆粒熒光的細(xì)胞核周圍或核上。收集了最后洗滌的PBS做平行實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)紅色小顆粒熒光信號(hào)，說(shuō)明沒(méi)有非特異性熒光染色。

2.3腫瘤自身外泌體對(duì)細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞面積占比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

經(jīng)過(guò)車牌定位之后，如果成功的話，我們會(huì)得到含有車牌的小范圍圖片。直接對(duì)其進(jìn)行分割處理，往往會(huì)出現(xiàn)分割失敗的情況。由于諸多不可抗的因素類似于車牌有磨損，車牌表面有泥點(diǎn)，由于光照因素，車牌表面會(huì)有反光現(xiàn)象以及最重要的一點(diǎn)，由于拍攝角度問(wèn)題，車牌會(huì)呈現(xiàn)平行四邊形或者車牌整體呈現(xiàn)一定的傾斜角度，導(dǎo)致分割時(shí)會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題[11-14]。當(dāng)然，車牌本身由于有分隔符以及鉚釘?shù)扔绊?，也?huì)出現(xiàn)分割不準(zhǔn)確的結(jié)果。如果不好好處理，將會(huì)影響下一步的識(shí)別正確率。因而，在分割之前需要對(duì)車牌進(jìn)行一定的預(yù)處理。

表1 基因引物序列及退火溫度

2 結(jié) 果

2.4腫瘤自身外泌體對(duì)細(xì)胞遷移的影響 鏡下拍照可見(jiàn)24 h和48 h的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)入到下室的細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：A為透射電鏡觀察，標(biāo)尺長(zhǎng)度100 nm；B為Western blot顯影圖。

1.2.7細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 將1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組每孔加入0.5 mg/mL的外泌體100 μL，對(duì)照組每孔加入PBS 100 μL，處理3 d后胰酶消化，1 500 r/min離心5min后加入預(yù)冷PBS洗滌2次；加入預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜；PBS洗滌1次；加入400 μL碘化丙啶試劑(50 μg/mL)，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，最后用100 μL PBS混勻，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)2×104個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.8引物設(shè)計(jì)、合成與熒光定量分析 選定細(xì)胞周期相關(guān)基因細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶調(diào)節(jié)亞基1(CKS1)，凋亡相關(guān)基因B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)進(jìn)行檢測(cè)[6-8]。提取0.5 mg/mL外泌體處理的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，沒(méi)有外泌體處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。提取兩組細(xì)胞的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，體系為20 μL，其中上下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.4 μL，去離子水8.8 μL，SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)。60～95 ℃繪制熔解曲線。內(nèi)參為β-actin，用2-ΔΔCt法對(duì)各基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。見(jiàn)表1。

2.1外泌體鑒定結(jié)果 透射電鏡拍照鏡下呈圓形中間凹陷的膜狀結(jié)構(gòu)，粒徑檢測(cè)結(jié)果顯示懸液中粒子大小均在30～100 nm，Western blot成像后顯示蛋白CD63和CD9均有條帶出現(xiàn)，結(jié)果表明外泌體已成功提取，見(jiàn)圖1。

2.5腫瘤自身外泌體對(duì)細(xì)胞周期的影響 對(duì)照組的G1、S、G2各期所占比例分別為51.59%，44.33%，2.46%，G2/G1比值為1.81；實(shí)驗(yàn)組的G1、S、G2各期所占比例分別為38.30%，43.99%，16.25%，G2/G1比值為1.79。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G1期明顯縮短(P<0.05)，S期持平，G2期明顯延長(zhǎng)，細(xì)胞分裂周期縮短。

注：A為劃痕6 h和12 h顯微鏡下視野，標(biāo)尺長(zhǎng)度250 μm；B為劃痕6 h和12 h后細(xì)胞增殖率，與同時(shí)間段對(duì)照組比較，aP<0.05，與實(shí)驗(yàn)組6 h比較，bP<0.05。

2.6腫瘤自身外泌體對(duì)細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平的影響 qPCR結(jié)果可見(jiàn)，基因Cyclin D、CKS1、Bax在腫瘤自身外泌體的作用下相對(duì)表達(dá)水平上升，而B(niǎo)cl-2相對(duì)表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A為細(xì)胞遷移后下室的細(xì)胞經(jīng)過(guò)吉姆薩染色后10倍鏡下視野；B為細(xì)胞遷移后下室的細(xì)胞計(jì)數(shù)情況，與同時(shí)間段對(duì)照組比較，aP<0.05，與對(duì)照組24 h比較，bP<0.05，與對(duì)照組48 h比較，cP<0.05。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05。

3 討 論

外泌體是細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌出來(lái)的一類包含蛋白成分、核酸成分的有膜囊泡狀結(jié)構(gòu)。它能夠作用于靶細(xì)胞，通過(guò)其內(nèi)容物來(lái)調(diào)控靶細(xì)胞的生理狀態(tài)。本研究對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的外泌體進(jìn)行了提取、鑒定，檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞對(duì)自身外泌體的攝取和吸收，還有其攝取外泌體后的腫瘤細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，筆者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞自身外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等細(xì)胞動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均有正向調(diào)控趨勢(shì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行了細(xì)胞周期的檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞G1期縮短，G2期延長(zhǎng)，說(shuō)明細(xì)胞分裂旺盛，周期正在縮短。對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控基因Cyclin D、CKS1和凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2進(jìn)行相對(duì)定量分析，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的CKS1、Cyclin D的相對(duì)表達(dá)水平都有所上升，所以外泌體很有可能是通過(guò)調(diào)控CKS1和Cyclin D等細(xì)胞周期調(diào)控基因的相對(duì)表達(dá)水平來(lái)促使細(xì)胞通過(guò)G1～S轉(zhuǎn)折期[6]，致使G1期縮短，G2期延長(zhǎng)從而縮短細(xì)胞周期，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。而凋亡調(diào)控基因Bax相對(duì)表達(dá)水平上升，由于基因之間復(fù)雜的關(guān)系，它會(huì)抑制Bcl-2的相對(duì)表達(dá)水平，導(dǎo)致Bcl-2的相對(duì)表達(dá)水平降低趨近于不轉(zhuǎn)錄[9]，所以實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡能力會(huì)降低從而促進(jìn)生長(zhǎng)。本研究表明，肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期縮短原因與周期調(diào)控類基因相對(duì)表達(dá)水平上升密切相關(guān)，凋亡基因間相互影響而使凋亡受抑制，故增殖能力與遷移能力旺盛。

腫瘤的病程進(jìn)展與微小RNA(miRNA)密切相關(guān)，其中與肝癌相關(guān)的miRNA-23、miRNA-139、miRNA-34a等均會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的周期和凋亡情況[10]。miRNA-23和miRNA-139作為肝癌細(xì)胞特有的小RNA極有可能被外泌體包裹，從而完成細(xì)胞間的信息傳遞，參與調(diào)控細(xì)胞的周期和凋亡[11]。在許多腫瘤細(xì)胞的外泌體中已經(jīng)檢測(cè)到miRNA-34a的存在，并且影響細(xì)胞的增殖能力[12]。這些miRNA極有可能以外泌體為載體靶向運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用。結(jié)合本研究分析，肝癌細(xì)胞外泌體對(duì)其自身來(lái)說(shuō)，起到一定促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。這種多基因的調(diào)控通?；ハ嘤绊憽⑹謴?fù)雜，需要進(jìn)一步確定這些基因?qū)τ谀[瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)作用，從而為疾病的治療提供更多的指導(dǎo)。

基層農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣部門在農(nóng)業(yè)的發(fā)展和農(nóng)村的建設(shè)中起著重要的作用，其承擔(dān)著制定當(dāng)?shù)胤N植業(yè)發(fā)展的規(guī)劃，以及相關(guān)農(nóng)業(yè)政策的開(kāi)展與宣傳工作。此外，農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣部門還組織和開(kāi)展進(jìn)行農(nóng)業(yè)技術(shù)的培訓(xùn)，尤其是承擔(dān)對(duì)新技術(shù)和新品種的推廣工作，還有進(jìn)行病蟲(chóng)害的防治等。為推動(dòng)農(nóng)村的發(fā)展和鄉(xiāng)村的振興奠定基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)多年的努力和發(fā)展，我國(guó)的基層農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作已經(jīng)取得了一定的成績(jī)，尤其是新技術(shù)和新品種的推廣更是促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的發(fā)展和農(nóng)民收入的增加。但是在進(jìn)行推廣的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題，為了適應(yīng)時(shí)代的發(fā)展必須對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行解決，實(shí)現(xiàn)推廣工作的優(yōu)化和創(chuàng)新。

綜上所述，腫瘤自身外泌體可以在體外通過(guò)調(diào)控Cyclin D和CKS1基因的相對(duì)表達(dá)水平，縮短腫瘤細(xì)胞周期，調(diào)控Bax、Bcl-2基因的相對(duì)表達(dá)水平抑制細(xì)胞凋亡，從而使腫瘤細(xì)胞增殖更快，遷移能力更強(qiáng)?？傮w來(lái)看，一定水平的腫瘤自身外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞自身的增殖和遷移能力有促進(jìn)作用，在以后的實(shí)驗(yàn)中還需要進(jìn)一步明確其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，從而為肝癌的臨床靶向治療提供參考。