許 馨，趙雪瑩，霍洪亮，于 楊，彭舉威，霍明昕

(1.東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，吉林 長春 130117；2.吉林建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，松遼流域水環(huán)境教育部重點實驗室，吉林 長春 130118；3.東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，吉林省城市污水處理與水質(zhì)保障科技創(chuàng)新中心，吉林 長春 130117)

喹啉(Quinoline)是一種含氮雜環(huán)芳香性有機化合物，因其含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)使喹啉較為穩(wěn)定，屬于難降解有機化合物.據(jù)報道，喹啉及其部分衍生物具有毒性、致癌性和誘變性[1-2].喹啉是冶金、化學(xué)助劑、染料、殺蟲劑、醫(yī)藥等領(lǐng)域的重要化工原料[3-4]，同時石油石化企業(yè)和煤炭工業(yè)生產(chǎn)中也會產(chǎn)生大量含有喹啉的廢水[5].由于喹啉的廣泛使用和不適當(dāng)?shù)呐欧牛瑢?dǎo)致其在水體、土壤中大量積累，危害環(huán)境和生物健康[6-7].

利用生物法去除環(huán)境中的喹啉及其衍生物是應(yīng)用最為廣泛的方式，由此喹啉降解菌的分離和鑒定也成為研究的熱點之一.目前已被分離出具有喹啉降解特性的菌株有假單胞菌(Pseudomonassp.)、皮氏伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapickettii)、紅球菌(Rhodococcussp.)、叢毛單胞菌(Comamonassp.)等[8-13].

睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)是一種嚴(yán)格需氧的革蘭氏陰性菌，不能利用糖類物質(zhì)生長，但能夠利用氨基酸、有機酸以及睪丸酮等類固醇化合物作為營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖[14-16].此外，睪丸酮叢毛單胞菌還能降解芳香族化合物[17].崔明超等[5，13，18]利用分離篩選出的睪丸酮叢毛單胞菌Q10降解喹啉及其衍生物，發(fā)現(xiàn)這種叢毛單胞菌對喹啉有較高的降解性能；Liu等[19]利用睪丸酮叢毛單胞菌bdq06處理染料廢水，通過生物強化完全去除了染料廢水中高濃度的喹啉、苯酚以及其他酚類物質(zhì).

目前，利用睪丸酮叢毛單胞菌對喹啉進行生物降解的研究主要停留在降解特征和代謝途徑方面，對喹啉降解相關(guān)基因表達的研究鮮有報道[20].為此，本文利用從污水處理廠活性污泥中分離出來的一株睪丸酮叢毛單胞菌(QYY)對喹啉進行了降解研究，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，從基因轉(zhuǎn)錄的水平上分析了喹啉生物降解時基因的差異表達情況，分析了參與降解過程的相關(guān)功能基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)變化，以為進一步揭示喹啉降解基因的研究奠定基礎(chǔ)，同時也為喹啉降解工程菌的構(gòu)建提供科學(xué)指導(dǎo)和有力依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株睪丸酮叢毛單胞菌(QYY)由本實驗室從某污水處理廠的活性污泥中分離純化所得，現(xiàn)保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.1.15223).

1.2 方法

1.2.1 喹啉降解

將QYY菌株接種到LB培養(yǎng)基(蛋白胨 10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L)中，30℃、120 r/min條件下富集培養(yǎng)12 h后，10 000 r/min離心2 min，收集菌體.將菌體懸浮于磷酸鹽緩沖溶液中，制成D(600)=0.5的菌懸液.取1 mL菌懸液接種到含有不同濃度(0，70，100，200，300，400 mg/L)喹啉的100 mL LB培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min 條件下進行降解實驗.在不同培養(yǎng)時間，測定喹啉剩余濃度和細菌生長情況.細菌生長的變化情況通過D(600)的數(shù)值確定，喹啉濃度變化用高效液相色譜進行測定.

1.2.2 基因組測序、組裝和注釋

菌株QYY基因組DNA提取后，根據(jù)Oxford Nanopore Technologies 公司提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進行樣品質(zhì)量檢測、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)量檢測和文庫測序等.基于Nanopore三代測序技術(shù)平臺進行基因組測序，下機后的原始數(shù)據(jù)經(jīng)進一步過濾接頭、低質(zhì)量及短片段(長度<2 000 bp)數(shù)據(jù)篩選后得到總數(shù)據(jù)集.利用Canu v1.5軟件對過濾后片段進行組裝后，通過Prodigal軟件對組裝后的基因組進行編碼基因預(yù)測.

1.2.3 睪丸酮叢毛單胞菌QYY降解喹啉的轉(zhuǎn)錄差異分析

根據(jù)對喹啉降解實驗數(shù)據(jù)的分析，選取喹啉質(zhì)量濃度為100 mg/L培養(yǎng)6 h(Q-100組)、喹啉質(zhì)量濃度為400 mg/L培養(yǎng)7 h(Q-400組)時的菌體，以及不含有喹啉的空白對照組培養(yǎng)7 h(C組)后的菌體進行轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?，每個樣品3個生物學(xué)重復(fù).收集樣品進行處理，包括總RNA的提取及質(zhì)量檢測、cDNA文庫構(gòu)建、通過Illumina HiSeq測序平臺對文庫進行測序.

基因定量表達分析和注釋：對Illmina HiSeq測序平臺測得的原始數(shù)據(jù)進行過濾后，使用Bowtie2軟件將過濾后的序列比對到參考基因組上.根據(jù)比對結(jié)果，采用FPKM(Fragments Per Kilo bases per Million fragments，每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數(shù)目)對表達量進行標(biāo)準(zhǔn)化，計算每個基因的表達量，一般認為FPKM值>1的基因是表達的.將比對好的基因分別與數(shù)據(jù)庫進行比對注釋.

差異表達基因篩選及功能富集分析：利用DESeq軟件對基因表達進行差異分析，篩選出滿足表達倍數(shù)差異log2|FC|>1(FC：差異變化倍數(shù)(fold change))且顯著性P<0.05的基因為差異表達基因.以整個基因組為背景，將差異表達基因與GO，KEGG數(shù)據(jù)庫進行序列比對(blast)，得到差異表達基因的功能注釋.

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸酮叢毛單胞菌QYY對喹啉的降解

菌株QYY對不同濃度喹啉的降解情況如圖1a所示，初始質(zhì)量濃度為70，100，200，300，400 mg/L的喹啉被完全降解分別需要6，8，9，11，13 h.在4 h時，菌株QYY對不同濃度喹啉的降解速率有明顯變化，含有70，100，200 mg/L喹啉的培養(yǎng)基中菌株QYY降解速率顯著較快，而質(zhì)量濃度為300，400 mg/L喹啉的培養(yǎng)基中降解出現(xiàn)滯后現(xiàn)象.圖1b表示的是不同喹啉濃度條件下菌株QYY的生長曲線，培養(yǎng)基中喹啉初始濃度越高，菌株QYY的生長越慢，這與圖1a中菌株QYY降解喹啉的情況相符合.隨著喹啉初始濃度的增加，菌株QYY的生長情況也變得遲緩，且均低于不含有喹啉的空白對照組.這是由于喹啉具有毒性，濃度越高、毒性越強，對菌株的生長抑制作用越加明顯.

圖1 睪丸酮叢毛單胞菌QYY對不同濃度喹啉的降解情況(a)和菌株在不同喹啉濃度下的生長速率(b)

2.2 睪丸酮叢毛單胞菌QYY全基因組概況

對菌株QYY進行全基因組測序，進一步了解菌株QYY基因的功能和信息.表1為睪丸酮叢毛單胞菌QYY的基因組基本信息.由表1可見，對序列進行拼接組裝后得到大小約為5.67 Mb的環(huán)狀染色體，GC含量為61.31%.預(yù)測到的編碼基因個數(shù)為5 145個，占基因組總長度的86.93%；預(yù)測到的編碼蛋白質(zhì)為5 098個.非編碼RNA共161個，其中rRNA有27個，tRNA有102個，其他的非編碼RNA有32個.同時，在基因組中注釋到8個有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列.假基因、基因島以及前噬菌體的數(shù)量分別為11，20，7個.

表1 睪丸酮叢毛單胞菌 QYY的基因組基本特征

2.3 睪丸酮叢毛單胞菌QYY降解喹啉的轉(zhuǎn)錄差異分析

2.3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)量質(zhì)控

基于菌株QYY全基因組結(jié)果，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究菌株QYY降解喹啉時相關(guān)基因的表達情況：選取喹啉質(zhì)量濃度為0(C)、100 mg/L(Q-100，降解6 h)和400 mg/L(Q-400，降解7 h)的菌株進行轉(zhuǎn)錄組測序，將測序得到的序列與參考基因組進行比對.數(shù)據(jù)質(zhì)量的基本情況如表2所示.由表2可知，各樣品過濾后讀長均占原始讀長的96%以上，Q20(堿基識別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占的百分比)、Q30(堿基識別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占的百分比)均能達到97%和92%，GC含量均能達到59%.這表明轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可進行后續(xù)分析.

表2 數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計

2.3.2 差異表達基因分析

將三組樣本按照C/Q-100，C/Q-400的分組進行比對，得到1 116和1 600個差異表達的基因(log2|FC|>1，P<0.05).C/Q-100中(見圖2a)，上調(diào)和下調(diào)基因分別為606，510個；C/Q-400中(見圖2b)，上調(diào)基因為915個，下調(diào)基因為685個.以對照組C為參考基準(zhǔn)時，Q-100和Q-400兩組共有的相同差異基因的數(shù)量為951個，Q-100組中特有的差異基因數(shù)量為165個，Q-400組中特有的差異基因數(shù)量為649個.這是由于加入的喹啉濃度不同，導(dǎo)致菌株QYY在相同底物生長條件下差異基因有所區(qū)別.

a：C/Q-100；b：C/Q-400

2.3.3 差異表達基因的KEGG富集分析

KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息，是一個綜合數(shù)據(jù)庫.C/Q-100和C/Q-400組中的1 116和1 600個差異表達基因分別匹配到104和110個KEGG途徑中，其中匹配到代謝(metabolism)途徑中的通路數(shù)量最多，分別有81和87個通路；在菌株QYY降解喹啉的生物過程中，ABC轉(zhuǎn)運蛋白作為膜轉(zhuǎn)運(membrane transport)中的重要部分，差異表達基因富集到其上的數(shù)目分別為61和79個.對C/Q-100和C/Q-400兩組差異表達基因中關(guān)于代謝途徑部分的上調(diào)表達的基因進行二級分類富集，結(jié)果見圖3.編碼與喹啉降解過程相關(guān)酶和ABC轉(zhuǎn)運蛋白的部分差異表達基因信息見表3.其中碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)過程均能產(chǎn)生能量，這些過程與能量代謝(energy metabolism)過程一同為菌株QYY降解喹啉、維持生長提供能量，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示相關(guān)基因顯著上調(diào)表達.在異生物素的生物降解與代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)與喹啉降解過程中相關(guān)的ligABC和bphB基因的差異表達.

(1) 與喹啉降解相關(guān)的差異基因.目前對喹啉降解途徑和降解基因的研究不多，并且只針對假單胞菌進行了深入研究.假單胞菌中的qorMSL、oxoOR基因是降解喹啉的關(guān)鍵基因，但這些基因在睪丸酮叢毛單胞菌中并不存在[21-23].對轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸代謝基因有明顯上調(diào)，原兒茶酸是細菌降解多種芳香族化合物途徑中最重要的中間體代謝產(chǎn)物，在多環(huán)芳烴的降解中發(fā)揮了重要作用.原兒茶酸通過ligAB基因編碼的原兒茶酸4，5-雙加氧酶(EC：1.13.11.8)轉(zhuǎn)化為4-羧基-2-羥基粘康酸酯-6-半醛，再通過與ligC基因編碼的2-羥基-4-羧基粘康酸酯半醛半縮醛脫氫酶(EC：1.1.1.312)、ligI基因編碼的2-吡喃酮4，6-二羧酸內(nèi)酯酶(EC：3.1.1.57)、ligJ基因編碼的4-草酰氨基甲酸水合酶(EC：4.2.1.83)以及l(fā)igK基因編碼的4-羥基-4-甲基-2-氧代戊二酸酯醛縮酶(EC：4.1.3.17)反應(yīng)，最后產(chǎn)生丙酮酸等物質(zhì)[24-27].本實驗中，ligABC基因在Q-100組中較對照組基因表達量上調(diào)(見表3)，但在Q-400組中該基因與對照組基因表達量相差較小，未達到差異表達的標(biāo)準(zhǔn)，但均有表達.其余參與原兒茶酸代謝酶的編碼基因也均有表達.菌株QYY能夠在降解喹啉的過程中產(chǎn)生原兒茶酸，但喹啉濃度從100 mg/L增大到400 mg/L時，會抑制菌株ligABC基因的表達.多環(huán)芳烴在雙加氧酶的作用下生成二氫二醇化合物，編碼二氫二醇脫氫酶(EC：1.3.1.56)的bphB基因可將二氫二醇化合物轉(zhuǎn)化為2，3-二羥基聯(lián)苯，進一步代謝[28].在Q-100和Q-400的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)bphB基因較對照組有明顯上調(diào)(見表3)，表明菌株QYY的bphB基因參與喹啉降解的部分過程.

圖3 Q-100和Q-400組中關(guān)于代謝途徑部分表達上調(diào)的差異基因KEGG二級分類富集

表3 菌株QYY轉(zhuǎn)錄組中部分與喹啉降解過程有關(guān)的差異表達基因

(2) 與能量代謝相關(guān)的差異基因.為了抵抗環(huán)境的不利影響，細菌需要更多的能量維持生長，并同時抵抗環(huán)境壓力[29-30].在Q-100和Q-400組中均發(fā)現(xiàn)屬于能量代謝的氧化磷酸化過程中NADH脫氫酶(EC：7.1.1.2)、琥珀酸脫氫酶(EC：1.3.5.1)、細胞色素c氧化酶(EC：1.9.3.1)以及F型ATP酶(EC：7.1.2.2)的基因表達顯著上調(diào)(見表3)，這些基因的上調(diào)表達可為菌株QYY降解喹啉以及對抗喹啉毒性提供更多的能量.同時，富集到碳水化合物代謝過程中的糖酵解途徑和TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶基因也有明顯上調(diào).氨基酸的分解代謝可以促進能量產(chǎn)生，例如氨基酸代謝中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝可產(chǎn)生用于ATP合成的NADH和FADH2[31].轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，菌株QYY中富集到丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等氨基酸代謝途徑中的差異基因表達顯著上調(diào)，這些基因的上調(diào)表達有助于維持菌株QYY的自身保護機制并對喹啉的降解代謝活動提供充分能量.

(3) 與ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)的差異基因.ABC轉(zhuǎn)運蛋白是已知的最大和最古老的蛋白質(zhì)家族之一，可以轉(zhuǎn)運無機鹽離子、糖、氨基酸和金屬離子[32].在Q-100和Q-400組中，硫酸鹽/硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因(cysP、cysU、cysA)顯著上調(diào)(見表3).由于硫是細胞輔助因子的一種成分，包括生物素、硫胺素、輔酶A、硫辛酸、谷胱甘肽和鐵硫簇，因此硫的增加能夠促進細胞的生命活動[33].這與注釋到的硫代謝過程的關(guān)鍵基因上調(diào)相符合.甜菜堿和脯氨酸是一種細胞調(diào)節(jié)滲透劑，能夠在細胞受到環(huán)境脅迫時改變其在細胞內(nèi)的含量，調(diào)節(jié)滲透平衡，從而保護細胞的結(jié)構(gòu)[34-36].在Q-100和Q-400組中均檢測到甜菜堿/脯氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因(proX、proW、proV)的表達上調(diào)(見表3)，證明喹啉的加入使菌株在吸收和降解代謝過程中細胞滲透壓發(fā)生改變，從而引起轉(zhuǎn)運蛋白的增加.同時根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組實驗條件下菌株QYY中脯氨酸代謝基因下調(diào)，這可能會造成脯氨酸在細胞內(nèi)的積累，以便更好地調(diào)節(jié)細胞滲透壓.支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白可以將包括亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運到細胞中，在轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中發(fā)現(xiàn)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的相關(guān)基因(livK、livH、livG、livM、livF)表達明顯下調(diào)(見表3)，不利于亮氨酸的攝取.這與結(jié)果中注釋到的亮氨酸代謝基因表達下調(diào)相關(guān).

3 結(jié)論

本研究利用全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對睪丸酮叢毛單胞菌QYY降解不同濃度喹啉時的差異表達基因進行了分析，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示：原兒茶酸作為多環(huán)芳烴降解途徑中的重要中間產(chǎn)物，編碼其降解的基因ligABC在Q-100組中表達上調(diào)明顯，但在Q-400組中表達上調(diào)不明顯；參與喹啉降解代謝過程中的bphB基因均上調(diào)表達.氧化磷酸化、糖酵解以及TCA循環(huán)中關(guān)鍵酶基因的上調(diào)保證了菌株QYY生長的能量供應(yīng).硫酸鹽/硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因以及甜菜堿/脯氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達顯著上調(diào)，以維持細胞生命活動和細胞結(jié)構(gòu).當(dāng)喹啉質(zhì)量濃度從100 mg/L增加到400 mg/L時，部分與喹啉降解相關(guān)的基因表達未出現(xiàn)差異的情況，具體原因還需要進行后續(xù)的研究.本研究從轉(zhuǎn)錄水平上分析了睪丸酮叢毛單胞菌QYY降解喹啉時與轉(zhuǎn)運和代謝途徑相關(guān)的基因的表達情況，為后續(xù)深入研究喹啉的生物代謝途徑及調(diào)控提供了有力依據(jù)和方向.