西南民族大學 四川 成都 610000

1 簡介

盡管蛋白組學出現(xiàn)于1990s[1],多肽組學隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,在2000s年代才初露頭角[2,3]。多肽組學是綜合分析細胞,組織或者器官中所有的多肽成分,在生物標志物、新藥研發(fā)等多個領(lǐng)域具有重要意義。水蛭已經(jīng)在全世界范圍應用于血栓,膿腫,骨關(guān)節(jié)炎,外科微整形等領(lǐng)域[4],活水蛭能夠吸食動物鮮血,因此研究人員從水蛭新鮮唾液腺中分離得到了一系列的抗血栓成分[5],例如Hementerin這種從H.lutzi中分離得到的由30個氨基酸組成的纖維蛋白原溶解物[6],從H.medicinalis中分離得到的具有血小板聚集抑制活性的calin[7]。從H.officinalis中分離得到的具有抑制膠原蛋白誘導的血小板聚集活性[8]。從Haementeria depressa中分離得到的lefaxin具有抑制FXa因子的作用[9]。以及具有減輕深靜脈血栓,肺栓塞和靜脈血栓的水蛭素。但是對于中藥水蛭干燥的全體活性成分報道較少,本文報道了中藥水蛭小分子多肽組學的初步研究。

2 材料與方法

2.1 粗提物的獲取 將50g中藥水蛭(亳門中藥飲片有限公司,中國)研成粉末,用0.4L純凈水在60℃下提取12h,重復一次并合并提取液,15344g/min×10min(BECKMAN COULTER JA-14,USA)離心,取上清液凍干保存。取凍干品分別配置成20mg/ml、40mg/ml和60mg/ml濃度測定抗血小板聚集活性。

2.2 陰離子交換層析 凍干品溶解于20mM的Tris-HCl(PH8.8)緩沖液中配置成8 mg/ml的濃度,經(jīng)10kDa超濾管(Millipore,USA)超濾,分子量低于10kDa的部分經(jīng)High Q陰離子交換柱(2.7×10.5cm,Richmond,USA)分離純化,線性洗脫梯度為0-0.6M NaCl,流速為6ml/min,并檢測280nm處紫外吸收峰值。

2.3 反相高效液相層析 離子交換層析獲得的所有組分再經(jīng)過Bio-Rad(Richmond,USA)系統(tǒng),漢邦Hedera ODS-2(20×250mm)反相柱獲得純度高于99%的小分子多肽組分。該系統(tǒng)用20%乙腈平衡,再用0-70%B相(95%乙腈,0.1%TFA)梯度洗脫50min,最后再用70%B相等度洗脫,流速為6ml/min并檢測214nm處的紫外吸收值。

2.4 體外抗血小板聚集實驗 全血來自志愿者捐贈,經(jīng)168g×5min離心后獲得富血小板血漿(PRP),再經(jīng)711g×5min離心后獲得貧血小板血漿(PPP),體外抗血小板聚集實驗按照文獻報道進行[10]。誘導劑分別為凝血酶(Thr)(0.26U,Sigma)和ADP(2μM,Sigma)。

3 結(jié)果

3.1 陰離子交換層析及抗血小板聚集活性 小于10kDa的粗提物經(jīng)過離子交換層析共獲得了6個組分(圖1.a),抗血小板聚集活性檢測實驗表明,Ft,P1,P2和P3抑制凝血酶誘導的血小板聚集活性很好,而P1,P2,P3和P5抑制ADP誘導的血小板聚集更好(圖1.b)。綜上,P2同時對凝血酶和ADP誘導的血小板聚集抑制活性表現(xiàn)最好。

3.2 高效液相色譜及抗血小板聚集活性 離子交換組分經(jīng)高效液相分離純化共獲得25個高純度小分子多肽(圖1.c),其中Ft1-Ft10組分(圖1.d)來自離子交換層析Ft組分,P1.1-P1.2組分(圖1.e)來自離子交換層析組分P1,以下同理。僅P3在進一步分離中因紫外吸收峰值過低未做收集。在ADP誘導的血小板聚集活性中組分P1.1和P2.4的抑制活性最好(圖1.h),而在凝血酶誘導的血小板聚集活性中,組分P2.2,P2.4,P5.2表現(xiàn)的抑制活性更好(圖1.I)。

圖1 .分子量小于10kDa部分粗提物經(jīng)離子交換層析獲得包括穿透峰在內(nèi)的6個組分Ft和P1-P5(a),離子交換所有組分抗血小板聚集活性顯示,P2同時對ADP和Thr誘導的血小板聚集有較強的抑制活性(b),經(jīng)過高效液相分析共得到25個組分(c-g),其中Ft組分經(jīng)過高效液相再次分離得到Ft1-Ft10(c),P1組分經(jīng)過高效液相再次分離得到P1.1-P1.2(d),P2組分經(jīng)過高效液相再次分離得到P2.1-P2.6(e),P4組分經(jīng)過高效液相再次分離得到P4.1-P4.3(f),P5組分經(jīng)過高效液相再次分離得到P5.1-P5.4(g),所有25個組分抗血小板聚集活性顯示,組分P1.1和P2.4對ADP誘導的血小板聚集抑制率較好(h),組分P2.2,P2.4和P5.2對ADP誘導的血小板聚集抑制率較好(I),綜上可見組分P2.4同時具有最好的抗血小板聚集活性。

4 討論

凝血酶誘導的血小板聚集主要通過兩中絲氨酸拮抗受體PAR1和PAR4,它們能激活人血小板的Gq蛋白,進而激活下游信號通路誘導血小板的聚集[11],ADP誘導的血小板聚集主要通過P2Y1,P2Y12和P2X1介導[12],其中P2Y1信號通路也通過激活Gq蛋白啟動下游信號通路,引起血小板聚集[13]。因此推測活性最突出的P2.4可能是通過激包括Gq蛋白在內(nèi)的下游信號通路達到良好的抗血小板聚集效果。所有組分的純度及質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析將在后續(xù)報道中體現(xiàn)。

致謝

作者感謝中國藥科大學孔毅副教授給本研究提供支持。