谷 瑤，曾永明，陳松武，楊 漓，周麗珠

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002）

核桃（Juglans sigillataL.），屬胡桃科（Juglandaceae） 植物，最初產(chǎn)于西亞、歐洲的東部和南部[1-3]。核桃仁含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，每100 g 含蛋白質(zhì)15～20 g，是一種公認(rèn)的高蛋白的食品，有“長壽果”“養(yǎng)生之寶”的美譽(yù)。同時(shí)，也含有人體必需的鈣、磷、鐵等多種微量元素和礦物質(zhì)，以及胡蘿卜素、核黃素等多種維生素，對(duì)人體有益，是深受老百姓喜愛的堅(jiān)果類食品之一[4]。核桃仁中可溶性蛋白的組成以谷氨酸為主，其次為精氨酸和天冬氨酸[1]。

食品中蛋白質(zhì)的測定方法有兩類：直接法和間接法[5]。杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法是使用最廣泛的間接法[6-7]，而近紅外光譜法、紫外分光光度法、電泳法、紫外吸收光譜法和Bradford 法是常見的直接法[5]。凱氏定氮法靈因敏度高、穩(wěn)定性好、成本低廉，是目前進(jìn)行氮含量測定常見的方法，也是國內(nèi)外法定的檢測方法[8]。目前，大量文獻(xiàn)報(bào)道了凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)，但針對(duì)特定食品蛋白質(zhì)的研究僅限于大豆、小麥、乳制品和大米[9-15]。由于食品基質(zhì)復(fù)雜，普適性方法需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和改進(jìn)，有必要針對(duì)性地建立核桃蛋白質(zhì)檢測方法，在最短的時(shí)間內(nèi)得到更精準(zhǔn)的結(jié)果。試驗(yàn)參照《GB 5009.5—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定核桃仁中蛋白質(zhì)含量[16]，通過進(jìn)行方法優(yōu)化，得到精準(zhǔn)的含量值，為核桃蛋白質(zhì)快速、準(zhǔn)確測定提供了科學(xué)參考。

方法原理：蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。核桃與硫酸和催化劑一同加熱消解，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。其反應(yīng)式如下：

1 材料與方法

1.1 試劑

硫酸銅（CuSO4·5H2O）、硫酸鉀（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、硼酸（H3BO3）、甲基紅指示劑（C15H15N3O2）、溴甲酚綠指示劑（C21H14Br4O5S）、氫氧化鈉（NaOH）、95%乙醇（C2H5OH）、鹽酸（HCl）、無水碳酸鈉（Na2CO3） 基準(zhǔn)試劑、硫酸銨（(NH4)2SO4） 標(biāo)準(zhǔn)品，除非另有說明，所用試劑均為分析純，水為三級(jí)水。

試驗(yàn)原料：核桃，廣西鳳山縣核桃專業(yè)合作社提供。

1.2 試劑配制

（1）硼酸溶液（20 g/L）。稱取20 g 硼酸，加水溶解后并稀釋至1 000 mL。

（2）氫氧化鈉溶液（30%）。稱取300 g 氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至1 000 mL。

（3）鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[C(HCl)]0.1 moL/L。量取9 mL 分析純濃鹽酸（HCl）于1 000 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，搖勻；稱取于270～300 ℃高溫爐中灼燒至恒質(zhì)量的工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉0.2 g（精確到0.000 1 g）溶于50 mL 水中，加10 滴溴甲酚綠- 甲基紅指示液，用配制的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸2 min，加蓋具鈉石灰管的橡膠塞，冷卻，繼續(xù)滴定至溶液再呈暗紅色；同時(shí)做空白試驗(yàn)，準(zhǔn)確計(jì)算鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度[C（HCl）]。

（4）甲基紅乙醇溶液（1 g/L）。稱取0.1 g 甲基紅溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

（5）溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）。稱取0.1 g 溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

（6）混合指示液。1 份甲基紅乙醇溶液與3 份溴甲酚綠乙醇溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

（7）吸收液。溶液（1） 和（6）混合均勻而成。

1.3 儀器和設(shè)備

ME204/02 型分析天平（感量為1 mg），梅特勒- 托利多儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；K12A 型全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司產(chǎn)品；SH230N 型石墨爐消解儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DFT-200C 型超高速粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)步驟

1.4.1 制樣

將經(jīng)60 ℃烘干的核桃去殼，核桃含油量大，打碎混勻呈泥狀，采取減量法稱質(zhì)量。

1.4.2 消解

核桃消解條件：稱取核桃樣品0.5 g（精確至0.000 1 g）于干燥消解管內(nèi)，依次加入5 g 硫酸鉀，0.5 g 硫酸銅，10 mL 濃硫酸，將消解爐設(shè)置為一階段220 ℃20 min，二階段440 ℃75 min（消解爐可提前預(yù)熱至220 ℃），放入樣品，打開尾氣回收，待時(shí)間結(jié)束，可觀察樣品，與試劑空白一樣呈澄清，有淡綠色即為消解完全，靜置冷卻。

1.4.3 蒸餾

檢查并補(bǔ)充蒸餾水桶、堿液桶、硼酸桶、標(biāo)液瓶內(nèi)試劑；打開電源開關(guān)，同時(shí)打開自來水閥；在“維護(hù)”欄“初始化滴定器”1 次，“清洗滴定缸”3次；開機(jī)時(shí)，手動(dòng)先排空酸、堿管氣體（點(diǎn)擊“維護(hù)”再點(diǎn)擊“酸泵”“堿泵”），并置換標(biāo)液（點(diǎn)擊“初始化滴定器”3 次），點(diǎn)擊“清洗滴定缸”3 次；點(diǎn)擊“參數(shù)設(shè)置”輸入“標(biāo)液濃度”“換算系數(shù)”數(shù)值；安裝一空消化管，關(guān)閉安全門，點(diǎn)擊“測試”，點(diǎn)擊“工作模式”選擇“空白測試”，設(shè)置堿液量10 mL，吸收液量30 mL，點(diǎn)擊“運(yùn)行”空蒸，當(dāng)連續(xù)2 次空白值相差不大于0.1 mL，取后1 次空白值為儀器空白（消解樣空白此時(shí)可測），然后把空白值輸入“維護(hù)”中“參數(shù)設(shè)置”輸入“空白”數(shù)據(jù)；測定前應(yīng)先用(NH4)2SO4標(biāo)準(zhǔn)品做氮回收率的測定，借以驗(yàn)證所用儀器、試劑及操作等條件的可靠性；要求(NH4)2SO4標(biāo)準(zhǔn)品氮回收率為95%～105%；點(diǎn)擊“測試”依次輸入“樣品量”“吸收液量”（30 mL） “堿液量（60 mL）”，然后安裝樣品，點(diǎn)擊“運(yùn)行”。工作完成后，點(diǎn)擊“數(shù)據(jù)”尋找對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)，點(diǎn)擊編號(hào)調(diào)出測試結(jié)果，并記錄；全部測試結(jié)束，點(diǎn)擊“維護(hù)”“清洗滴定缸”，關(guān)閉電源、水源。

2 結(jié)果與分析

核桃樣品中蛋白質(zhì)的含量按以下公式計(jì)算：

式中：X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；

V1——試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；

V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；

C——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；

0.014 0——鹽酸[C(HCl)=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；

m——試樣的質(zhì)量，g；

V3——吸取消化液的體積，mL；

F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，核桃中氮轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.30；

100——換算系數(shù)。

核桃樣品中的蛋白質(zhì)含量見表1。

表1 核桃樣品中的蛋白質(zhì)含量

3 結(jié)論

（1） 核桃含蛋白與脂肪偏高，一階段消解產(chǎn)生碳化會(huì)在消解管內(nèi)鼓泡，但只要不超過整體消解管1/3 高度；在二階段時(shí)，會(huì)有硫酸回流將管壁上的樣品沖回，若炭化情況劇烈，可考慮適當(dāng)降低一階段溫度、延長時(shí)間使反應(yīng)緩和。

（2） 采用K12A 全自動(dòng)凱氏定氮儀測定核桃中蛋白質(zhì)的含量平均為15.826 6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.302 0% （n=6），該方法具有準(zhǔn)確、快速、簡便、低耗和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，是核桃中蛋白質(zhì)含量測定的首選方法。