姜鐵民，劉 斌，劉彥品，黃訓(xùn)文，李 貞，李建濤，陳歷俊*

（1 桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院 廣西桂林541004 2 北京三元食品股份有限公司 北京市乳品工程技術(shù)研究中心 北京100163）

人體腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的高度多樣化生態(tài)系統(tǒng)，據(jù)估計(jì)由1014個(gè)細(xì)菌組成，健康個(gè)體的腸道微生物群落以放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和疣細(xì)菌門5 個(gè)細(xì)菌門為主[1]。近來(lái)許多研究揭示了腸道微生物對(duì)人體健康的重要作用，參與人體的正常生長(zhǎng)發(fā)育、免疫、代謝、疾病等各方面，肥胖、糖尿病、肝臟疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等許多疾病與腸道微生物密切相關(guān)，人體腸道微生物被視為多種疾病的潛在新型療法[1-4]。而飲食是影響人類腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵因素，且飲食營(yíng)養(yǎng)成分的變化能迅速改變腸道菌群組成，使飲食干預(yù)成為預(yù)防或治療各種醫(yī)學(xué)病癥的方法之一[5-7]。酸奶作為歷史悠久的發(fā)酵乳制品，越來(lái)越多研究表明酸奶對(duì)人體健康的作用，如維持健康的腸道微生物群，預(yù)防各種胃腸道疾病，降低肥胖、代謝綜合征、心血管疾病、腫瘤等慢性疾病發(fā)病率，然而，目前益生菌及其發(fā)酵產(chǎn)品的健康功效仍存在爭(zhēng)議，可能與觀察指標(biāo)、益生菌菌株及配方、干預(yù)時(shí)間等有關(guān)[8-13]，探索酸奶的健康效應(yīng)及其需要解決的研究缺口，成為食品界重要的研究?jī)?nèi)容。燒酸奶是一種生牛乳經(jīng)高溫美拉德褐變反應(yīng)，后乳酸菌發(fā)酵的酸奶，具有與傳統(tǒng)酸奶不同的加工工藝，推測(cè)可能產(chǎn)生不同于傳統(tǒng)酸奶的改變腸道菌群的效果。為此，本研究通過(guò)隨機(jī)、開放試驗(yàn)，追蹤觀察了燒酸奶及其不同干預(yù)方式下健康人群腸道菌群的變化情況，為評(píng)價(jià)不同加工工藝和配方酸奶對(duì)人體的健康作用提供依據(jù)，同時(shí)為科學(xué)飲用酸奶提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究人群與干預(yù)方式

采用隨機(jī)、開放研究方法，按“知情同意、自愿參加” 原則，2015年10月～11月在北京市招募到年齡20～55 歲，1 個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)抗生素的健康志愿者40 人，簽署知情同意書后，按性別、年齡隨機(jī)納入NS，TS 組進(jìn)行燒酸奶干預(yù)，早晚各200 mL，連續(xù)4～10 周。其中，NS 組直接飲用燒酸奶，TS 組經(jīng)過(guò)2 周準(zhǔn)備期（不食用任何益生菌、益生元產(chǎn)品）后飲用燒酸奶，且10 人接受2 周洗脫再次干預(yù)2 周。整個(gè)研究期間，要求參與者保持平常的生活方式和飲食，但不得使用任何其它酸奶或含益生菌的食物，并定期進(jìn)行72 h 膳食回顧調(diào)查和糞便樣本采集。本研究經(jīng)洛陽(yáng)北方企業(yè)集團(tuán)有限公司職工醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 糞便樣本采集與腸道菌群16S rRNA 基因測(cè)序

NS 組人群分別在干預(yù)前（基線）、干預(yù)4 周、干預(yù)后2 周共3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集糞便樣本，TS 組于干預(yù)前（基線）、準(zhǔn)備期2 周、第1 次干預(yù)4 周、洗脫期2 周、第2 次干預(yù)2 周共5 個(gè)點(diǎn)采集糞便樣本，采集量約5 g，放入帶有保護(hù)液的PSP 管中（Stratec，德國(guó)），-80 ℃保存，用于腸道微生物基因分析。

根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明，使用QIAamp 快速糞便DNA Mini 試劑盒 （Qiagen，GmbH，Hilden，德國(guó)），從100 mg 糞便樣品中提取基因組DNA。然后以10 ng DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增V3-V4 區(qū)域 的16S rRNA 基因，30 μL 總反應(yīng)體系為：15 μL 高保真PCR 反應(yīng)混合液 （New England Biolabs），0.2 μmol/L 正向和反向引物 （314F-805R）。PCR 條件包括95 ℃，3 min；25 次循環(huán)：95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s。根據(jù)操作說(shuō)明，使用NEB Ultra DNA 文庫(kù)制備試劑盒（NEB，美國(guó)）生成測(cè)序文庫(kù)，擴(kuò)增子采用Illumina PE 2×250 bp HiSeq 2500 平臺(tái)（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

腸道細(xì)菌測(cè)序結(jié)果使用QIIME 1.9.0[14]合并、質(zhì)量篩選和demultiplex 原始下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)。序列進(jìn)行聚類，并將具有97%的相似性的序列歸為操作分類單元（OTU），然后將OTU 序列根據(jù)Greengenes 16S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Version 13.5）進(jìn)行物種注釋，分類為從門到屬的級(jí)別。下游數(shù)據(jù)使用Calypso 8.84 平臺(tái)分別進(jìn)行TSS 和CSS 方法歸一化后，采用Rank test，Kruskall-Wallis 檢驗(yàn)（非參數(shù)）進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析，以FDR（False Discovery Rate）或BH（Benjamini-CHochberg）校正后的P 值確定差異顯著性，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著性差異，微生物菌屬的含量以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 研究對(duì)象及飲食基本情況

根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)，招募符合要求的40 人進(jìn)入試驗(yàn)，按性別比例隨機(jī)分成2 組：NS 組直接干預(yù)4周；TS 組經(jīng)10 d 清空期后干預(yù)4 周，洗脫15 d 再干預(yù)2 周。最終全部完成不同周期干預(yù)的志愿者為35 人（73%），分別為NS 組17 人、TS 組18 人，除谷類、薯類主食外，兩組成員在性別、年齡和膳食攝入量方面不存在顯著差異（表1）。

表1 完成跟蹤觀察的人群組成及其每日飲食情況Table 1 The volunteers and their daily dietary intake who completed the follow-up study

2.2 干預(yù)對(duì)腸道菌群多樣性的影響

人體腸道菌群隨著膳食營(yíng)養(yǎng)、飲食習(xí)慣、激素分泌水平及抗生素使用等因素不斷變化，飲食結(jié)構(gòu)與習(xí)慣不同可影響腸道微生物群的構(gòu)成，進(jìn)而改變機(jī)體能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，間接參與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[2-3，15]。本研究在日常飲食結(jié)構(gòu)基本相同的情況下，觀察了燒酸奶攝入及攝入方式對(duì)健康成人腸道菌群多樣性的影響。α-多樣性分析表明，兩組研究人群入組時(shí)的腸道菌群結(jié)構(gòu)類似（ANOVA P＞0.05），經(jīng)過(guò)4～6 周酸奶干預(yù)，腸道微生物豐富度指標(biāo)Chao1，ACE，Richness 指數(shù)顯著升高，且TS 組樣本顯著高于NS 組（ANOVA P＜0.05，圖1a，b），表明干預(yù)后，尤其是TS 組腸道微生物物種種類增加。腸道微生物群落結(jié)構(gòu)β-多樣性PCoA（基于Bray-Curtis 距離）分析結(jié)果顯示2 組腸道菌群整體結(jié)構(gòu)在干預(yù)前后和組間均無(wú)顯著性差異（圖1c，d）。

2.3 干預(yù)對(duì)優(yōu)勢(shì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

不同時(shí)間糞便樣本的菌群構(gòu)成分析顯示，健康成人腸道微生物主要檢測(cè)到9 個(gè)菌門、70 個(gè)菌屬。其中，厚壁菌門（Firmicutes，35.2%～58.4%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，30.0%～54.3%）、變形桿菌門（Proteobacteria，3.1%～8.1%）為主要優(yōu)勢(shì)菌門，占腸道微生物群總相對(duì)豐度的95%（見圖2）；在屬水平分類上，平均相對(duì)豐度在5%以上的有擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、未分類瘤胃球菌科（unclassed.Ruminococcaceae）、未分類梭菌目（Unclassified.Clostridiales）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、糞桿菌屬（Faecalibacterium），與報(bào)道的健康人體腸道優(yōu)勢(shì)菌群一致[16-18]，且存在所有觀察點(diǎn)樣本中（見表2）。但擬桿菌門及其普雷沃氏菌屬（14.5%）、瘤胃球菌屬（5.75%）、雙歧桿菌屬 （Bifidobacterium，0.85%）、Akk 菌屬（Akkermansia，2.4%）等主要優(yōu)勢(shì)菌和益生菌相對(duì)豐度不同于Nishijima 等[19]分析的中國(guó)人腸道菌群結(jié)果，乳桿菌屬（Lactobacillus，0.2%）、糞桿菌屬（5.09%）與其結(jié)果接近。

圖2 燒酸奶干預(yù)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of burned yogurt intervention on the structure of intestinal microbiota

相較于干預(yù)前，燒酸奶攝入4 周可降低變形菌門、放線菌門豐度（Actinobacteria），促進(jìn)擬桿菌門富集，且停用2 周（洗脫期）內(nèi)具有持續(xù)效果，而再次干預(yù)2 周則降低擬桿菌門豐度，同時(shí)促進(jìn)變形桿菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）富集（圖2），但干預(yù)后所有優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度與基線比較均沒有顯著差異。在屬水平上，燒酸奶可降低普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）等優(yōu)勢(shì)菌豐度，促進(jìn)糞桿菌屬、Akk 菌屬、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、未分類梭菌目、巨單胞菌屬（Megamonas）富集，但主要與干預(yù)方式有關(guān)（表2）。對(duì)于雙歧桿菌和乳桿菌益生菌，干預(yù)期呈下降趨勢(shì)，其中雙歧桿菌干預(yù)4周末豐度為干預(yù)前的1/3（0.5%），但隨著再次干預(yù)上升到0.72%，與Burton 等[11]報(bào)道的酸奶干預(yù)效果相似。與基線比較，NS 和TS 組干預(yù)終點(diǎn)樣本中的未分類梭菌目、考拉桿菌屬、巨單胞菌屬、AKK菌屬相對(duì)豐度存在顯著差異，但FDR 調(diào)整后無(wú)顯著差異，說(shuō)明長(zhǎng)期飲食習(xí)慣在塑造腸道菌群結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。值得注意的是，鏈球菌屬（Streptococcus）豐度在再次干預(yù)2 周時(shí)非顯著性高于基線值，但分析所有階段間差異菌群時(shí)發(fā)現(xiàn)，鏈球菌屬是唯一存在顯著性差異的腸道菌群（BH調(diào)整后P=0.009），于干預(yù)期第21 天達(dá)到最大值3.41%，推測(cè)與燒酸奶發(fā)酵生產(chǎn)用唯一菌種嗜熱鏈球菌有關(guān)。

表2 健康人群燒酸奶干預(yù)前、后優(yōu)勢(shì)腸道菌群豐度aTable 2 Changes of intestinal microbiota after burned yogurt intervention in healthy adultsa

（續(xù)表2）

2.4 干預(yù)方式對(duì)優(yōu)勢(shì)腸道菌結(jié)構(gòu)的影響

利用稀疏偏最小二乘-判別法（sparse partial leat square-discriminant analysis，sPLS-DA）分析了2 種干預(yù)方式（TS 和NS）人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果顯示2 組無(wú)顯著性差異（見圖3a）。采用線性判別分析效應(yīng)量法[linear discriminant analysis （LDA）effect size method （LEfSe）]分析了前30 種優(yōu)勢(shì)菌屬在NS 與TS 組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的微生物，發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬、雙歧桿菌屬、布勞特氏菌屬、薩特氏菌屬及未分類理研菌科、梭菌目等在TS 組占顯著優(yōu)勢(shì)，普雷沃氏菌屬、厚壁菌門的考拉桿菌屬、梭桿菌屬（Fusobacterium）為NS 組的顯著優(yōu)勢(shì)菌（圖3b）。

圖3 不同干擾方式對(duì)優(yōu)勢(shì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of different interference modes on the structure of dominant microbiota

ALDEX2 差異分析表明，擬桿菌門（Pa＜0.001）及其普雷沃氏菌（Pa＜0.001）、厚壁菌門的考拉桿菌屬（Pa＜0.001）、瘤胃球菌屬（Pa=0.008）、糞桿菌屬（Pa=0.032）及放線菌門（Pa＜0.001）與雙歧桿菌屬（Pa＜0.001）、梭桿菌門（Pa＜0.001）與梭菌屬（Pa=0.002）存在顯著差異（見表3）。其中，普雷沃氏菌屬、考拉桿菌屬、糞桿菌屬、梭菌屬豐度在NS 組顯著高于TS 組，瘤胃球菌屬、雙歧桿菌屬顯著低于TS 組，說(shuō)明干預(yù)方式可顯著影響腸道菌群組成，尤其是厚壁菌門菌屬種類。此外，AKK 菌屬和乳桿菌屬在2 組樣本中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，TS 組豐度高于NS 組。

表3 NS 與TS 組優(yōu)勢(shì)菌的差異分析aTable 3 Difference analysis of dominant microbiota between NS and TS groupa

3 討論

宏基因組測(cè)序技術(shù)已發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門和厚壁菌門是人類腸道的核心微生物群，變形桿菌門、放線菌門和疣微菌門豐度較低[16]，但人類腸道微生物群呈現(xiàn)高度動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)，受抗生素、年齡、宿主遺傳、飲食模式和其它環(huán)境暴露因素的影響[20-23]。其中飲食是重塑腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能最為重要也是最為迅速的因素，但確切改變時(shí)間和程度與食物種類、干預(yù)時(shí)間、個(gè)體差異相關(guān)，如補(bǔ)充膳食纖維情況下，有的個(gè)體1 d 就觀察到腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，有的12 周后也沒有影響，且停止食用后可恢復(fù)[6]，只有長(zhǎng)期的飲食習(xí)慣才能引起腸道菌群組成的重大變化[1，7]。本研究中受試者準(zhǔn)備期、干預(yù)期、洗脫期各階段腸道菌群腸的變化充分說(shuō)明了飲食結(jié)構(gòu)或習(xí)慣短期內(nèi)對(duì)腸道菌群的影響（結(jié)果未示），而干預(yù)前后結(jié)果顯示，布朗旎燒酸奶干預(yù)4～6 周腸道微生物結(jié)構(gòu)多樣性顯著高于干預(yù)前（特別是TS 組，P＜0.05，圖1），厚壁菌門（未分類梭菌目、糞桿菌屬、鏈球菌屬）、擬桿菌門（擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬）、變形菌門（嗜血桿菌屬）、放線菌門（雙歧桿菌屬）、疣微菌門（Akk 菌屬）等主要優(yōu)勢(shì)微生物（相對(duì)豐度＞1%）含量發(fā)生了不同程度的變化，其中未分類梭菌目、考拉桿菌屬、巨單胞菌屬、AKK 菌屬相對(duì)豐度在干預(yù)終點(diǎn)與干預(yù)前樣本中存在顯著差異（Rank test），鏈球菌屬在各觀察時(shí)間段之間具有顯著差異（ALDEX2），說(shuō)明燒酸奶在增加健康人群腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性基礎(chǔ)上，對(duì)個(gè)體優(yōu)勢(shì)腸道菌群相對(duì)含量的調(diào)節(jié)效果在所選擇的觀察點(diǎn)有限，但不排除燒酸奶攝入所導(dǎo)致的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化迅速，進(jìn)而通過(guò)改變腸道內(nèi)環(huán)境或代謝調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[18，24]。

SCFAs 是腸道微生物群的主要代謝產(chǎn)物，對(duì)維持腸道正常內(nèi)環(huán)境、功能和機(jī)體健康具有重要作用，其中丁酸是維持腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子[18]。發(fā)酵奶干預(yù)研究顯示，健康成年人在酸奶干預(yù)后腸道微生物群發(fā)生了變化，主要包括韋榮球菌屬、羅氏菌屬、糞桿菌屬、毛螺菌屬、糞球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬等重要產(chǎn)丁酸細(xì)菌豐度的增加，以及擬桿菌屬、嗜膽菌屬（Bilophila）等機(jī)會(huì)致病菌的降低，從而有利于人體健康[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)燒酸奶具有對(duì)健康成人腸道菌群不完全一致的干預(yù)效果，如糞桿菌屬、毛螺菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、擬桿菌屬變化趨勢(shì)與報(bào)道類似，但糞球菌屬、羅氏菌屬、韋榮球菌屬呈降低趨勢(shì)，且與干預(yù)方式密切相關(guān)（表2、表3）。此外，燒酸奶干預(yù)還能促進(jìn)Akk菌屬、嗜血桿菌屬、未分類的梭菌目、巨單胞菌屬富集，降低普雷沃氏菌屬、考拉桿菌屬等優(yōu)勢(shì)菌豐度（表2），但除鏈球菌屬外均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而對(duì)于雙歧桿菌，有報(bào)道顯示健康人攝入含益生菌酸奶可顯著增加糞便中雙歧桿菌含量，且與性別及最初糞便中含量相關(guān)[8，25]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，健康成年人腸道菌群的變化與酸奶干預(yù)后益生菌的攝入沒有關(guān)聯(lián)，甚至導(dǎo)致雙歧桿菌水平的下降，說(shuō)明酸奶中其它成分可能也是導(dǎo)致特定微生物變化的原因[11，26]。本研究中雙歧桿菌水平干預(yù)降低，其中干預(yù)4 周末豐度為干預(yù)前的1/3（0.5%），隨著再次干預(yù)上升到0.72%。健康成人腸道菌群對(duì)燒酸奶這種差異反應(yīng)可能與燒酸奶所采用的單一發(fā)酵劑、特殊生產(chǎn)工藝所導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)與活性組分不同有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究采用短期小樣本干預(yù)試驗(yàn)和16S 基因組學(xué)技術(shù)，獲得了性別、年齡、種族、飲食結(jié)構(gòu)基本相似的健康成人的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征，其中厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌門，占腸道微生物群總相對(duì)豐度的95%；擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、未分類的瘤胃球菌科、未分類的梭菌目、瘤胃球菌屬、柔嫩梭菌屬為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。同時(shí)證實(shí)飲食結(jié)構(gòu)能調(diào)節(jié)健康成人腸道微生物組成，燒酸奶攝入可顯著增加腸道菌群種類多樣性和鏈球菌相對(duì)豐度，且食用習(xí)慣（干預(yù)方式）對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)影響更顯著，食用時(shí)間越長(zhǎng)越有助于保持雙歧桿菌、Akk 菌、鏈球菌等有益菌的含量。由于日常飲食動(dòng)態(tài)變化和機(jī)體自身調(diào)節(jié)作用，健康人群營(yíng)養(yǎng)干預(yù)更難得到準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果，需采用系統(tǒng)流行病學(xué)方法，結(jié)合基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，綜合研究健康人群的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)效果，為改善健康和制定個(gè)性化的精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)方案提供依據(jù)[27]。此外，健康成人腸道微生物組對(duì)布朗旎燒酸奶反應(yīng)變化不同于以往報(bào)道的酸奶（含和不含益生菌）干預(yù)結(jié)果，造成這種差異的原因與機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。