許 女，郭宏萍，楊 光，陳旭峰，張 茹，王如福*

（1 山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 山西太谷030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學實驗教學中心 山西太谷030801）

目前，全球的糖尿病發(fā)病率和糖尿病患者總數(shù)都呈逐年增加的趨勢，我國的Ⅱ型糖尿病患病人數(shù)更是迅猛增長。由于降糖藥物的使用具有副作用和引起胰腺的繼發(fā)性衰竭[1]，所以目前人們逐漸將目光移向天然食品，尋求安全和理想的降糖保健食品。國內(nèi)外研究表明，乳酸菌對預防和治療糖尿病具有一定的作用，其可以通過調(diào)節(jié)宿主腸道菌群比例和免疫系統(tǒng)等，達到降糖和保護胰島的目的。目前報道的具有降糖作用的乳酸菌有：嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）、植物乳桿菌（L.plantarum）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）、加氏乳桿菌（L.gasseri）、約氏乳桿菌（L.johnsonii）、干酪乳桿菌（L.casei）和唾液鏈球菌（S.salivarius）等。涉及的機理包括：調(diào)節(jié)腸道菌群，提高腸道黏膜屏障功能；增強機體免疫功能；修復機體抗氧化損傷；促進胰島素分泌，提高胰島素敏感性；調(diào)節(jié)糖代謝相關的神經(jīng)活性等[2]。

食醋具有降血糖的作用，可能是因為食醋對胰島素分泌的響應和其對降血糖相關酶活性影響的結果。國內(nèi)有臨床報告證實：高血壓或心血管病患者每天服用20 mL 果醋，半年后總膽固醇平均下降9.5%，血糖值下降11.2%，中性脂肪減少11.3%[3]。日本學者曾對17 名糖尿病患者進行了為期1 個月飲用醋蛋液的臨床試驗研究，結果有11人在飲用醋蛋液2～3 d 后，糖尿病癥狀明顯改善[4]。乳酸菌是食醋發(fā)酵過程中的重要菌群，對食醋的風味、生理功能具有重要的貢獻作用。本文主要研究分離自山西老陳醋醋醅中的一株植物乳桿菌173（L.plantarum 173）對II 型糖尿病大鼠的降血糖機制，為開發(fā)長效安全的預防糖尿病的微生態(tài)制劑進行了基礎理論研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

植物乳桿菌173，山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，生物工程實驗室保存；TC（總膽固醇）、HDL-C（高密度脂蛋白-膽固醇）、LDL-C（低密度脂蛋白-膽固醇）、TG（甘油三酯）測定試劑盒，購自北京中生北控公司；血糖、激素測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；總RNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RR036A 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要儀器與設備

CFX96 熒光定量PCR 儀，美國BioRad 公司；Thermo 酶標儀，芬蘭Thermo Electron 公司；電泳成套設備，美國Bio-rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha Innotech 公司；臺式高速冷凍離心機，美國Sigam 公司；UItimate 3000 液相色譜儀，德國賽默飛公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌體發(fā)酵上清液和細胞提取液的制備 20株乳酸菌菌株經(jīng)液體MRS 培養(yǎng)基活化后，按3%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，8 000 r/min，離心10 min，分別收集上清及菌體。上清液以0.22 μm 濾膜過濾得試驗用發(fā)酵上清；菌體用PBS 離心洗滌2 次后，再重懸PBS中，調(diào)節(jié)菌體濃度為1×109CFU/mL，超聲破碎，將超聲后的液體以10 000 r/min 離心20 min 后取其上清，經(jīng)過0.22 μm 的濾膜過濾后得到細胞提取液。

1.3.2 菌株對α-葡萄糖苷酶活力的抑制率測定按照文獻[5]中的方法，測定乳酸菌發(fā)酵上清和細胞提取液對α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）酶活性的抑制率。在150 μL PBS（0.1 mol/L pH 6.8）中加入75 μL 20 mmol/L 的對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）溶液及25 μL 待測乳酸菌的發(fā)酵上清或細胞提取液，37 ℃水浴10 min 后，加50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.17 U/mL）（空白對照加入50 μL pH 6.8 的0.1 mol/L PBS 溶液）繼續(xù)37 ℃水浴10 min，加入1 mL 0.1 mol/L Na2CO3終止反應，于405 nm 處測吸光值。

酶抑制率（%）=[1-（C-D）/（A-B）]×100%

式中，A——含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含樣品的測定吸光值；B——不含α-葡萄糖苷酶溶液及待測樣品的測定吸光值；C——含有α-葡萄糖苷酶溶液及待測樣品的測定吸光值；D——不含α-葡萄糖苷酶溶液但含待測樣品的測定吸光值。

1.3.3 菌株的耐酸、耐膽鹽特性和對Caco-2 細胞的黏附測定 按照文獻[6]中的方法，對乳酸菌菌株的耐酸、耐膽鹽特性和對Caco-2 細胞的黏附率進行測定。

1.3.4 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立

1）模型建立 30 只健康8 周齡的大鼠（150±20）g，隨機分為對照組10 只，模型組10 只，植物乳桿菌173 組10 只。前6 周，對照組飼喂基礎飼料，模型組和植物乳桿菌173 組均定量飼喂高脂飼料，植物乳桿菌173 組每天灌胃受試菌液1 mL，其余組均灌胃生理鹽水1 mL。在第7 周時，模型組和植物乳桿菌173 組采用鏈脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）腹腔注射誘導，對照組注射生理鹽水，繼續(xù)飼養(yǎng)到13 周試驗結束后，處死大鼠，留取標本，測定指標。

2）飼料配方 高脂飼料：玉米粉（45%），維生素（1%），豬油（20%），酪蛋白（20%），骨粉（4%），蔗糖（10%）。普通飼料：玉米粉（50%），麩皮（25%），豆料（20%），骨粉（2%），魚粉（2%），維生素（1%）。

3）受試液制備 將試驗菌株植物乳桿菌173 按3%的接種量接于MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，8 000 r/min，離心10 min，棄掉上清液，加入無菌生理鹽水將菌體細胞洗滌2 次，并調(diào)節(jié)菌液濃度為1010CFU/mL。

4）指標測定

①大鼠血糖、血脂及激素水平的測定 按照文獻[7]中的方法，采用試劑盒對大鼠血糖、血脂及激素水平進行測定。

②糞便菌群的測定 參考文獻[8]中的方法，采用實時熒光定量PCR 技術對糞便中乳桿菌、雙歧桿菌、柔嫩梭菌和普氏擬桿菌的16S rDNA V3可變區(qū)進行定量分析。

③糞便有機酸含量的測定 收集大鼠新鮮糞便，測定其有機酸含量。取0.5 g 新鮮糞便，加入1 mL 蒸餾水混勻，用去離子水浸泡3 h→抽濾→12 000 r/min 離心10 min→取上清液于0.22 μm微孔濾膜濾樣→進樣檢測。

色譜條件：液相色譜儀UItimate 3000；色譜柱選擇Agilent ZORBAX-C18（4.6×150）mm，5 μm；流動相為pH 2.7 的20 mmol/L NaH2PO4；進樣量20 μL；流動速度0.8 mL/min；紫外檢測波長210 nm；柱溫30 ℃。

④ 肝臟和腸道中糖尿病相關基因的表達提取肝臟和腸道中的RNA，按照文獻[5，8]中的引物和試驗方法，對肝臟PPARα、PPARγ、GLUT4 和腸道中GPR41、GPR43、ZO-1、Occludin、Claudin及MUC2 mRNA 的水平進行測定。

2 結果與討論

2.1 具有降糖作用乳酸菌的篩選

微生物來源的酶抑制劑篩選研究成為糖尿病防治領域新的研究熱點。糖尿病相關的代表性靶酶調(diào)節(jié)劑有醛糖還原酶抑制劑、糖原合酶激酶抑制劑、糖異生抑制劑等。α-葡萄糖苷酶抑制劑[9]通過延緩腸道碳水化合物吸收而達到治療糖尿病的效果，通過競爭性抑制位于小腸的α-葡萄糖苷酶，使碳水化合物分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后血糖。研究發(fā)現(xiàn)某些植物或谷物的提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用[10-11]。目前已報道的微生物來源α-葡萄糖苷酶抑制劑大多來源于鏈霉菌屬，此外還有芽孢桿菌屬、游動放線菌屬和真菌，乳酸菌來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑報道比較少，Ramchandran 等[12]指出乳酸菌在體外具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。

表1顯示20 株乳酸菌發(fā)酵上清液對α-葡萄糖苷酶活力的抑制率在2%至31.22%范圍內(nèi)，普遍高于細胞提取物的抑制率（2.12%～25%）。其中3 株植物乳桿菌171，172，173 和1 株發(fā)酵乳桿菌179 發(fā)酵上清液對α-葡萄糖苷酶活力的抑制率最強，分別達到30.12%，31.22%，30.03%和29.56%。陳佩[5]研究也表明鼠李糖乳桿菌CCFM0528、乳雙歧桿菌（B.lactis）CCFM7、兩歧雙岐桿菌CCFM16、干酪乳桿菌CCFM0412 和保加利亞乳桿菌 （L.bulgaricus）CCFM4 等菌株的發(fā)酵上清對α-葡萄糖苷酶也具有較高的抑制率（＞20%）。Ramchandran 等[12]推測可能是由于乳酸菌產(chǎn)生的多糖對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。

表1 具有降糖作用乳酸菌的篩選Table 1 Screening of hypoglycemic activity of LAB strains

2.2 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠體重的影響

鑒于植物乳桿菌173 的高α-葡萄糖苷酶抑制活性及良好的耐酸、耐膽鹽特性和黏附性，采用植物乳桿菌173 進行后續(xù)動物實驗的研究。糖尿病主要包含Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率（90%～95%）遠高于Ⅰ型糖尿病。高脂高糖飼料喂養(yǎng)結合小劑量鏈脲菌素（STZ）建立的Ⅱ型糖尿病大鼠模型，具有血糖水平升高、胰島β 細胞損傷、血脂異常和氧化應激損傷等特點。這種糖尿病模型與人類Ⅱ型糖尿病患者代謝類型具有相似的特點[8]，因此，該糖尿病動物模型建立方法具有廣泛的應用。

由圖1可知，前6 周，模型組和植物乳桿菌173 組體重均高于正常對照組（P＜0.05）。在STZ誘導造模期（第7 周），對照組大鼠體重逐漸增長，模型組和植物乳桿菌173 組體重均顯著下降（P＜0.05），這是由于Ⅱ型糖尿病癥狀逐漸顯現(xiàn)，同時大鼠出現(xiàn)毛色不潔，多飲多尿癥狀。之后，對照組體重平穩(wěn)增長。模型組和植物乳桿菌173 組體重變化趨勢相同，均在一段時間的下降之后，逐漸上升，試驗結束時，平均體重分別達到300.11 g 和352.73 g，顯著低于對照組大鼠的體重（387.45 g）。表明益生菌植物乳桿菌173 能夠顯著緩解Ⅱ型糖尿病大鼠的體重減輕病癥。

圖1 植物乳桿菌173 對各組大鼠體重變化的影響Fig.1 Effect of L.plantarum 173 on weight change of rats in each group

2.3 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠空腹血糖及糖耐受性的影響

圖2 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠空腹血糖及糖耐受性影響Fig.2 Effect of L.plantarum 173 on blood glucose and AUC values in diabetic rats

葡萄糖不耐受是胰島素抵抗Ⅱ型糖尿病一個重要的診斷指標。如圖2所示，與對照組相比，模型組大鼠的空腹血糖值顯著提高，而植物乳桿菌173 具有降血糖的功效。對照組和模型組大鼠7周和13 周的空腹血糖值沒有明顯變化，而植物乳桿菌173 組大鼠在第13 周的空腹血糖值相比第7周顯著降低。在第7 周末，飼喂高脂飼料并且經(jīng)STZ 處理組大鼠的葡萄糖耐受能力明顯被降低，與對照組相比，血藥濃度-時間曲線下面積（Area under the curve，AUC）值顯著升高。但在試驗結束時（第13 周末），灌胃植物乳桿菌173 組大鼠的糖耐受能力明顯恢復，但AUC 值仍高于對照組。陳佩[5]和Li 等[8]也分別證明口服鼠李糖乳桿菌CCFM0528 和乳桿菌G15，Q14 可以顯著改善高脂飼料-STZ 誘導的Ⅱ型糖尿病小鼠和大鼠的葡萄糖耐受性。

2.4 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠激素水平的影響

Ⅱ型糖尿病是非胰島素依賴型糖尿病，以高血糖、胰島素抵抗和胰島素相對缺乏為主要特征。Natali 等[13]報道，在60%～80%的Ⅱ型糖尿病病人中都呈現(xiàn)胰島素抵抗性和相關代謝異常。如圖3所示，糖尿病模型組血清胰島素（Insulin）、胰高血糖素（Glucagon）和瘦素（Leptin）水平顯著高于正常對照組（P＜0.05）。灌胃植物乳桿菌173 后，3 種激素含量有所降低，其中胰高血糖素和瘦素水平更加接近正常對照組。糖尿病模型組胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide 1，GLP-1）和酪酪肽（Peptide tyrosine tyrosine，PYY）水平較正常對照組顯著降低，灌胃植物乳桿菌植物乳桿菌173后，這兩種激素水平有所提高（P＜0.05）。

圖3 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠激素水平的影響Fig.3 Effect of L.plantarum 173 on hormones levels in diabetic rats

2.5 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠血脂水平的影響

圖4顯示，模型組和植物乳桿菌173 組大鼠血清中總膽固醇（Total cholesterol，TC）（7.84 mmol/L，4.86 mmol/L），甘油三酯（Triglyceride，TG）（10.03 mmol/L，6.85 mmol/L）和低密度脂蛋白-膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）（3.16 mmol/L，1.67 mmol/L）較正常對照組（TC，2.04 mmol/L；TG，1.25 mmol/L；LDL-C，0.52 mmol/L）明顯提高，HDL-C 水平3 組間差異不顯著。血脂異常是糖尿病的常見特征。Li 等[8]也證明灌胃乳桿菌G15 和Q14 可以顯著抑制高脂飼料誘導的糖尿病大鼠血清中總膽固醇和甘油三酯的水平。糞便移植術的研究證實，腸道菌群產(chǎn)生的丁酸在調(diào)節(jié)血脂與血糖平衡中具有重要作用。

2.6 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠肝臟PPARα，PPARγ 及GLUT4 mRNA 表達量的影響

PPARs 是一類重要的調(diào)節(jié)炎性反應和葡萄糖平衡的基因，存在3 種亞型，PPARα、PPARδ 和PPARγ。PPARs 的激活可對胰島素抵抗的改善發(fā)揮重要作用。PPARα 具有提高胰島素敏感性的性能。PPARγ 主要在脂肪組織中表達，在胰島素抵抗的治療中起關鍵作用[14]。GLUT4 是存在于脂肪和骨骼肌組織的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，80%以上的受胰島素支配的葡萄糖在骨骼肌內(nèi)消耗。PPARγ 的激活還可以減少血漿中游離脂肪酸的濃度而使之儲存在脂肪組織中，并促進葡萄糖轉(zhuǎn)運子GLUT-4 的表達，從而改善糖代謝[15]。

由圖5可知，與對照組相比，模型組中PPARα 和GLUT4 的mRNA 表達量都顯著降低 （P＜0.05），但PPARγ 的表達量卻高于對照組。李川[16]在植物乳桿菌NCU116 及發(fā)酵胡蘿卜汁對糖尿病大鼠的血糖改善機制研究中，也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中PPARγ 基因的表達量高于對照組，但陳佩[5]的研究卻得出相反的結論。本文試驗證明植物乳桿菌173 可以提高肝臟中PPARα，PPARγ 和GLUT4 mRNA 表達量改善胰島素抵抗，從而降低小鼠的血糖水平。這與Zhang 等[17]和陳佩[5]報道的羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）GMNL-263，干酪乳桿菌（L.casei Zhang）和乳酸菌CCFM0412，CCFM0528可通過調(diào)節(jié)PPARs 和GLUT4 基因的表達促進葡萄糖穩(wěn)態(tài)和提升胰島素敏感性，來改善糖尿病的胰島素抵抗和葡萄糖不耐受的癥狀的研究結果相似。

圖4 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠血脂水平的影響Fig.4 Effect of L.plantarum 173 on levels of serum lipids in diabetic rats

2.7 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠糞便菌群和短鏈脂肪酸的影響

圖5 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠肝臟PPARα，PPARγ 及GLUT4 mRNA 表達量的影響Fig.5 Effect of L.plantarum 173 on liver relative PPARα，PPARγ and GLUT4 mRNA levels in diabetic rats

Neal 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高脂飲食能使腸道菌群失調(diào)，G-/G+菌比例增高，雙歧桿菌、類桿菌和腸球菌減少，誘發(fā)機體出現(xiàn)糖尿病、肥胖癥和炎癥反應。相似的結果也在其它文獻中被報道，證明腸道菌群與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關。由圖6可知，與對照組相比，模型組大鼠糞便中乳桿菌（Lactobacillus）、雙歧桿菌（Bifidobacteria）、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）和普氏擬桿菌（Bacteroides Prevotella）的數(shù)量顯著降低，而植物乳桿菌173 對改善糖尿病大鼠腸道菌群有顯著性效果。Li 等[8]也報道，相對于模型組，灌胃乳桿菌G15 和Q14 的糖尿病小鼠糞便中主要的乙酸產(chǎn)生菌—乳桿菌和雙歧桿菌，及柔嫩梭菌（主要負責產(chǎn)丁酸）和普氏擬桿菌（主要產(chǎn)生乙酸和丁酸）的數(shù)量顯著提高。別明江等[19]也發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道益生菌的變化與血糖變化趨勢呈負相關。

研究證實臨床上服用酸奶或乳酸菌制劑，可增加腸道益生菌，在一定程度上抑制病原菌入侵和定植，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高腸道黏膜屏障功能，有效緩解及改善糖尿病癥狀[20]。乳酸菌可通過多種機制如分泌有機酸降低pH 值，營養(yǎng)競爭，控制內(nèi)毒素，合成細菌素，減少腸腔內(nèi)細菌易位，抑制病原菌的生長，黏附定植，占位，調(diào)節(jié)腸道菌群，促進胃腸蠕動，保證溶菌酶、蛋白分解酶的分泌，加強腸道緊密連接，保護腸道生物屏障，影響腸道先天免疫系統(tǒng)等方式，作用于腸道菌群的多方面，最終建立一個正常的共生菌群，直接或間接影響機體糖代謝，從而有效緩解及改善糖尿病癥狀。

圖6 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠糞便菌群的影響Fig.6 Effect of L.plantarum 173 on fecal microbial population in diabetic rats

許多研究[21]結果表明，短鏈脂肪酸的攝入可以起到優(yōu)化體脂組成、調(diào)節(jié)葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和改善血脂代謝等保健作用。灌胃植物乳桿菌173 可以顯著提高糖尿病大鼠糞便中短鏈脂肪酸的含量，使其接近正常水平。Aoki 等[22]也報道，給糖尿病小鼠補充乳桿菌和雙歧桿菌，可以提高腸道中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。Vadder 等[23]證明補充丙酸或丁酸可以緩解糖尿病小鼠的體重減輕病癥，并改善糖耐受性。

圖7 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠糞便菌短鏈脂肪酸的影響Fig.7 Effect of L.plantarum 173 on fecal short chain fatty acid content in diabetic rats

2.8 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠腸道GPR41，GPR43，ZO-1，Occludin，Claudin 及MUC2 mRNA 表達量的影響

研究表明[24]，短鏈脂肪酸發(fā)揮降糖功能主要是通過活化G-蛋白受體 （如GPR43，GPR41），從而提高腸道內(nèi)GLP-1 的分泌量而發(fā)揮作用的。與模型組相比，植物乳桿菌173 處理組大鼠腸道中GPR43 和GPR41 基因的表達量顯著提高，接近對照組。其中，GPR43 基因上調(diào)表達與Li 等[8]的研究結果相似，但對于GPR41 基因的表達，文獻[8]中試驗結果卻顯示沒有顯著變化。

乳酸菌可以通過保護腸道黏膜屏障，影響腸道先天免疫系統(tǒng)等方式，作用于腸道菌群的多方面，最終建立一個正常的共生菌群，直接或間接的影響機體糖代謝，從而有效緩解及改善糖尿病癥狀。Cani 等[25]報道，高脂飲食可以顯著下調(diào)腸道緊密連結蛋白ZO-1、Claudin、Occludin 基因的表達，導致腸道黏膜通透性增加。Strowski 等[26]證明益生菌可以提高激素分泌從而促進腸道黏蛋白MUC的表達，增強腸道黏膜屏障功能。圖8結果顯示，植物乳桿菌173 可以有效改善糖尿病大鼠腸道屏障的完整性、通透性及黏蛋白等相關基因表達水平的變化。

3 結論

圖8 植物乳桿菌173 對糖尿病大鼠腸道GPR41、GPR43、ZO-1、Occludin、Claudin 及MUC2 mRNA表達量的影響Fig.8 Effect of L.plantarum 173 on intestinal GPR41，GPR43，ZO-1，Occludin，Claudin and MUC2 mRNA levels in diabetic rats

本文對山西老陳醋醋醅中分離篩選出的一株益生菌——植物乳桿菌173 的降血糖功能及機制進行了研究。最終證明植物乳桿菌173 主要通過調(diào)節(jié)大鼠肝臟中炎性反應和葡萄糖平衡基因及腸道緊密連結蛋白、黏蛋白等相關基因的表達，維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)和提升胰島素敏感性，提高腸道內(nèi)短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的數(shù)量，增強腸道黏膜屏障等途徑協(xié)同發(fā)揮降糖功能，為開發(fā)醋醅來源益生菌的糖尿病微生態(tài)制劑提供了理論依據(jù)。