羅輝，鄧玲俐，蔣亞輝，楊和榮

（四川省遂寧市中心醫(yī)院，四川 遂寧 629000）

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)生發(fā)展與免疫功能失調(diào)、血管損傷、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路紊亂及銀屑病相關(guān)基因表達(dá)失衡密切相關(guān)[1-3]。咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型造模方法簡易，與人的銀屑病發(fā)病機制相似，是國內(nèi)外公認(rèn)并普遍使用的理想模型[4-6]。白細(xì)胞介素（IL）-17細(xì)胞因子家族中IL-17A、IL-17C和IL-17F與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]，銀屑病患者研究觀察中，發(fā)現(xiàn)Notch蛋白家族Notch1-4、Jagged1-2以及DLL1、3、4在銀屑病患者皮損中表達(dá)增強，可能參與了銀屑病的發(fā)病機制[9]。為了探索IL-17在Notch通路對銀屑病的影響作用，本研究建立咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型，腹腔注射重組人源IL-17a對模型小鼠機體進(jìn)行刺激，觀察IL-17蛋白和Notch mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步了解銀屑病的可能發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 重組人源IL-17a（上海西唐生物科技有限公司），戊巴比妥鈉（上海試劑二廠生產(chǎn)），咪喹莫特（英國3M Health Care Limited公司），凡士林軟膏（廣州明露醫(yī)療衛(wèi)生用品有限公司）。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒及檢測儀（美國CST公司），總RNA提取試劑盒、實時熒光定量（RT-PCR）試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。RT-PCR檢測儀（瑞士Roche公司）。

1.2 實驗動物分組 選取8周齡的雌性昆明小白鼠（SPF級）30只，體質(zhì)量為 18～22 g，購自濟(jì)南金豐實驗動物有限公司[許可證號：SCXX（滬）2011-00241]。隨機分為空白組、對照組和實驗組，每組10只。此次實驗使用的小白鼠取得了實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 銀屑病小鼠模型的建立 腹腔注射戊巴比妥鈉對所有小鼠進(jìn)行麻醉，麻醉顯效后，用剃毛器剃光小鼠背部面積約為2 cm×3 cm的背部毛，動作要輕柔，避免刮傷小鼠皮膚。空白組小鼠剃毛部位外涂凡士林軟膏，對照組和實驗組小鼠剃毛部位外涂咪喹莫特軟膏，建立咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型，涂藥后局部按摩30～60次，1次/d，連續(xù)用藥10 d。同時，實驗組每日腹腔注射100 ng/mL重組人源IL-17a進(jìn)行刺激，空白組和對照組腹腔注射等體積生理鹽水，10 d后取小鼠眶內(nèi)血檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4 銀屑病皮損評分 通過觀察各組小鼠涂藥部位的紅班、鱗屑及浸潤增厚的變化情況，按照國際銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）的評分標(biāo)準(zhǔn)對皮損評分，見表1。

1.5 指標(biāo)觀察 各組連續(xù)給藥10 d后，取小鼠眼眶內(nèi)血，離心后吸取上清液，制備出單個核細(xì)胞放置冰箱備用。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實驗操作：①利用ELISA檢測IL-17蛋白含量；②利用RT-PCR法測定Notch mRNA表達(dá)水平；③利用Western blotting法檢測 Notch1、Delta1、Delta4蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以±s表示且進(jìn)行方差齊性檢驗，各組間比均數(shù)較采用兩獨立樣本t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮損情況 空白組小鼠皮膚表面光滑，無斑塊和鱗屑，偶見紅斑。與空白組比較，對照組和實驗組小鼠表皮可見銀屑樣改變，斑塊隆起、可見紅斑且表面覆蓋有鱗屑，見圖1。與對照組比較，實驗組小鼠PASI指數(shù)高于對照組（P<0.05），表明了實驗組小鼠皮損程度更嚴(yán)重，見表2。

表1 銀屑病皮損評分標(biāo)準(zhǔn)

圖1 小鼠皮損情況

表 2 PASI評分 （分，±s）

表 2 PASI評分 （分，±s）

組別 評分標(biāo)準(zhǔn) 組比 P空白組 0.20±0.42對照組5.90±0.57（1）∶（2）0.000實驗組6.89±1.03（2）∶（3）0.027

2.2 各組小鼠外周血IL-17及單核細(xì)胞Notch mRNA表達(dá)水平 與空白組比較，對照組小鼠外周血IL-17蛋白與及單核細(xì)胞Notch mRNA表達(dá)水平顯著上升（P<0.01）；與對照組比較，實驗組小鼠外周血IL-17蛋白及單核細(xì)胞Notch mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05），見表 3，圖 2、3。

2.3 各組小鼠 Notch通路中 Notch1、Delta1和Delta4蛋白表達(dá)水平 通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，見圖4，與空白組比較，對照組Notch1和Delta4蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與對照組比較，實驗組Notch1和Delta4蛋白表達(dá)水平上升表達(dá)水平升高（P<0.05），見表4、圖5，3組Delta1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組小鼠外周血IL-17蛋白、單核細(xì)胞Notch mRNA水平比較 （±s）

表3 各組小鼠外周血IL-17蛋白、單核細(xì)胞Notch mRNA水平比較 （±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

組別 IL-17（μg/mL） Notch mRNA空白組 61.44±5.53 0.253±0.092對照組 106.27±4.37* 0.430±0.069*實驗組 112.64±7.89# 0.491±0.047#F 12.546 2.335 P 0.001 0.002

圖2 各組小鼠外周血IL-17蛋白表達(dá)水平

圖3 各組小鼠外周血單核細(xì)胞Notch mRNA表達(dá)水平

圖4 Western Blot檢測蛋白表達(dá)結(jié)果

表4 Notch通路中相關(guān)蛋白相對含量表達(dá)水平比較 （±s）

表4 Notch通路中相關(guān)蛋白相對含量表達(dá)水平比較 （±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

組別 N o t c h 1/β-a c t i n D e l t a 1/β-a c t i n D e l t a 4/β-a c t i n空白組 0.1 9 9 9±0.0 3 3 9 0.2 8 9 7±0.0 5 7 8 0.1 3 3 5±0.0 4 0 0對照組 0.2 3 9 0±0.0 4 7 8* 0.2 6 8 8±0.0 4 0 6 0.2 0 0 2±0.0 4 1 7*實驗組 0.3 6 4 7±0.0 5 0 5# 0.2 7 0 4±0.0 4 6 3 0.2 5 9 5±0.0 3 3 8#F 8.7 7 9 1 1.2 6 8 1 0.3 2 4 P 0.0 0 2 0.0 0 1 0.0 0 3

圖5 各組小鼠Notch通路中Notch1、Delta1和Delta4蛋白表達(dá)水平

3 討論

3.1 實驗動物模型評價 此次實驗利用咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠建立銀屑病模型中，小鼠表皮表現(xiàn)為角化不全及角化過度情況，表皮有乳頭瘤樣增生，應(yīng)用抗銀屑病藥物治療有一定的療效，符合Di Meglio等[10]提出的理想銀屑病動物模型。

3.2 實驗結(jié)果評價 Notch通路是細(xì)胞之間相互作用的信號通路，能調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程[11]。有實驗證實，Notch信號通路異?；罨c腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如胃癌患者研究中Notch通路異?；罨痆12]。銀屑病研究中，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的激活與銀屑病發(fā)病相關(guān)，可能的作用機制為Notch通路激活，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡與分化[13]。細(xì)胞之間Notch配體與受體相互作用可產(chǎn)生 Notch信號，Notch1、Delta1和 Delta4作為 Notch通路主要受體和配體，Notch1、Delta1和Delta4蛋白的表達(dá)量與Notch通路活化程度相關(guān)。IL-17是免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎性因子，誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)機體的多種免疫應(yīng)答反應(yīng)，在類風(fēng)濕、濕疹等自身免疫性疾病發(fā)病機制中有著重要影響作用[14-15]，與自身免疫的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。銀屑病也是機體自身免疫的調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致的自身免疫性疾病，與IL-17過表達(dá)存在一定的聯(lián)系，喬菊等[16]在檢測銀屑病患者IL-17表達(dá)水平研究中證實了這一點，研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者IL-17表達(dá)水平高于正常人。本研究通過建立銀屑病小鼠模型，觀察IL-17和Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量，進(jìn)一步證實他們之間的聯(lián)系。實驗發(fā)現(xiàn)，模型小鼠外周血炎性因子IL-17、Notch mRNA和Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平上升，表明了銀屑病小鼠發(fā)病與IL-17和Notch通路的表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)性?？梢酝茰y，小鼠表皮在咪喹莫特誘導(dǎo)誘導(dǎo)下形成類似銀屑病病體征，同時機體對外界刺激作出反應(yīng)，T細(xì)胞大量分泌IL-17介導(dǎo)免疫反應(yīng)，Notch信號通路被激活促進(jìn)炎性細(xì)胞增殖。為了增加實驗的可比性，筆者用重組IL-17a刺激銀屑病小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，上調(diào)IL-17表達(dá)水平小鼠外周血IL-17、單核細(xì)胞Notch mRNA以及Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上升，小鼠表皮銀屑病特征表現(xiàn)更為嚴(yán)重，進(jìn)一步證實了IL-17與Notch上調(diào)加重銀屑病發(fā)展?？偠灾?，當(dāng)機體受到刺激后，T細(xì)胞大量表達(dá)炎性因子IL-17，同時Notch信號通路被激活，IL-17與Notch通路的相互作用加重銀屑病的發(fā)生發(fā)展。

銀屑病是皮膚科較為常見疾病，傳統(tǒng)治療方法效果并不理想，因而給患者的健康和生活帶來很大的困擾。從分子學(xué)角度去研究銀屑病，更深入的了解其發(fā)病機制，對開發(fā)相關(guān)治療藥物至關(guān)重要。