黃瑞芳，王紅慧，王紅玲，施士爭*

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014； 3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，江蘇 南京 210036)

鉛不能被生物代謝所分解，且能通過食物鏈在動物和人體內(nèi)富集，對腎臟、血液、神經(jīng)系統(tǒng)等危害極大[1-2]。柳樹積累性高，植物修復(fù)能力強，適合用于修復(fù)重金屬污染[3-5]。灌木類柳樹適應(yīng)性強,速生,生物量大,扦插造林成本極低。根系發(fā)達，比表面積大，且主要分布在深0—40 cm的土層，位于重金屬主要分布層[6-8]。灌木柳條還可用作工業(yè)原料、編織工藝、生物能源和園林觀賞等，具有較高的經(jīng)濟價值，又不直接與食物鏈相聯(lián)系，與草本相比，優(yōu)勢明顯[9-10]。

植物對重金屬積累特性的遺傳變異規(guī)律是研究植物修復(fù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，目前在重金屬對植物的毒性效應(yīng)上研究較集中，對植物的重金屬積累特性遺傳變異研究較少。本文以作者前期篩選的鉛耐受性強的無性系作為父母本[11]，共8個雜交組合的51個灌木柳樹無性系為試驗材料，以前期確定的適宜鉛污染濃度[12]，通過水培方法測定了其在鉛污染狀況下(300 μM)的成活率、受害指數(shù)，分根、莖、葉測定了鉛含量和鉛總量，旨在分析灌木柳樹雜交組合間的鉛積累特性及其遺傳變異差異，掌握灌木柳樹重金屬積累特性的遺傳變異特征，以便為柳樹的重金屬耐性遺傳改良提供理論依據(jù)，篩選具有更高重金屬富集能力的無性系或基因型，提高修復(fù)效率，加快修復(fù)進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為筆者于2013年根據(jù)重金屬耐受性進行定向雜交所獲得的子代，包括杞柳×簸箕柳的雜交組合，簸箕柳×簸箕柳的2個雜交組合，以及毛枝柳×簸箕柳、毛枝柳×黃花柳和二色柳×簸箕柳的各1個雜交組合。經(jīng)過苗期初篩，選取的8個雜交組合共51個灌木柳樹無性系(見表1)。所有的灌木柳樹均來自于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院國家柳樹良種基地柳樹種質(zhì)資源圃。

表1 供試無性系

1.2 試驗方法

試驗采取水培法。所有灌木柳樹于2020年3月從江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院柳樹種質(zhì)資源圃采穗，均選取長15 cm、直徑為1 cm的健壯插穗，清水培養(yǎng)14 d后，挑選生長勢一致的柳樹苗，置于定植籃中，每籃10株。用改良Hoagland′s培養(yǎng)液培養(yǎng)28 d后進行鉛處理14 d，之后收獲植株。Pb2+以Pb(NO3)2的形式加入，濃度為300 μM。試驗設(shè)置重復(fù)3個，每重復(fù)10株。試驗過程中每7 d換培養(yǎng)液1次。為避免鉛產(chǎn)生沉淀，開始鉛脅迫后，培養(yǎng)液中不再加入KH2PO4。

1.3 測定方法

本試驗以灌木柳樹無性系受鉛脅迫后的受害指數(shù)[13]、生物量以及體內(nèi)鉛含量為分析指標。脅迫實驗結(jié)束后分根、莖、葉收獲植株，先用自來水沖洗，然后用去離子水反復(fù)沖洗干凈并用吸水紙擦干，根部用EDTA洗去表面附著的鉛，105 ℃殺青30 min后，烘干至恒重，分別稱其生物量(即干物質(zhì)量，dry weight，DW)。按照《食品安全國家標準 食品中鉛的測定》(GB5009.12-2017)中的方法進行植物根、莖、葉鉛含量的測定。受害指數(shù)根據(jù)參試無性系的受害等級進行計算，共分為7個受害等級(見表2)，受害指數(shù)(P)按照以下公式計算：

表2 柳樹受害癥狀的分級標準

其中，ni為達到第i等級的株數(shù)；ki為第i等級的分值，i=0，1，…6。

得到的數(shù)據(jù)利用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛脅迫下不同雜交組合的成活率比較

成活率反映了灌木柳樹在受到鉛脅迫時的生長狀況，對鉛脅迫下各灌木柳樹的成活率進行統(tǒng)計，對不同雜交組合進行差異比較(見表3)，結(jié)果顯示：不同雜交組合間的成活率存在顯著差異，P1025×P63的成活率最低，只有(71.52±36.94)%， 而P646×P63，P1024×P63，P126×P63和P126×P585的成活率均達到100%。變異最大的為P1025×P63雜交組合，變異系數(shù)為51.65%。

表3 灌木柳樹雜交組合的成活率

2.2 鉛脅迫下不同雜交組合的受害指數(shù)比較

本文用受害指數(shù)反映鉛脅迫下灌木柳樹的受害等級和灌木柳樹對鉛的耐性能力。鉛脅迫下各無性系的受害指數(shù)分布范圍為2.08%—97.22%，受害指數(shù)在10%以下的有6個無性系，在10%—50%之間的有26個無性系。受害指數(shù)較低的10個無性系見表4。

表4 受害指數(shù)較低的灌木柳樹排名

鉛脅迫下各雜交組合的受害指數(shù)見表5。由表5可知，P126×P585的受害指數(shù)顯著低于其他雜交組合，只有(3.70±2.27)%，P294×P63的受害指數(shù)最高，為(58.54±25.52)%。雜交組合內(nèi)變異最大的為P1025×P63(變異系數(shù)達到63.11%)，變異最小的為P126×P63(變異系數(shù)為31.14%)。

2.3 鉛脅迫下不同雜交組合的生物量比較

鉛脅迫下各雜交組合的生物量見表5。生物量分布范圍為0.28—20.17 g，在鉛脅迫下，不同雜交組合間的生物量平均值存在一定差異， P126×P63的子代的生物量平均值顯著大于其他雜交組合，為(13.85±4.95) g ，生物量平均值最小的為P294×P63[(6.05±4.84) g]。變異最大的為P294×P63，變異系數(shù)達到79.97%，變異最小的為P126×P585，變異系數(shù)為8.76%。

表5 鉛脅迫下灌木柳樹的受害指數(shù)和生物量

不同雜交組合的存活率、受害指數(shù)和生物量的平均值均存在一定差異，但各雜交組合的子代無性系相應(yīng)的變異系數(shù)也較大，這就說明每個雜交組合內(nèi)的子代無性系間存在較大的差異。相同雜種組合杞柳×簸箕柳的3個不同的雜交組合的存活率、受害指數(shù)和生物量均存在顯著差異。

2.4 鉛脅迫下不同雜交組合的鉛含量比較

為了進行無性系水平上的鉛積累能力比較，本文以生物量和受害指數(shù)為指標，選擇生物量和受害指數(shù)都超過平均值的共計20個無性系進行根、莖、葉鉛含量測定的分析，這20個無性系隸屬的雜交組合見表6，測定結(jié)果見圖1。

表6 20個無性系隸屬的雜交組合

方差分析結(jié)果顯示各無性系的鉛含量存在顯著差異。從圖1可以看出，參試無性系的不同部位的鉛含量相差很大，葉部鉛含量在7.8—32.8 mg/kg，莖部鉛含量在10.5—42.3 mg/kg，而根部鉛含量在792.3—3 498.3 mg/kg，根部的鉛含量是莖、葉部鉛含量的近百倍。

圖1 鉛脅迫下灌木柳樹不同部位(根、莖、葉)的鉛含量

參試無性系的葉部鉛含量和莖部鉛含量的高低并沒有表現(xiàn)出一致性，其中莖部鉛含量大于葉部鉛含量的無性系有12個，而葉部鉛含量大于莖部鉛含量的無性系有8個。

2.5 鉛脅迫下灌木柳樹的鉛總量

為評估各無性系生物修復(fù)能力，現(xiàn)對各無性系的鉛總量進行測定，從而得出各無性系體內(nèi)固定的鉛總量，結(jié)果見圖2。

方差分析結(jié)果顯示各無性系的鉛總量存在顯著差異。從圖2可以看出，整株鉛總量在776.53(無性系16)—3 549.61 μg(無性系23)。雖然根部的生物量較小，但是鉛含量極顯著高于莖和葉，根部鉛總量占整株鉛總量的64.47%(無性系43)—91.28%(無性系28)，莖部鉛總量占比為3.70%(無性系17)—16.08%(無性系51)，葉部鉛總量占比為4.45%(無性系28)—20.72%(無性系43)。

圖2 鉛脅迫下灌木柳樹不同部位(根、莖、葉)的鉛總量

2.6 鉛脅迫下不同雜交組合及無性系的鉛積累特性的比較

對無性系超過3個的雜交組合進行差異性顯著分析及多重比較(見表7)，符合條件的有P336×P63，P61×P63和P126×P63等3個雜交組合，各雜交組合的根鉛含量為1 548.75—1 962.95 mg/kg，鉛含量無顯著差異，變異最大的為P336×P63，變異系數(shù)為50.79%，變異最小的為P61×P63，變異系數(shù)為36.81%；鉛總量在1 644.51—2 431.42 μg，鉛總量也無顯著差異，變異最大的為P61×P63，變異系數(shù)為45.91%，變異最小的為P126×P63，變異系數(shù)為39.72%。

表7 雜交組合子代無性系(>3個)的鉛含量和鉛總量的變異

雖然雜交組合間的鉛積累特性無顯著差異，但對20個無性系的根、莖和葉的鉛含量以及鉛總量進行方差分析顯示：各無性系間存在較大的差異。

3 結(jié)論與討論

本研究中，鉛處理后柳樹的存活率、受害指數(shù)、生物量在供試8個雜交組合間均存在明顯差異，總體而言，P126×P585的存活率達到100%，受害指數(shù)低至3.70%，生物量為10.77 g，表現(xiàn)較好；而P1025×P63的存活率低至71.52%，受害指數(shù)高達53.47%，生物量也低至6.55 g，表現(xiàn)較差。

魏童等[14]的研究顯示，青楊的鎘富集能力在種群間和無性系間都存在明顯的變異性，表明可以通過開展種源/無性系選擇，選育出富集能力更高的基因型，從而提高植物修復(fù)的效率。Yang等[15]研究比較了12個柳樹無性系在50 μmol/L銅、鋅營養(yǎng)液中耐銅、鋅能力的變化，結(jié)果顯示柳樹對銅和鋅的耐性和積累量因無性系而異。本研究中鉛處理后柳樹根、莖和葉中的鉛含量和鉛總量在雜交組合間無顯著差異，但在無性系間存在顯著差異。由無性系的鉛含量變異性和分布可以看出，無性系間的變異很大，其中更能衡量富集能力的根中鉛含量最高的無性系為12號，達到3 498.3 mg/kg，根中鉛含量最低的無性系為16號，只有792.3 mg/kg。整株體內(nèi)鉛總量較高的有無性系23，35，28，40,12號，較低的有無性系16，22，51，11,4號。由此可見柳樹的鉛富集能力在無性系間存在明顯的變異性，這也顯示在良種選擇上可以直接在無性系水平上選擇。

本研究中的無性系43號，受害指數(shù)較低，為5.56%，體內(nèi)的鉛含量也較低，為828.67 mg/kg。這可能是因為該無性系在鉛脅迫下拒絕主動吸收對生長有害的鉛[16]，通過合成胼胝質(zhì)或Fe-Mn氧化膜等物質(zhì)來組織重金屬進入根系[17]，這些無性系被認為是較耐鉛的品種。而本試驗中的無性系12號和40號，其受害指數(shù)分別為2.08%和4.63%，但是其鉛含量卻高達3 498.33，2 943.67 mg/kg。這可能是由于該無性系主動吸收了鉛之后通過體內(nèi)螯合、儲存在體內(nèi)活性較弱的組織等手段使鉛對自身生長的危害降到最低[18]。這些無性系應(yīng)是鉛高積累品種，是適合大量提取環(huán)境中的鉛污染進行生物修復(fù)的專用品種，這為進一步研究其耐鉛和鉛積累機理及進行生物修復(fù)提供了材料。

本研究中參試無性系的葉部鉛含量和莖部鉛含量的高低并沒有表現(xiàn)出一致性。這與房娟[19]的研究不同，該研究認為根>莖>葉，可能是因為其參試無性系較少，只有垂柳和蘇柳172良種喬木柳，本試驗的無性系較多，為20個灌木柳無性系。到底是因為喬木柳和灌木柳的不同，還是無性系個數(shù)造成試驗結(jié)果的差異，還有待進一步試驗。

施翔等[20]的研究顯示Pb向地上部的轉(zhuǎn)移相對較少，根部是鉛在柳樹體內(nèi)存儲的主要庫。本研究顯示，灌木柳樹在受到鉛脅迫時，根部鉛總量占整株鉛總量的64.47%—91.28%，這就表明鉛主要積累在根部，而莖、葉中含量較少，這可能是由于Pb在根系主要以沉淀形式存在，如Pb3(PO4)2和PbCO3等，且重金屬大部分儲存在結(jié)構(gòu)栓化和木質(zhì)化的根表皮部[21]，因此很難向地上部進行長距離運輸[22]。在土壤鉛污染生物修復(fù)中，可以選擇鉛積累能力強的灌木柳樹無性系，通過蘸取生根劑等方法促進根系生長，在每年年底落葉前收割地上部分，從而減少枯枝落葉中的污染物回田，于第3年利用小型農(nóng)機翻耕土地收獲灌木柳樹根部，從而修復(fù)重金屬污染土壤，相應(yīng)縮短修復(fù)年限，這較其他木本植物具有較強的優(yōu)勢。