郭震華 黃翠紅 羅文龍 黃曉群 王瑞英 陳志強(qiáng) 關(guān)世武 張淑華 蔡麗君

摘要：為明確Pita及pik基因在黑龍江省水稻種質(zhì)資源中的分布情況，本研究以67份黑龍江省主栽品種及優(yōu)異種質(zhì)資源作為試驗(yàn)材料，通過HRM技術(shù)，利用Pita及pik的HRM功能型分子標(biāo)記Pita-G/T、Pik2-C/T，對(duì)67份材料進(jìn)行基因分型。結(jié)果表明，67份種質(zhì)中，含純合Pita有27份，占參試種質(zhì)的40.3%；純合pik有22份，占參試種質(zhì)的32.9%，同時(shí)含有兩基因的為12份，比例為17.9%。綜上，Pita-G/ T及Pik2-C/T標(biāo)記可以高效準(zhǔn)確地對(duì)黑龍江水稻資源進(jìn)行基因分型，同時(shí)，通過基因分型，明確了Pita及pik在黑龍江省的分布情況，為抗稻瘟病育種提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；高分辨率熔解曲線；Pita基因；pik基因；基因分型

中圖分類號(hào)：S326文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas20190900197

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“寒地早粳稻分子設(shè)計(jì)育種”（2016YFD0101801）；黑龍江省農(nóng)科院重大科研成果激勵(lì)項(xiàng)目“Pita等抗稻瘟病基因在寒地稻區(qū)的分布研究”（2018KYJL001）。

Detection of the Rice Blast Resistance Genes Pita and pik in Heilongjiang： HRM Functional Markers

Guo Zhenhua1，2， Huang Cuihong2， Luo Wenlong2， Huang Xiaoqun1， Wang Ruiying1， Chen Zhiqiang2， Guan Shiwu1， Zhang Shuhua1， Cai Lijun3（1Rice Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Jiamusi 154026， Heilongjiang， China；

2National Engineering Research Centre of Plant Space Breeding， Guangzhou 510642， Guangdong， China； 3Jiamusi Branches of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Jiamusi 154026， Heilongjiang， China）

Abstract： To clarify the distribution of Pita gene and pik gene in rice germplasm resources of Heilongjiang， 67 major varieties and excellent germplasm resources were used as materials with HRM （high resolution melting） technology. 67 materials were used for genotyping analysis by Pita-G/T and Pik2-C/T of Pita and pik HRMbased functional markers. The results showed that， among the 67 germplasm resources， 27 germplasm resources contained the homozygous gene Pita （40.3% of the total number）， 22 germplasm resources contained the homozygous gene pik （32.9% of the total number） and 12 germplasm resources contained both of the two homozygous genes （17.9% of the total number）. Based on the results， the functional markers Pita-G/T and Pik2-C/T could be efficiently and accurately used in rice genotyping in Heilongjiang， meanwhile， through genotyping the materials in this research， we clarified the distribution of those two genes in Heilongjiang， which provided a theoretical basis for rice blast resistance breeding.

Keywords： Rice； High Resolution Melting （HRM）； Pita Gene； pik Gene； Genotyping

0引言

稻瘟病是目前影響水稻最為嚴(yán)重的一種病害，每年可造成水稻減產(chǎn)11%～30%[1]，嚴(yán)重制約著水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。黑龍江省作為北方稻區(qū)的第一水稻大省，稻瘟病時(shí)有發(fā)生，危害嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)可造成減產(chǎn)15%～ 20%。稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea（hebert） barr（無性世代：Pyricularia grisea （cooke） Sacc）引起的[2]，在水稻整個(gè)生育期內(nèi)及各個(gè)部位均可發(fā)生，其中尤以葉瘟影響最為嚴(yán)重。

水稻抗稻瘟病基因的分析最早在日本于20世紀(jì)60年代展開，共鑒定了最初的8個(gè)抗性位點(diǎn)上的14個(gè)基因（JDCs，Japanese differential cultivars）。截至2011年2月，多于75個(gè)抗稻瘟病的主效基因已被克隆。其中，包含Pia、Pib、Pita、Pi2、Piz-t、Pi9、Pid2等共18個(gè)基因已被成功克?。–hina Rice Data Center ， http：// www. ricedata.cn/gene/gene_pi.htm）。

Pita作為水稻中第2個(gè)被克隆的抗稻瘟病主效基因，位于水稻第12染色體的近著絲粒區(qū)域，是一個(gè)抗譜比較廣的單拷貝顯性基因，在抗病品種和感病品種中都有較低的組成型表達(dá)[3]。Jia等[4]利用Pita的DNA序列上的多態(tài)性，開發(fā)的DNA顯性分子標(biāo)記YL155/ YL87和YL183/YL87，成功用于Pita基因的鑒定。Pik基因位于水稻第11染色體長(zhǎng)臂近末端區(qū)域，目前已發(fā)現(xiàn)含有5個(gè)等位基因，分別是Pik、Pikh、Pikm、Pikp和Piks[5]，其中Pikm、Pikp和Pik己被克隆。此3個(gè)基因都為NBS-LRR類抗病基因，且各自均由2個(gè)相鄰基因Pikm-1和Pikm-2；Pikp-1和Pikp-2；Pik-1和Pik-2共同作用表現(xiàn)出稻瘟病抗性[6-8]。

高分辨熔解曲線（high–resolution melting curve， HRM）技術(shù)作為近年來新興的一種基因分型技術(shù)，通過配套的軟硬件系統(tǒng)，可以快速自動(dòng)監(jiān)測(cè)DNA熔解曲線的變化，實(shí)現(xiàn)基因分型，分辨率可達(dá)單堿基差異，對(duì)SSR、SNP及Indel等不同類型變異有很好的區(qū)分效果[9]。由于不需要凝膠電泳等步驟，從而真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作[10]，避免污染的可能。該方法目前已在玉米[11]、大麥[12]及水稻[13]等農(nóng)作物中得到很好的應(yīng)用。羅文龍等[14]針對(duì)Pita基因中的G/T SNP位點(diǎn)及Pik、Pikm、Pikp基因中共同存在的C/T SNP，分別開發(fā)設(shè)計(jì)得到Pita及Pik的功能型HRM標(biāo)記Pita-G/T、Pik2-C/ T，已經(jīng)在水稻種質(zhì)基因篩選中得到了很好的應(yīng)用。筆者擬利用與抗稻瘟病基因Pik和Pita緊密連鎖的HRM分子標(biāo)記Pita-G/T、Pik2-C/T[14]，對(duì)黑龍江水稻種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，以期明確Pik和Pita基因在黑龍江水稻中的分布情況，為抗稻瘟病品種的合理利用及選育提供參考，為寒地水稻分子標(biāo)記輔助選擇育種（MAS）提供物質(zhì)保障和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

選取67份黑龍江省水稻主栽品種及優(yōu)異種質(zhì)資源為本研究供試水稻材料（見表1），由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯水稻研究所提供，于2014年種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯水稻研究所試驗(yàn)地中。

1.2方法

1.2.1水稻基因組DNA提取于水稻苗期對(duì)每份水稻材料分別隨機(jī)選取3株的新鮮葉片，等量混合，按照文獻(xiàn)[15]中使用的方法進(jìn)行DNA的提取。

1.2.2用于HRM分析的多重巢式PCR擴(kuò)增多重巢式PCR共包括以下兩輪擴(kuò)增反應(yīng)：

第一輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液5μL，外引物F/R （10μmoL/L）各0.3μL，基因組DNA 0.5μL，總體積10μL，ddH2O補(bǔ)足。PCR程序：95℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)95℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸10 s；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增程序在Gene-Amp9700型PCR儀（Applied Biosystems， USA）上進(jìn)行。

反應(yīng)結(jié)束后PCR管加200μL雙蒸水，稀釋第一輪產(chǎn)物。

第二輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液4μL，內(nèi)引物F/R （10μmoL/L）各0.3μL，第一輪稀釋PCR產(chǎn)物0.5μL，20×EvaGreen染料（Biotium， USA） 0.5μL，內(nèi)外標(biāo)樣各1μL，最后ddH2O補(bǔ)足10μL。擴(kuò)增程序在Gene- Amp9700型PCR儀（Applied Biosystems， USA）上進(jìn)行。PCR程序：95℃預(yù)變性2 min，22個(gè)循環(huán)95℃變性20 s，59℃退火20 s，72℃延伸10 s；最后95℃延伸2 min。

1.2.3利用LightScanner96系統(tǒng)HRM分析第二輪

PCR產(chǎn)物中加入20μL礦物油（SIGMA公司），將PCR產(chǎn)物離心轉(zhuǎn)移至HRM檢測(cè)板中，2000 r/min離心2 min，檢查無氣泡，放入LightScanner96高分辨率熔解曲線分析系統(tǒng)（Idaho Technology Inc， USA）進(jìn)行HRM檢測(cè)，起點(diǎn)溫度為60℃，終點(diǎn)溫度為95℃，平均15 min一板PCR反應(yīng)。反應(yīng)完成后通過配套的LightScanner Call-IT軟件進(jìn)行基因型分析，選用Small Amplicon模式進(jìn)行自動(dòng)化分析；利用LightScanner分析系統(tǒng)進(jìn)行HRM檢測(cè)。

用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物名稱、序列、位置及片段大小等詳細(xì)信息見表2。

2結(jié)果與分析

本研究即利用這2對(duì)功能型標(biāo)記，對(duì)黑龍江水稻種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型。通過兩輪的PCR反應(yīng)，擴(kuò)增終產(chǎn)物由于DNA雙鏈上突變位點(diǎn)的退火溫度（Tm值）不同，產(chǎn)生不同的峰值，從而區(qū)分不同基因型。

2.1 Pita在黑龍江水稻中的分布情況

Pita基因檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，灰色曲線為堿基為G的稻瘟病感性基因pita，而紅色曲線為堿基為T的稻瘟病抗性基因Pita?？梢钥闯?，Pita因T堿基氫鍵多于pita的G堿基，其退火溫度（Tm值）高于pita的，從而產(chǎn)生不同的峰值，區(qū)分不同基因型。根據(jù)不同材料出現(xiàn)的先后順序，確定出共有27份種質(zhì)含有純合的抗稻瘟病基因Pita，占參試種質(zhì)的40.3%，分別為‘龍粳12’、‘龍粳18’、‘五稻8’、‘哈99352’、‘哈99774’、‘龍盾D904’、‘龍稻92001’、‘佳禾早占’、‘松粳5’、‘墾04-488’、‘龍盾306’、‘綏05-6062’、‘龍粳29’、‘北粳0907’、‘龍粳31’、‘龍粳32’、‘龍粳香1號(hào)’、‘龍聯(lián)1號(hào)’、‘龍花07-211’、‘龍花04-350’、‘龍粳39’、‘龍交10-2917’、‘龍交10-989’、‘龍交103970’、‘龍豐09-291’、‘龍生02063-23’、‘zlm55-1’。其余40份為純合的pita基因?？梢?，Pita抗稻瘟病基因在黑龍江省有著較為廣泛的分布，對(duì)黑龍江省抗稻瘟病育種有著重要的作用。

2.2 pik在黑龍江水稻中的分布情況

灰色曲線表示稻瘟病感性基因Pik的DNA熔解曲線，紅色曲線為稻瘟病抗性基因pik的DNA熔解曲線。Pik由于含有C堿基位點(diǎn)，而pik含有T堿基，所以Pik的Tm值低于pik。結(jié)果表明，67份種質(zhì)中，22份種質(zhì)含有純合的抗稻瘟病基因pik，比例為32.9%，其余45份含純合的Pik基因。此22份種質(zhì)分別為，‘龍粳18’、‘墾94437’、‘五稻8’、‘哈99352’、‘哈99774’、‘五優(yōu)稻’、‘佳禾早占’、‘遼380’、‘松粳5’、‘綏05-6062’、‘龍粳38’、‘龍粳29’、‘空育139’、‘龍粳香1號(hào)’、‘龍花07-211’、‘中龍香粳1號(hào)’、‘糯11-4058’、‘龍交10-989’、‘龍交10-2921’、‘龍豐09-757’、‘龍豐09-291’、‘zsh2907-1’。可見，pik抗稻瘟病基因在黑龍江省分布也較為廣泛，同樣可以很好地應(yīng)用于稻瘟病抗性育種中。

2.3 Pita及pik在黑龍江水稻中共同的分布情況

通過上述分析可以得出，‘龍粳18’、‘五稻8’、‘哈99352’、‘哈99774’、‘佳禾早占’、‘松粳5’、‘綏05-6062’、‘龍粳29’、‘龍粳香1號(hào)’、‘龍花07-211’、‘龍交10-989’及‘龍豐09-291’共12份種質(zhì)同時(shí)含有Pita及pik兩種稻瘟病抗性基因，占參試種質(zhì)的17.9%。

3結(jié)論與討論

基于黑龍江省稻瘟病害頻發(fā)，且危害性大等特點(diǎn)，水稻抗稻瘟病育種一直以來都是研究的熱點(diǎn)。而目前多數(shù)的分子標(biāo)記輔助育種多集中在常規(guī)PCR手段上，而常規(guī)PCR技術(shù)需要通過凝膠電泳等步驟，實(shí)驗(yàn)步驟多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率偏低。而且輔助選擇主要依賴于與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記進(jìn)行，存在假陽性的概率較大。隨著分子標(biāo)記輔助選擇在育種中的廣泛應(yīng)用，各類分子標(biāo)記不斷出現(xiàn)，而最為準(zhǔn)確的是基于抗性基因本身的序列差異開發(fā)的分子標(biāo)記，稱為功能標(biāo)記（FMs），能夠直接反映目標(biāo)性狀的表型，有效避免由于重組引起的遺傳信息的丟失，對(duì)FMs的篩選即能對(duì)性狀進(jìn)行篩選[16-18]。HRM技術(shù)與常規(guī)PCR技術(shù)區(qū)別主要在于不再需要凝膠電泳步驟，直接對(duì)PCR產(chǎn)物在管中進(jìn)行分析，減少實(shí)驗(yàn)步驟，大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)降低了實(shí)驗(yàn)可能存在的污染率。利用該技術(shù)開發(fā)的功能標(biāo)記已在玉米[11]、小麥[19]、大麥[12]及水稻[13]等農(nóng)作物中都已成功應(yīng)用。因此，本研究所用到的Pita-G/ T及Pik2-C/T標(biāo)記是針對(duì)基因本身內(nèi)部SNP位點(diǎn)，利用HRM技術(shù)開發(fā)得到的，一方面作為功能基因標(biāo)記，可以準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)種質(zhì)間存在的基因差異，同時(shí)，基于HRM技術(shù)，又實(shí)現(xiàn)了高效快速的優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)行大規(guī)模的基因分型及篩查，大大提高了基因檢測(cè)及標(biāo)記輔助選擇的效率。

針對(duì)水稻品種稻瘟病抗性而言，單個(gè)基因的抗性可能會(huì)隨著病原菌生理小種的變化在幾年內(nèi)逐漸喪失，因此通過聚合育種的方法將多個(gè)稻瘟病抗性基因?qū)胪黄贩N中，即可抵抗多種生理小種的侵害，從而達(dá)到廣譜抗性的目的。本研究中‘龍粳29’、‘龍粳香1號(hào)’、‘龍花07-211’等12份種質(zhì)同時(shí)聚合Pita及pik抗性基因，對(duì)稻瘟病各生理小種有著較為廣泛的抗性，為抗稻瘟病育種研究提供了有利的種質(zhì)資源。而本研究中所用的資源材料相對(duì)仍偏少，為了更好的鑒定分析Pita及pik在黑龍江水稻中的分布情況，需擴(kuò)大鑒定材料的范圍，更加廣泛的搜集黑龍江水稻種質(zhì)資源材料，豐富和完善Pita及pik在黑龍江水稻中的分布情況。

目前已定位的主效抗稻瘟病基因中，一半以上是以基因簇的形式存在于水稻各染色體上。Pita基因作為已克隆的顯性單拷貝基因，與Pita2等許多其他抗病基因緊密連鎖，使得該基因具有廣譜抗性，在水稻育種研究及生產(chǎn)上有著較高的實(shí)用價(jià)值[20]。而目前已知的在Pik基因位點(diǎn)上有5個(gè)等位基因，廣泛分布在水稻品種中，具有良好的廣譜抗性。而本研究中通過2個(gè)功能性分子標(biāo)記Pita-G/T及Pik2-C/T對(duì)黑龍江部分水稻主栽品種及種質(zhì)資源展開基因分型，雖然明確了2個(gè)基因在這些材料中的分布情況，但仍需明確細(xì)化各基因的等位基因的具體分布情況。此外，在基因分型的同時(shí)，與之相對(duì)應(yīng)的稻瘟病抗性的表型也需要調(diào)查，以此與基因型進(jìn)行相互印證。

黑龍江省作為北方稻區(qū)水稻第一大省，稻瘟病一直以來是嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量的第一大病害。對(duì)部分黑龍江主栽品種及優(yōu)異種質(zhì)資源的Pita及pik基因的分型鑒定，結(jié)果表明，67份種質(zhì)中，含純合Pita有27份，占參試種質(zhì)的40.3%；純合pik有22份，占參試種質(zhì)的32.9%，同時(shí)含有兩基因的為12份，分別為龍粳18’、‘五稻8’、‘哈99352’、‘哈99774’、‘佳禾早占’、‘松粳5’、‘綏05-6062’、‘龍粳29’、‘龍粳香1號(hào)’、‘龍花07-211’、‘龍交10- 989’及‘龍豐09- 291’，占參試材料的17.9%?？梢?，Pita及pik基因在黑龍江分布較廣，對(duì)抗稻瘟病品種的選育及抗病基因的合理利用有著重要的參考價(jià)值。

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