王雯麗 曾慶超 李燕 夏博 黃林祥 吳元華 王琦

摘要：為獲得對煙草赤星病菌具有較好生防效果的芽胞桿菌，從福建、山東、云南等地?zé)煵萑~片中分離得到187株菌株，對煙草種子進(jìn)行浸種處理，通過測定發(fā)芽率篩選到能夠促進(jìn)種子萌發(fā)的6株菌株;利用平板拮抗法、離體葉片接種法、溫室生測發(fā)現(xiàn)FJ1、FJ-6能促進(jìn)煙草生長且對赤星病防效較好;通過生理生化和分子生物學(xué)鑒定，F(xiàn)J1為萎縮芽胞桿菌（Bacillus atrophaeus），F(xiàn)J6為貝菜斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。防病特性研究發(fā)現(xiàn)，兩菌株含有參與脂肽類抗生素Surfactin、Fengycin和Iturin合成的基因且脂肽類粗提物對赤星病菌絲生長有明顯的抑制作用，抑制率分別為59%、650%。綜上FJ、FJ1-6具有優(yōu)良的促生防病特性及顯著的促種子萌發(fā)效應(yīng)，可應(yīng)用于煙草育苗及赤星病的防治

關(guān)鍵詞：煙草赤星病;篩選;芽胞菌;生物防治

煙草（Nicotiana tabacumI.）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。近年來，煙草病害的不斷發(fā)生，給煙農(nóng)帶來的經(jīng)濟(jì)損失不容小覷。其中，煙草赤星病（Alternaria alternata）是我國煙葉生產(chǎn)中的主要葉部病害，危害較重。據(jù)調(diào)査該病給我國煙葉帶來的影響位居第二，僅次于病毒病。該病主要發(fā)生在成熟期，一且發(fā)生便會迅速擴(kuò)展，嚴(yán)重降低煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量。目前煙草赤星病主要采用化學(xué)防治，但化學(xué)藥劑長時間施用病菌易產(chǎn)生抗藥性，降低防效且污染環(huán)境，生長后期施用還會出現(xiàn)藥劑殘留，影響煙葉品質(zhì)。目前利用生防菌預(yù)防煙草赤星病發(fā)生并減輕危害的研究已有報道。如DEBORAHE從煙草葉面上分離篩選得到的Bacillus cereus subsp.myeoidei能有效防治煙草赤星病害。羅楚翔等從土壤中分離得到對煙草赤星病菌拮抗作用極強(qiáng)的芽胞杄菌K。李安娜等從煙草葉圍和根際分離篩選到B102對煙草赤星病的拮抗作用顯著，抑菌帶寬度達(dá)13mm。

芽胞桿菌（Bacillus spp）作為一種最為常見的生防細(xì)菌，含有內(nèi)生芽孢，具有較好的抗逆能力，生長較快，容易在環(huán)境中存活，有利于菌劑的生產(chǎn)運(yùn)輸和儲存1，是生物防治的重要菌種。本研究以煙草赤星病為靶標(biāo)病害，從煙草葉片內(nèi)分離篩選對煙草赤星病有較好防治效果的芽胞桿菌，并對其生防機(jī)制進(jìn)行探究，以期為該病害生物制劑的開發(fā)提供有效的菌種資源，最終能在大田得到推廣應(yīng)用。

1材料與方法

1.1試驗材料、時間

煙葉采集自福建、山東、云南等地?zé)煵莓a(chǎn)區(qū)健康煙草植株，煙草赤星病菌株（Alternaria alternata）由貴州煙草科學(xué)研究院惠贈。

試驗于2019年5月-2020年1月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治與微生態(tài)實驗室進(jìn)行。

1.2試驗方法

1.2.1活性物質(zhì)的制備菌液、上清液、菌懸液的制備參考文獻(xiàn)[13]

1.2.2菌株的分離分離前對煙草葉片表面進(jìn)行消毒，將煙葉充分研磨，用滅菌水梯度稀釋，稀釋液于80℃水浴20min以殺死大部分耐熱性差的細(xì)菌。水浴后將各個梯度的稀釋液吸取100uL涂布于TSA培養(yǎng)基上，挑取生長性狀不同的單菌落純化培養(yǎng)，甘油保存。

1.2.3菌株的篩選（1）促生菌株的篩選將消毒后的煙草種子用菌液（10°CFU/ml）浸泡20min，以無菌培養(yǎng)液為對照，每個處理50粒。放于培養(yǎng)皿中，25℃保濕培養(yǎng)，4d后測出芽率。出苗后用菌液、上清液以及菌懸液進(jìn)行灌根，無菌培養(yǎng)液作為空白對照。每次間隔7d，并且在最后一次處理7d后測量株高。

（2）防病菌株的篩選利用平板對峙培養(yǎng)法，在生長較好的赤星病菌邊緣打取菌，放于PDA培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng)24h后，在距菌餅2cm處接1L菌液，用無菌培養(yǎng)液作為空白對照，放于28℃培養(yǎng)。當(dāng)對照長滿平板時，觀察處理的抑菌效果并計算抑菌率。

采用離體葉片法，將菌液調(diào)至10°CFU/mL，均勻噴酒在健康葉片上，無菌培養(yǎng)液作為空白對照，靜置4h晾干。在消毒后的發(fā)芽盒中放入兩張濾紙，用無菌水浸濕，將葉片正面朝上放入，刺傷，接種濃度為2×10°個/mL的赤星病菌孢子懸浮液，盡量避開葉脈，每片接6滴，每滴20L。發(fā)芽盒用保鮮膜覆蓋扎孔，放置在25℃，人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，每日照光16h。觀察病害發(fā)生情況并記錄病害嚴(yán)重程度1。

1.2.4生防菌株的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定：將1.2.3中篩選到的FJl、FJ1-6在LB培養(yǎng)基上活化，于37℃條件下培養(yǎng)至菌落長出。觀察單菌落的形態(tài)特征，主要包括大小、形狀、顏色、光澤度等;搖培菌液用結(jié)晶紫染色，觀察菌體形態(tài)。生理生化鑒定：參考文獻(xiàn)[16-17]，對菌株進(jìn)行一系列生理生化測定，確定其分類地位。根據(jù)生物學(xué)特性測定生防菌株FJ、FJ1-6的生長曲線。分子生物學(xué)鑒定：①菌株基因組DNA的提?。旱鞍酌窼DS法提取。②16SrDNA、grB基因片段的PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系（25uL）。③瓊脂糖凝膠電泳檢測，若條帶正確，將PCR產(chǎn)物送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序（表1）。

1.2.5抑菌物質(zhì)檢測（1）測定代謝粗提物對赤星病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用：將濃度為2×10°個/mL的孢子懸浮液和稀釋1倍、10倍、100倍的代謝粗提物濾液11混合加入試管中，以無菌培養(yǎng)液為空白對照。28℃培養(yǎng)12h，顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，以芽管長度超過分生孢子小端直徑半為準(zhǔn)，每次觀察100個分生孢子，并計算抑制率。

抑制率（%）=（對照萌發(fā)量-處理萌發(fā)量）/對照萌發(fā)量×100%

（2）脂肽類抗生素相關(guān)基因鑒定：以菌株FJ、FJ1-6的DNA為模板，用引物srfA-F/R、fenA-F/R、fenB-FR、iuA-FR擴(kuò)增Surfactin、Fengycin、Iturin脂肽類化合物合成相關(guān)基因（表2），擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂

糖凝膠電泳檢測。PCR反應(yīng)體系同上。

（3）脂肽類粗提物對赤星病菌的抑制作用：采用脂肽類粗提物涂布法測定粗提物對煙草赤星病菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響。吸取200μL粗提物涂布于PDA培養(yǎng)基，用提取液甲醇為空白對照，中央接赤星病菌併，28℃條件下培養(yǎng)。待CK長滿平板時，測量不同處理的菌落直徑。顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢數(shù)量并計算抑制率。

抑制率（%）=（對照生長量-處理生長量）對照生長量×100%

結(jié)果

2.1菌株的分離和篩選

從福建、山東和云南等地?zé)熑~內(nèi)共分離得到187株菌株。經(jīng)催芽試驗檢測，得到6株能夠顯著提高煙草種子出芽率的菌株。進(jìn)一步經(jīng)溫室生測，發(fā)現(xiàn)FJ和FJ1-6兩菌株的菌液、上清及菌懸液均能顯著促進(jìn)煙草生長（圖1）。其中，菌液的促生效果最好（圖2）。將篩選出的6株菌株進(jìn)行平板抑菌效果檢測，發(fā)現(xiàn)株菌FJI和FJ1-6對煙草赤星病菌具有顯著拮抗效果，抑菌帶均在5mm以上（圖3）。采用離體葉片法對菌株FJ和FJ-6進(jìn)行防病效果檢測，結(jié)果表明，對照發(fā)病較為明顯，有黃褐色的赤星病斑生成，葉背面病斑明顯，直徑均在3mm以上（圖4）。

2.2生防菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定（圖5）：FJ1單菌落扁平為黃白色，表面微微皺起有粘性，中間有一圈凸起，邊緣不規(guī)則，呈齒狀;菌體較小、短杄狀。FJ1-6單菌落為濁白色，表面不光滑有粘性，中間有一圈凸起，邊緣不整齊;菌體杄狀。

生理生化鑒定：根據(jù)模式菌株Bacillus subtilis168的主要生理生化性狀（表3），并結(jié)合文獻(xiàn)[16-17]進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)菌株FJl、FJ-6的生理生化性狀與Bacillus subtil一致，而枯草芽胞桿菌的近種有Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus licheniformisBacillus atrophaeus，因此還需進(jìn)一步做分子鑒定。根據(jù)生物學(xué)特性測定生防菌株FJ1、FJ-6的生長曲線，發(fā)現(xiàn)兩株菌的生長曲線均符合芽胞菌生長規(guī)律（圖6）。分子生物學(xué)鑒定：對FJl、FJ1-6菌株的16SrDNA、grB基因序列進(jìn)行測序分析。將拼接序列在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，利用MEGA軟件建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定菌株的分類學(xué)地位。比對結(jié)果表明，菌株與Bacillusspp有較高的同源性。但研究報道，16SIDNA僅能將菌株準(zhǔn)確定位到屬。因此，初步判定2株菌為芽胞菌屬（Bacillus spp.）圖7）。進(jìn)一步對2株菌的grB基因進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)FJ與Bacillus atrophaeus同源性較高，F(xiàn)J-6與Bacillus velezensis同源性較高（圖8）。綜合生理生化及分子生物學(xué)分析，確定2株菌的分類學(xué)地位：FJ為Bacillusatrophaeus，F(xiàn)J1-6為Bacillus velezensis。

2.3菌物質(zhì)檢測

脂肽類物質(zhì)相關(guān)基因鑒定結(jié)果表明（圖9），芽胞桿菌FJ含有參與抗生素Surfactin和Fengycin合成的基因sr和enA;而芽胞桿菌FJ-6含有參與抗生素Surfactin、Iturin和 Fengycin合成的基因s、i和emAB，可能產(chǎn)生這些基因編碼的脂肽。

脂肽類粗提物對赤星病菌的抑制作用結(jié)果表明（圖10），生防菌FJ1、FJ6脂肽類粗提物對煙草赤星病菌絲有明顯的抑制作用，且FJ-6的抑制作用更強(qiáng)，抑制率分別為56.9%、65.0%由圖11可看到，經(jīng)菌株脂肽類粗提物處理過的菌絲與對照相比胞壁加厚、顏色較深、表面粗糙且多為畸形膨大呈念珠狀且產(chǎn)孢量明顯減少。

代謝粗提物對分生孢子萌發(fā)的影響由表4可知菌株FJ和FJ1-6可產(chǎn)生抑制煙草赤星病菌分生孢子萌發(fā)的物質(zhì)，且抑制作用隨濃度的升高而增大。

3討論

目前，已報道的生防菌大多來源于壤。相對于非寄主來源的微生物，內(nèi)生細(xì)菌本就源自寄主可在植物內(nèi)部與病原菌進(jìn)行空間、營養(yǎng)競爭，調(diào)控植物產(chǎn)生植物激素、抗生素等多種活性物質(zhì)，抑制病原菌的繁殖，能更好地防治病害，因而內(nèi)生抗細(xì)菌逐漸受到生物防治的青2。易龍等篩選出對煙草赤星病菌（A.alternata）有較強(qiáng)拮抗作用的葉片內(nèi)生菌株Ib162。周崗泉等2從煙草種子中分離出對青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）防治效果高達(dá)95%的內(nèi)生細(xì)菌。本研究針對煙草赤星病，篩選了兩株具有防病和促生作用的菌株，研究結(jié)果表明篩選的菌株在平板對峙及溫室條件下都有良好的防治效果。MARTIN等2報道盡管生防菌有很強(qiáng)的抑制作用，但是環(huán)境條件的改變能夠影響生防菌對病害的防治效果。生防菌的防治效果還可能受到微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。因此，對于所篩選的菌株是否是一株有效的生防菌株，后續(xù)還需要在自然環(huán)境條件下進(jìn)行試驗驗證。

在生物防治中，芽胞桿菌備受大家關(guān)注。芽胞桿菌是一類好氧和兼性厭氧菌，是植物微生態(tài)中的優(yōu)勢微生物種群，易培養(yǎng)、易保存。此外，芽胞桿菌還可以產(chǎn)生多種具有抗菌活性的代謝物，防病抗逆和定殖能力強(qiáng)，相比之下開發(fā)成菌劑更易發(fā)揮作用2，許多優(yōu)良菌株已成功應(yīng)用于植物病害的生物防治252。本試驗從煙草葉片中分離出2株拮抗細(xì)菌，經(jīng)16SIDNA和gB基因序列鑒定為萎縮芽胞桿菌（Batrophaeus）和貝菜斯芽胞桿菌（B.velezensis）。16SIDNA基因序列普遍應(yīng)用于細(xì)菌鑒別或構(gòu)造細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。但鑒于序列間過高的相似度，此方法難區(qū)別親緣關(guān)系接近的菌種，只能初步判定菌株為芽胞杄菌屬。近幾年研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合mA和grB基因鑒定可以彌補(bǔ)這一缺陷，因此在BLAST對比結(jié)果中，挑選了許多基因序列相似性在90%以上的菌株當(dāng)作分析目標(biāo)進(jìn)一步確定菌株FJ1和FJ-6的分類地位。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多芽胞桿菌完成了全基因組測序，使得芽胞杄菌全基因組信息日益豐富的同時也進(jìn)一步完善了芽胞菌的分類鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)。已有的文獻(xiàn)報道，菌株經(jīng)過16和生化性狀鑒定為Bsbis，后續(xù)利用全基因組序列對菌株進(jìn)行重新鑒定，菌株屬于B.amyloliquefaciens2。也有大量的文獻(xiàn)報道，同一屬中菌株的平均核苷酸一致性低于95%。例如，菌株B.cereusAR156雖然被命名為B.cereus，但是其與其他B.cereus菌株的平均核苷酸一致性低于95%2;在其他屬的菌株中也有相關(guān)的文獻(xiàn)報道，例如Pseudomans virid laval?；谏鲜龅奈墨I(xiàn)報道，本研究雖然結(jié)合了生理生化和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行菌株鑒定，鑒定結(jié)果是否準(zhǔn)確我們還需要采取深入的分析。

兩株芽胞杄菌防治赤星病的機(jī)理目前尚不明確，可能和它產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有關(guān)。芽胞桿菌能夠產(chǎn)生的脂肽類抗菌物質(zhì)主要有Iturin、surfactin fengycin三大類。其中，對真菌具有強(qiáng)烈抑制作用的主要是Iturin和fengycin sli Iturin具有抗菌譜廣低毒、低殘留和低過敏性等特點(diǎn)，其抗菌機(jī)制是同時作用于病原菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜;而fengycin的作用機(jī)理是影響真菌細(xì)胞膜的表面張力，導(dǎo)致微孔的形成、K*及其他重要離子的滲透，最后引起細(xì)胞死亡。兩者都是潛在的具有極大開發(fā)應(yīng)用價值的生物農(nóng)藥。劉郵洲等研究發(fā)現(xiàn)萎縮芽胞杄菌YL3的脂肽類粗提物中含有表面活性素和泛革素，具有較好的生防應(yīng)用潛力。IU等發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌H3能產(chǎn)生表面活性素，對多種病原菌具有明顯的拮抗作用。本研究結(jié)果表明菌株FJ和FJ1-6基因組中含有uin和Fengycin合成的基因。但是，我們不能明確斷定該菌株一定能夠產(chǎn)生這兩種類型的脂肽類抗生素。在后續(xù)的研究中，應(yīng)結(jié)合基因組學(xué)和代謝組學(xué)深入解析該菌株中脂肽類抗生素基因簇的組成及代謝物的種類等。進(jìn)一步明確這幾種脂肽類抗生素在防治煙草病害中的作用以及不同抗生素之間對抑制病害的關(guān)系。

4結(jié)論

本試驗篩選出的兩株芽胞桿菌FJ（Bacillus atrophaeus）Fj1-6（Bacillus velezensis）不僅能促進(jìn)煙草的生長與發(fā)育，而且對煙草赤星病有較好的防效。菌株產(chǎn)生的次生代謝物可抑制煙草赤星病菌分生孢子的萌發(fā)，致使菌絲畸形、產(chǎn)孢量械少從而抑制葉片病斑的擴(kuò)展;脂肽類抑菌物質(zhì)對煙草赤星病菌絲生長的抑制率高達(dá)65.0%，具有較好的生防應(yīng)用前景，為煙草赤星病的生物防治提供了新的菌種資源。

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