孫 科 耿鳳英 于秋菊 王 鋒

（徐州生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥品食品學(xué)院，江蘇徐州 221006）

牛蒡（Arctium lappaL.）為菊科牛蒡?qū)僦参?，是一種典型的藥食同源植物（徐孝梁，2015），具有降血壓、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等作用（伏卉等，2015）。中國(guó)牛蒡產(chǎn)量居世界第一（趙凱 等，2015），而徐州市豐縣的牛蒡種植面積大約占全國(guó)種植面積的70%，因此，徐州豐縣有“牛蒡之鄉(xiāng)”之稱（任媛媛 等，2016）。

磷是牛蒡生長(zhǎng)發(fā)育重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一。雖然土壤中含磷量較高，但95%以上的磷元素是以植物體不能吸收的方式存在的（閆小梅 等，2015）。因此，要滿足牛蒡生長(zhǎng)對(duì)磷的需求就要靠施用磷肥，而磷肥的施用不僅增加生產(chǎn)成本，還容易造成土壤、水體等環(huán)境的污染（劉文干 等，2012）。在土壤中存在一些微生物利用自身的代謝功能，把土壤中植物不能利用的磷轉(zhuǎn)化為植物可以利用的磷，人們稱其為解磷微生物或解磷菌（phosphatesolubilizing microorganisms）（趙越 等，2013）。國(guó)家提倡建立資源節(jié)約型、環(huán)境友好型可持續(xù)發(fā)展的農(nóng)業(yè)（銀婷婷 等，2015），解磷菌成為現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)的研究熱點(diǎn)之一（史國(guó)英 等，2015）。目前，有關(guān)解磷微生物菌肥研究較多，但是針對(duì)牛蒡?qū)Ｓ脧?fù)合微生物有機(jī)肥的研究還鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)從牛蒡根際土壤分離篩選解磷菌并通過16S rDNA 進(jìn)行菌種鑒定和解磷條件優(yōu)化，為牛蒡?qū)Ｓ糜袡C(jī)肥提供解磷微生物菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 通過5 點(diǎn)取樣法在徐州市豐縣牛蒡標(biāo)準(zhǔn)化種植基地采集牛蒡根際5～15 cm深土壤樣本，裝入無菌牛皮紙袋密封。

1.1.2 試 劑 濃H2SO4、Na2CO3、Ca3（PO4）2、NaCl、MnSO4、（NH4）2SO4、MgSO4、FeSO4、KCl、KH2PO4、葡萄糖（分析純）購(gòu)自格里斯（天津）醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司；酵母浸膏、酵母粉、蔗糖、瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；升汞（試劑級(jí)）購(gòu)自廣州達(dá)威化工有限公司；二硝基酚、溴酚藍(lán)購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司；（NH4）6Mo7O24·H2O（分析純）購(gòu)自杭州邦易化工有限公司；KSbOC4H4O6·1/2H2O（分析純）購(gòu)自廣州市錦源化學(xué)有限公司；C6H8O6（抗壞血酸）（分析純）購(gòu)自無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 改良PVK 固體培養(yǎng)基：Ca3（PO4）25.0 g·L-1，NaCl 0.2 g·L-1，MnSO40.002 g·L-1，（NH4）2SO40.5 g·L-1，MgSO40.1 g·L-1，F(xiàn)eSO40.002 g·L-1，KCl 0.2 g·L-1，葡萄糖10.0 g ·L-1，瓊脂18 g·L-1，雙蒸水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

改良PVK 液體培養(yǎng)基：在改良PVK 固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上去掉瓊脂。

NBRIP 固 體 培 養(yǎng) 基：NaCl 0.2 g·L-1，Ca3（PO4）25.0 g·L-1，MgSO40.1 g·L-1，（NH4）2SO40.5 g·L-1，蔗糖 15.0 g·L-1，瓊脂 18 g ·L-1，雙蒸水1 000 mL，pH 值6.8～7.0。

NBRIP 液體培養(yǎng)基：在NBRIP 固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上去掉瓊脂。

LB 液體培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g·L-1，酵母提取物 5.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，雙蒸水1 000 mL，pH 值6.8～7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

VD-850 臺(tái)式超凈工作臺(tái)（杭州旭清科技有限公司），XW-80A 漩渦混合器（廣森實(shí)驗(yàn)器材有限公司），BX43/53 生物顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司），HZ-124/85S 半微量電子天平（上海諾宣科學(xué)儀器有限公司），LH-PYX3M 生化培養(yǎng)箱（常州金南儀器制造有限公司），HNY-200B 恒溫?fù)u床（上海喬躍電子科技有限公司），TDZ4 離心機(jī)（青島諾凱達(dá)機(jī)械制造有限公司），UV2800S 紫外分光光度計(jì)（上海力辰儀器科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 解磷菌富集培養(yǎng) 在裝有100 mL 滅過菌的改良PVK 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中加入1 g土壤，置于恒溫?fù)u床28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)。36 h 后，取10 mL 培養(yǎng)液接種于100 mL 滅過菌的改良PVK 液體培養(yǎng)基繼續(xù)富集培養(yǎng)；連續(xù)富集培養(yǎng)3 次。

1.3.2 解磷菌初篩 取富集培養(yǎng)菌液，采用平板涂布的方法接種于改良PVK 固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)60 h。挑選帶有透明圈的菌落，通過劃線的方法進(jìn)行菌株的分離純化。重復(fù)以上操作3～5 次，得到產(chǎn)生透明圈的解磷菌純菌落，并測(cè)量記錄菌落直徑（d）及透明圈直徑（D）。選擇D/d 值較大的菌落，斜面保藏備用。

1.3.3 解磷菌復(fù)篩 將1.3.2 初篩挑選出的菌株接種到改良PVK 液體培養(yǎng)基上，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)20 h 后，每隔2 h 取樣涂平板檢查活菌數(shù)。當(dāng)活菌數(shù)達(dá)到1×108CFU·mL-1，取5 mL 菌液接種于50 mL 滅過菌的NBRIP 液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)5 d。5 d 后轉(zhuǎn)接入滅菌離心管中，10 000 r·min-1離心20 min，取上清液；采用鉬銻抗比色法進(jìn)行可溶性磷含量的測(cè)定，同時(shí)利用pH 計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH 值。每株進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，以滅完菌但沒接種的NBRIP 液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

1.3.4 解磷菌的土壤試驗(yàn) 在直徑25 cm 的培養(yǎng)盆中裝入新鮮牛蒡田土壤5 000 g 和100 g 處理過的檸檬酸發(fā)酵廢渣，加入復(fù)篩后的解磷菌發(fā)酵液500 mL，以添加500 mL 無菌水為空白對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)30 d。30 d 后以去離子水處理試驗(yàn)土壤制備土壤懸液，采用鉬銻抗比色法測(cè)定可溶性磷含量。設(shè)3次平行試驗(yàn)。

1.3.5 解磷菌株的鑒定 形態(tài)觀察：借助BX43 生物顯微鏡油鏡進(jìn)行菌株的形態(tài)特征觀察，在NBRIP固體培養(yǎng)基上觀察菌落特征。

生理生化特性鑒定：生理生化特性鑒定參考文獻(xiàn)（Bashan et al.，2013；Liu et al.，2014）的方法。

16S rDNA 序 列 分 析（Vassilev et al.，2012）：利用北京Solarbio 公司細(xì)菌基因組提取DNA 試劑盒提取純化的菌株DNA。使用通用引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采 用PCR 法克隆菌株基因組DNA 的16S rDNA 基因。PCR 反應(yīng)體系20 μL：10×PCR 緩沖液2 μL，模板DNA 20 ng，dNTPs（10 mmol·L-1）0.45 μL，上、下游引物（20 μL·L-1）各0.25 μL，TaqDNA 聚合酶0.4 μL，加ddH2O 至終體積。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min?；厥窄傊悄zPCR 克隆片段，送至南京世和基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用Mega 6 軟件進(jìn)行發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.3.6 解磷菌株解磷能力測(cè)定 采用鉬銻抗比色法進(jìn)行可溶性磷含量的測(cè)定（Mehta et al.，2013；Zeng et al.，2017）。

1.3.7 溫度對(duì)菌株解磷的影響 把培養(yǎng)的菌液以2%的接種量接種到含有100 mL NBRIP 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，分別放于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，180 r·min-1培養(yǎng)3 d，每個(gè)溫度進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后采用鉬銻抗比色法進(jìn)行可溶性磷含量的測(cè)定。

1.3.8 初始pH 值對(duì)菌株解磷的影響 把培養(yǎng)的菌液以2%的接種量接種到含有100 mL NBRIP 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，NBRIP 液體培養(yǎng)基初始pH 值分別為2、3、4、5、6、7、8、9，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中，180 r·min-1培養(yǎng)3 d，每個(gè)初始pH 值進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后采用鉬銻抗比色法進(jìn)行可溶性磷含量的測(cè)定。

1.3.9 鹽濃度對(duì)菌株解磷的影響 把培養(yǎng)的菌液以2%的接種量接種到含有100 mL NBRIP 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，NBRIP 液體培養(yǎng)基鹽濃度（NaCl 濃度）分別為3、6、9、12、15、18、21、24 g·L-1，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，180 r·min-1培養(yǎng)3 d，每個(gè)鹽濃度進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后采用鉬銻抗比色法進(jìn)行可溶性磷含量的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌初篩

把通過3 次富集培養(yǎng)的菌液進(jìn)行平板涂布，共獲得61 株菌株，其中具有明顯透明圈（溶磷圈）的菌株24 株，即具有解磷能力菌株24 株，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)PSM-1～PSM-24。對(duì)菌落直徑（d）和透明圈直徑（D）進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算比值（D/d）。從表1 可以看出，菌株P(guān)SM-1、PSM-2、PSM-5、PSM-9、PSM-14、PSM-15、PSM-17、PSM-22 和PSM-24 的D/d 值較大，都大于1.5。說明這9 株菌株的解磷能力較強(qiáng)，作為出發(fā)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 解磷菌復(fù)篩

2.2.1 解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量測(cè)定 將初篩挑選出來的9 株D/d 值大于1.5 的解磷菌作為復(fù)篩的出發(fā)菌株，按1.3.3 的方法復(fù)篩。9 株解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量如圖1 所示?？梢钥闯? 株解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量均顯著高于對(duì)照，表明復(fù)篩的9 株解磷菌解磷能力較強(qiáng)。特別是PSM-5菌株培養(yǎng)液中可溶性磷含量達(dá)到198.28 mg·L-1，PSM-22 菌株培養(yǎng)液中可溶性磷含量達(dá)到173.58 mg·L-1，PSM-9 菌株培養(yǎng)液中可溶性磷含量達(dá)到了166.43 mg·L-1，挑選這3 株菌株進(jìn)一步進(jìn)行小范圍的土壤試驗(yàn)。

表1 解磷菌菌落直徑（d）、溶磷圈直徑（D）和D/d 值

2.2.2 復(fù)篩解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量與初篩解磷菌D/d 值的相關(guān)性 對(duì)解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量和解磷菌溶磷圈直徑（D）與解磷菌菌落直徑（d）比值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖2 所示?？梢钥闯觯篟=0.988 5、P＜0.05，解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量和D/d 值呈顯著的正相關(guān)性。也就是說D/d值越大，解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量越高。

2.2.3 解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量與培養(yǎng)液pH值的相關(guān)性 從圖3 可以看出，9 株解磷菌培養(yǎng)液和對(duì)照pH 值的大小順序?yàn)椋篊K ＞PSM-2 ＞PSM-1 ＞PSM-15 ＞PSM-17 ＞PSM-24 ＞PSM-14 ＞PSM-9 ＞PSM-22 ＞PSM-5，9 株解磷菌培養(yǎng)液的pH 值均顯著低于對(duì)照。對(duì)比圖1 可以看出，培養(yǎng)液pH 值大小順序和可溶性磷含量大小順序正好相反，即解磷能力強(qiáng)的菌株產(chǎn)酸能力也強(qiáng)。

對(duì)9 株解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量與pH值進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖4 所示?？梢钥闯觯篟=-0.986 1、P＜0.05，解磷菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量與pH 值之間具有顯著的負(fù)相關(guān)性。即解磷菌解磷能力越強(qiáng)，產(chǎn)酸能力也越強(qiáng)；解磷菌解磷能力弱，產(chǎn)酸能力也差。原因可能是解磷菌在代謝過程中產(chǎn)生某些酸性物質(zhì)，降低了環(huán)境中的pH 值，而pH 值的降低有利于磷的溶出，這也和現(xiàn)有研究結(jié)果（Gong et al.，2013）一致。

2.3 解磷菌對(duì)土壤中可溶性磷含量的影響

將復(fù)篩中培養(yǎng)液可溶性磷含量較高的3 株解磷菌PSM-5、PSM-22 和PSM-9 挑選出來，按1.3.4的方法進(jìn)行土壤測(cè)試試驗(yàn)。從圖5 可以看出：3 株解磷菌在土壤中培養(yǎng)30 d，土壤中可溶性磷含量在前20 d 都呈現(xiàn)直線增加的趨勢(shì)，但之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，而對(duì)照的可溶性磷含量一直處于較低的水平?？梢娊饬拙臃N土壤可以提高土壤中可溶性磷含量。而土壤中可溶性磷含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，可能是因?yàn)榍捌谕寥乐袪I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，隨著時(shí)間推移營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，解磷菌的活力下降，所以制備牛蒡?qū)Ｓ蒙镉袡C(jī)肥除了微生物菌劑之外還要有足夠的營(yíng)養(yǎng)輔料。從圖5 還可以看出，雖然3 株解磷菌都可以增加土壤中可溶性磷含量，但與實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果（2.2.1）相差甚遠(yuǎn)，原因可能與解磷菌培養(yǎng)基的豐富程度、培養(yǎng)條件、菌體的適用性等有關(guān)?？傮w看來，3 株解磷菌中PSM-5 的表現(xiàn)最好。

2.4 解磷菌PSM-5 的鑒定

2.4.1 菌株P(guān)SM-5 的形態(tài)特征鑒定及生理生化特征鑒定 菌株P(guān)SM-5 在NBRIP 固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)2 d 后，菌落形態(tài)如圖6 所示。菌落圓形，不透明，乳白色，表明光滑、隆起，邊緣濕潤(rùn)，菌落周圍有明顯的溶磷圈。圖7 為菌株顯微鏡下形態(tài)，PSM-5 革蘭氏染色陰性，顯微鏡下呈棒狀，大小為（0.5～0.7）μm×（1.5～2.2）μm，單生或成對(duì)存在。菌株有芽孢、菌毛，無鞭毛。菌株P(guān)SM-5 生理生化特性見表2。

表2 菌株P(guān)SM-5 生理生化特性

2.4.2 菌株P(guān)SM-5 的16S rDNA 基因鑒定結(jié)果從圖8 可以看出，菌株P(guān)SM-5 的擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500 kb 處有1 條明亮的條帶，說明基因片段純度較高，DNA 長(zhǎng)度大約為1 500 kb。經(jīng)檢測(cè)，菌株P(guān)SM-5 的16S rDNA 長(zhǎng)度為1 406 個(gè)堿基。將測(cè)序結(jié)果和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與菌株P(guān)SM-5 同源性大于95%作為模式菌種，采用NJ 法（鄰接法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖9 可以看出，菌株P(guān)SM-5 與Bacillus subtilis（GenBank：EU233271）相似度達(dá)到99.9%以上，親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株P(guān)SM-5 的菌落特征、顯微觀察特征和生理生化特性，將菌株P(guān)SM-5 鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.5 解磷菌PSM-5 最優(yōu)解磷條件測(cè)定

2.5.1 溫度對(duì)菌株P(guān)SM-5 解磷的影響 從圖10 可以看出，菌株P(guān)SM-5 解磷的溫度范圍較廣：5～40℃都具有解磷能力，只是兩端的解磷能力較低。適宜的解磷溫度為25～32 ℃，最適解磷溫度是28℃，對(duì)應(yīng)的可溶性磷含量最高并達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。根據(jù)回歸方程求解，菌株P(guān)SM-5 解磷的最適溫度是28.46 ℃。原因可能是溫度影響菌株P(guān)SM-5 酶的催化活性，從而影響菌株解磷能力，而28.46 ℃正好是菌株酶最適催化溫度。

2.5.2 初始pH 值對(duì)菌株P(guān)SM-5 解磷的影響 從圖11 可以看出，初始pH 值較低時(shí)，菌株P(guān)SM-5 解磷能力較強(qiáng)，可溶性磷含量較高。隨著初始pH 值升高，菌株的解磷能力迅速下降，pH 值為9 時(shí)，可溶性磷含量已降到5 mg·L-1以下。初始pH 值在3.5～4.5 之間，菌株解磷能力最強(qiáng)，可溶性磷含量最高，根據(jù)回歸方程求解，菌株P(guān)SM-5 解磷的最適初始pH 值是3.79。原因可能是環(huán)境的pH 值會(huì)影響菌株P(guān)SM-5 酶活性，影響菌體代謝，從而影響菌株的產(chǎn)酸和酶的分泌，進(jìn)而影響菌株的解磷能力。

2.5.3 鹽濃度對(duì)菌株P(guān)SM-5 解磷的影響 從圖12 可以看出，當(dāng)鹽濃度低于12 g·L-1時(shí)，隨著鹽濃度增加可溶性磷含量迅速增加，即菌株P(guān)SM-5解磷能力迅速增加。當(dāng)鹽濃度高于12 g·L-1時(shí)，隨著鹽濃度增加可溶性磷含量迅速降低，菌株P(guān)SM-5解磷能力迅速減小。當(dāng)鹽濃度為9～12 g·L-1時(shí)，可溶性磷含量最大，根據(jù)回歸方程求解，菌株P(guān)SM-5 解磷最適的鹽濃度為10.46 g·L-1。原因可能是鹽濃度影響菌株的滲透壓，從而影響了細(xì)胞膜的透性，有利于菌株分泌酸性物質(zhì)和酶。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從徐州豐縣牛蒡種植區(qū)土壤中初篩出具有解磷能力的微生物24 株，通過測(cè)定可溶性磷含量復(fù)篩出9 株解磷能力較強(qiáng)的菌株，利用土壤接種方法最終篩選出解磷能力最強(qiáng)的菌株P(guān)SM-5。通過菌落特征和顯微特征觀察、生理生化特性測(cè)定和16S rDNA 測(cè)定，最終確定PSM-5 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），同時(shí)優(yōu)化了不同溫度、初始pH 值和鹽濃度條件下菌株P(guān)SM-5 的解磷最優(yōu)條件。要達(dá)到最大可溶性磷含量菌株P(guān)SM-5 最適的培養(yǎng)溫度、初始pH 值和鹽濃度分別為：28.46 ℃、3.79 和10.46 g·L-1。

本試驗(yàn)篩選出的解磷菌PSM-5 具有相對(duì)較強(qiáng)的解磷能力，28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)5 d，菌株培養(yǎng)液中可溶性磷含量達(dá)到198.28 mg·L-1。呂睿等（2017）從陜西省西安市周至縣獼猴桃園農(nóng)田土壤中分離出具有高效降解無機(jī)磷能力的菌株JWP3，鑒定結(jié)果為膠質(zhì)芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus），當(dāng)接種量為4%、培養(yǎng)溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1、初始pH 值為7 時(shí)，培養(yǎng)液中可溶性磷含量最高可達(dá)99.56 mg·L-1。蘇輝蘭等（2019）以廣西鐘山縣貢柑果園土壤為試驗(yàn)材料進(jìn)行解磷菌篩選，篩選出解磷菌株W3 初步鑒定為黃絲曲霉屬（Talaromyces），當(dāng)接種量為7%、培養(yǎng)溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速220 r·min-1、培養(yǎng)時(shí)間7 d 時(shí)，培養(yǎng)液中可溶性磷含量最高可達(dá)148.57 mg·L-1。本試驗(yàn)對(duì)菌株P(guān)SM-5 進(jìn)行了土壤試驗(yàn)，后續(xù)還將進(jìn)行盆栽試驗(yàn)、大田試驗(yàn)，逐步對(duì)菌株進(jìn)行馴化，使其真正成為牛蒡?qū)Ｓ蒙镉袡C(jī)肥的解磷菌劑，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。