盧文紅，谷翊群*，賈孟春，周芳

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所/WHO人類生殖研究合作中心(北京)，北京 100081；2.國家衛(wèi)生健康委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

世界衛(wèi)生組織(WHO)《人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》于1980年首次出版，以滿足臨床與科研對人類精液標(biāo)準(zhǔn)化檢測程序日益增長的需求。該手冊是人類精液實(shí)驗(yàn)室檢查和處理程序及方法的標(biāo)準(zhǔn)操作指南，旨在提高精液分析的質(zhì)量和提高不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的可比性。

在過去40年里，該手冊進(jìn)行了4次修訂與補(bǔ)充(1987年、1992年、1999年和2010年)，內(nèi)容涉及精液檢查的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序、精子功能、精漿生化、精液處理與冷凍以及質(zhì)量保證等，已成為國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，被世界各地臨床和實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。中國衛(wèi)生部已在2003年將其納入人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范。

WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(第5版)》精液參考值的數(shù)據(jù)是來自全球3大洲8個(gè)國家的前瞻性、多中心臨床研究的結(jié)果，通過循證醫(yī)學(xué)研究獲得的精液參數(shù)參考值具有里程碑式意義。自2010年出版以來成為WHO最受歡迎的出版物之一，即使在最近幾年其下載量也在穩(wěn)步增長。它是男科實(shí)驗(yàn)室及全球范圍內(nèi)開展精液分析操作的其他實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院和研究機(jī)構(gòu)使用的標(biāo)準(zhǔn)操作手冊。該手冊在國際大會、科學(xué)會議、以及WHO合作中心、專業(yè)學(xué)會和其他學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的培訓(xùn)項(xiàng)目中進(jìn)行了廣泛傳播。截止到2021年，已被3 000余篇同行評議論文和評論引用。

國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所從1992年起至今，作為WHO人類生殖研究合作中心，一直肩負(fù)著引進(jìn)與推廣WHO相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)與指南的職能，先后將手冊的第3版、第4版、第5版引入國內(nèi)，翻譯成中文由人民衛(wèi)生出版社正式出版發(fā)行，并在全國范圍內(nèi)長期進(jìn)行精液分析標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制的推廣，受到我國生殖醫(yī)學(xué)、男科學(xué)等領(lǐng)域及相關(guān)從業(yè)人員的廣泛歡迎。手冊供不應(yīng)求，尤其第5版更是經(jīng)歷5次印刷，舉辦了60余期標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)控培訓(xùn)。

2021年7月WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(第6版)》一經(jīng)問世，便得到了業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注。國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所和四川省人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所作為WHO人類生殖研究合作中心獲得了WHO授權(quán)，將其翻譯成中文，并將由WHO出版合作中心人民衛(wèi)生出版社出版發(fā)行。

一、《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(第6版)》的變化

第6版手冊由9章組成，包括精液檢查(基本檢查、擴(kuò)展性檢查、前沿性檢查)、精子制備及冷凍保存、以及質(zhì)量評估和質(zhì)量控制等，刪減、新增和擴(kuò)展了部分章節(jié)。

1.基本檢查：是確定精液變量穩(wěn)定的常規(guī)方法，不僅是男科實(shí)驗(yàn)室，任何開展精液檢查的實(shí)驗(yàn)室都能遵循。

精子計(jì)數(shù)依然推薦使用改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的方法，但計(jì)數(shù)的方法有了改變。明確推薦了伊紅苯胺黑染色法作為精子存活率診斷的首選方法，伊紅染色和低滲腫脹實(shí)驗(yàn)只作為備選方法。刪減了參考值下限的描述。對于精子活動率大于40%的樣本沒有必要做存活率評估。與第5版手冊中淡粉色判讀為活精子不同，明確了只有精子頭為白色的精子為活精子、淡粉色為死精子。

臨床數(shù)據(jù)表明，鑒別快速前向運(yùn)動精子非常重要。因此，關(guān)于精子活力分級，第6版手冊建議恢復(fù)到快速前向運(yùn)動、慢速前向運(yùn)動、非前向運(yùn)動和不活動4個(gè)活力級別，但精子活動率的參考值范圍卻依然是按前向運(yùn)動(PR)、非前向運(yùn)動(NP)、不活動(IM)3個(gè)活力級別計(jì)算。

第6版手冊強(qiáng)調(diào)，精子形態(tài)學(xué)評估的價(jià)值不僅在于其可用于判斷自然妊娠和輔助生殖技術(shù)(ART)結(jié)局的預(yù)后，還可以為男性生殖器官包括睪丸和附睪功能判斷提供更多診斷信息。對于3%和5%的精子“正?！毙螒B(tài)率的判斷，則要求必須由訓(xùn)練有素的人員評估1 500個(gè)精子來完成；對于無尾精子(只有頭部的精子)超過總精子數(shù)20%的精液，應(yīng)單獨(dú)計(jì)算并在報(bào)告中注明；新版本提供了精子形態(tài)學(xué)評估順序圖；使用其它染色方法進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)評估，需用本手冊所描述的巴氏染色方法進(jìn)行驗(yàn)證；更加強(qiáng)調(diào)了精子形態(tài)學(xué)分析的內(nèi)部和外部質(zhì)量控制以及在形態(tài)學(xué)分析時(shí)使用多鍵分類計(jì)數(shù)器。

2.擴(kuò)展性檢查：可以在某些情況下由實(shí)驗(yàn)室選擇或根據(jù)臨床醫(yī)生的特殊要求而使用的項(xiàng)目。手冊增加了精子DNA損傷、遺傳學(xué)和炎癥細(xì)胞等相關(guān)檢查項(xiàng)目。提出了基因突變是導(dǎo)致不育和精液常規(guī)檢查異常的原因。新增了精液相關(guān)細(xì)胞因子、趨化因子等檢測的方法、試劑、檢測步驟等內(nèi)容。

在精液參數(shù)異常的男性中普遍存在精子DNA損傷，并且已有報(bào)道指出其與精液參數(shù)正常男性的不育有關(guān)。由于與精液質(zhì)量相關(guān)，精子DNA損傷檢測是男性不育檢查中的重要補(bǔ)充內(nèi)容，已成為男科學(xué)基礎(chǔ)和臨床中論述最多、最有前景的精子損傷分子標(biāo)志物之一。本版手冊增加了大量篇幅對其原理和檢測方法進(jìn)行了描述。

新增了基因和基因組測序內(nèi)容。臨床上，越來越多的人意識到染色體異常[數(shù)量異常、結(jié)構(gòu)異常(包括微缺失和微重復(fù))]和基因突變是導(dǎo)致各種男性不育癥的基礎(chǔ)病因，而這正是在精液分析中觀察到的許多異常的原因。盡管基因和基因組測序常規(guī)在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，但一些男科實(shí)驗(yàn)室也在做同樣的檢測。

關(guān)于精液中未成熟生殖細(xì)胞的評估，WHO《人類精液及精子宮頸粘液相互作用檢查實(shí)驗(yàn)室手冊(第4版)》將精液中未成熟生殖細(xì)胞600萬/毫升以上界定為異常，但因未找到該界限值的可靠證據(jù)基礎(chǔ)，第6版建議不再將其作為參考值。

為明確生殖道炎癥對于男性不育的影響，泌尿男科醫(yī)生可能提出對精液中的趨化因子和細(xì)胞因子進(jìn)行評估。本手冊納入了精液中白細(xì)胞介素檢測方法。

3.前沿性檢查：目前不作為生育力低下男性初步評估的常規(guī)方法。這一部分包括了非常專業(yè)化的、主要用于研究的方法和其他新興檢測技術(shù)。

有研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激可能是影響人類精子功能和妊娠結(jié)局的重要因素；新的證據(jù)也表明了精子DNA完整性和染色質(zhì)組裝與生育力的關(guān)系。前沿性檢查一節(jié)中詳細(xì)介紹了精子氧化應(yīng)激和活性氧實(shí)驗(yàn)、精子染色質(zhì)檢測(苯胺藍(lán)和色霉素A3染色)的具體實(shí)驗(yàn)操作及討論。

手冊重寫了計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)部分，強(qiáng)調(diào)了CASA對于檢測精子濃度的局限性與質(zhì)控要求，增加了CASA檢測精子超活化運(yùn)動的內(nèi)容。

對精子跨膜離子流和轉(zhuǎn)運(yùn)的功能分析，可更好地了解男性不育因素和男性生殖器官疾病。為此，手冊新增了檢測精子跨膜離子流和轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)容。

4.人類精子冷凍保存和儲存：增加了冷凍樣本的安全性、精液冷凍保存方案、快速液氮熏蒸冷凍、冷凍精液的解凍、玻璃化冷凍等內(nèi)容，更具可操作性。本手冊對人類精子的冷凍保存提出了具體建議：將樣本分管分罐分開儲存；對使用的材料和留存標(biāo)本建立定期核驗(yàn)程序；所有儲罐都應(yīng)有液位監(jiān)控報(bào)警系統(tǒng)，以監(jiān)測溫度和液氮液位，傳感器應(yīng)連接警報(bào)器，可通過實(shí)驗(yàn)室人員的終端進(jìn)行提醒。

新證據(jù)表明，玻璃化冷凍是冷凍保存精液的一種有價(jià)值的方法。該方法的原理是將小體積樣本與無污染液氮直接接觸并快速冷凍，可以防止冰晶的形成，并減少精子的滲透性損傷。在麥管玻璃化冷凍(無菌玻璃化冷凍)中，也可以使用封閉系統(tǒng)，不需要無菌的液氮。

5.質(zhì)量保證和質(zhì)量控制：手冊保留了質(zhì)量保證和質(zhì)量控制章節(jié)，對部分內(nèi)容進(jìn)行了修訂，以使非統(tǒng)計(jì)專業(yè)人員更容易理解。

此外，因?yàn)橐恍z測技術(shù)不適宜臨床使用，本手冊刪減了精子-卵母細(xì)胞相互作用試驗(yàn)、人卵透明帶結(jié)合試驗(yàn)、去透明帶倉鼠卵穿透試驗(yàn)及精子與宮頸粘液接觸試驗(yàn)等方法。

二、關(guān)于精液參考值范圍

前4版手冊提供了傳統(tǒng)人工檢查精液的參考值范圍與下限。在第5版手冊中，采用妊娠等待時(shí)間(time to pregnancy，TTP)對12個(gè)月內(nèi)使其性伴侶自然懷孕的男性最接近伴侶妊娠時(shí)點(diǎn)的精液(精液標(biāo)本來自3大洲的8個(gè)國家，獲得各個(gè)精液參數(shù)所使用的精液樣本數(shù)不一致，400例～1 900例不等)檢測結(jié)果的分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，分布的第5個(gè)百分位點(diǎn)確定為可生育男性的精液參考值下限。數(shù)據(jù)來源于前瞻性多中心臨床研究。

而第6版是在第5版研究數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，增加了來自中國、埃及、希臘、伊朗、意大利等國家2010年以后符合第5版手冊中TTP研究納入標(biāo)準(zhǔn)、自然懷孕時(shí)間在一年內(nèi)(TTP為12個(gè)月之內(nèi))的同質(zhì)性新數(shù)據(jù)(總數(shù)據(jù)量大約3 500例)進(jìn)行了二次統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出參考值范圍與下限。本手冊與第5版手冊相比，精液參考值范圍與下限變化不大，一些參數(shù)略有上下微調(diào)，表明在過去10年間在全球范圍內(nèi)精液參數(shù)沒有出現(xiàn)明顯變化趨勢。

在過去的10年中WHO并沒有在全球范圍內(nèi)牽頭開展多中心臨床研究，本手冊獲得的新數(shù)據(jù)與第5版數(shù)據(jù)收集年代不同，且有些數(shù)據(jù)的地域代表性有限。此外，由于精液檢查的諸多不確定性以及生育和不育男性的精液參數(shù)存在重疊分布，本手冊給出的精液參考值范圍可作為臨床男性不育治療決策的參考，但應(yīng)避免過度解讀。

在此感謝同道們對《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(第6版)》中譯本的關(guān)注，歡迎大家對即將出版的中文譯本的翻譯內(nèi)容提出寶貴意見。我們團(tuán)隊(duì)將會在后續(xù)的學(xué)術(shù)會議或系列培訓(xùn)中就一些技術(shù)問題進(jìn)行深入解讀，共同提高我國男科學(xué)及男性生殖醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測同質(zhì)化水平。