王含必，鄧成艷

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，國家婦產(chǎn)疾病臨床研究中心，北京 100730)

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因其極強(qiáng)的分化能力以及免疫調(diào)節(jié)特性，被用于組織修復(fù)和多種疾病的治療。然而MSCs在生物活性的維持、物質(zhì)定量和臨床治療的物流配送方面存在相對局限性。外泌體由于其良好的生物活性和細(xì)胞間的通訊功能，具有與MSCs類似的療效而作為一種新的無細(xì)胞治療選擇引起了研究者的關(guān)注。早在1983年P(guān)an及Johnstone兩位學(xué)者首次報(bào)道了外泌體，他們發(fā)現(xiàn)在網(wǎng)織細(xì)胞成熟過程中，含有受體的小泡通過與細(xì)胞膜融合釋放到細(xì)胞外環(huán)境中誕生了外泌體[1]。外泌體作為一種無細(xì)胞系統(tǒng)存在，具有一些細(xì)胞治療不具備的優(yōu)勢，如體積更小、更單一、循環(huán)半衰期長、低免疫源性、很容易包被治療物質(zhì)、易穿過血腦屏障、易生產(chǎn)及貯存，同時(shí)無致瘤性等，使其日漸成為再生醫(yī)學(xué)及生物醫(yī)學(xué)治療的新選擇[2]。本文將就外泌體的來源、特征、功能及臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

一、外泌體來源及特征

所有細(xì)胞都釋放細(xì)胞外囊泡(EVs)，EVs攜帶有機(jī)化合物，包括蛋白、RNA、基因組DNA及非編碼RNAs、脂質(zhì)、代謝物等。細(xì)胞利用EVs系統(tǒng)通過化學(xué)物質(zhì)與鄰近和遠(yuǎn)處細(xì)胞器官進(jìn)行交流。根據(jù)EVs的大小及釋放機(jī)理分為三類：(1)外泌體(直徑30～200 nm，平均約100 nm)；(2)微泡/核外顆粒體(100～1 000 nm)；(3)凋亡小體(50～1 500 nm)。外泌體侵入細(xì)胞傳遞化學(xué)信息的同時(shí)參與細(xì)胞生理及病理狀態(tài)下的整合過程[3]。因外泌體直徑小于光波長的5～10倍，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡無法檢測到，但可被熒光探針標(biāo)記用熒光顯微鏡檢測。

外泌體的形成涉及到原生質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷和含有腔內(nèi)小泡(ILVs)的細(xì)胞內(nèi)多泡體(MVBs)的形成。首先漿膜內(nèi)陷形成包括細(xì)胞表面蛋白與細(xì)胞外環(huán)境相關(guān)的可溶性蛋白的杯狀結(jié)構(gòu)，反式高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有助于早期核內(nèi)體的形成。早期核內(nèi)體成熟至晚期核內(nèi)體，最終形成MVBs。MVBs可以與溶酶體或自噬體融合以降解，或與質(zhì)膜融合以釋放所含的ILVs作為外泌體。多種細(xì)胞分泌外泌體，如MSCs、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、B細(xì)胞及T細(xì)胞等[4]。其成分取決于來源細(xì)胞的類型及生理狀態(tài)。外泌體幾乎存在于所有體液中，包括血漿、尿液、腹水、乳汁等，其在生物系統(tǒng)中的駐留突出了它在細(xì)胞通信中的關(guān)鍵作用[5]。

二、外泌體的功能

既往研究認(rèn)為外泌體的功能類似細(xì)胞垃圾袋，排除多余和無功能的細(xì)胞成分[6]。近年來研究顯示外泌體是一種細(xì)胞間連接物，能夠輸送蛋白、脂質(zhì)及核酸到靶細(xì)胞，在各種生物過程中發(fā)揮作用，如血管形成、抗原呈遞、凋亡、炎癥等。這些作用源自其轉(zhuǎn)移的信息物質(zhì)，從而影響生理和病理過程，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、感染和自身免疫性疾病等[7]。外泌體通過兩種途徑影響受體細(xì)胞[8]，其一，外泌體和受體細(xì)胞間的配體-受體相互作用，無需將外泌體或其內(nèi)容物內(nèi)化到靶細(xì)胞。此途徑可調(diào)節(jié)靶細(xì)胞信號(hào)通路的激活或抑制作用；其二，外泌體通過膜融合或內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，其成分被攝取后釋放到細(xì)胞質(zhì)中，通過調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)和信號(hào)通路影響宿主細(xì)胞，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能或表型的改變。

1.生殖領(lǐng)域：受精及胚胎發(fā)育需要精確的細(xì)胞間通信。精液、羊水、血液和母乳都含有外泌體。精漿外泌體與精子成熟有關(guān)，其對人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染有抑制作用，可能通過阻斷HIV早期蛋白轉(zhuǎn)錄激活因子的招募及HIV-1的后續(xù)轉(zhuǎn)錄而抑制感染[9]。外泌體也幫助預(yù)防胎盤感染，通過從胎盤滋養(yǎng)層的特殊細(xì)胞到非胎盤細(xì)胞的外泌體miRNA的輸送，誘導(dǎo)自噬和防御病毒感染，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人類巨細(xì)胞病毒及單皰病毒-1[10]。在孕婦血漿中外泌體miRNA和蛋白質(zhì)含量與胎齡有關(guān)。血漿外泌體在小鼠懷孕期間也有動(dòng)態(tài)變化，而妊娠期特異性外泌體在功能上與分娩有關(guān)[11]。健康母乳來源的外泌體含有與免疫功能相關(guān)的miRNA，并能在體外增強(qiáng)外周血來源的T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，可能用于調(diào)節(jié)免疫耐受[12]。外泌體還參與胚胎與子宮內(nèi)膜間的信息傳遞，可能對胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用，且在一定程度上可反映胚胎的質(zhì)量，有望成為無創(chuàng)性評價(jià)胚胎質(zhì)量的標(biāo)記物。在胚胎種植方面，研究發(fā)現(xiàn)胚胎來源的外泌體攜帶調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部免疫系統(tǒng)的物質(zhì)，在胚胎種植中也發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13]。

2.血管形成：血管形成包括多種生理過程，如內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、形成管腔。外泌體參與細(xì)胞分化、新生血管形成、促進(jìn)血流恢復(fù)和毛細(xì)血管網(wǎng)形成，提示外泌體可能成為治療缺血性疾病的一種新的治療方法。MSC來源外泌體可增加內(nèi)膜細(xì)胞的管腔形成、促進(jìn)血管形成，在裸鼠模型中皮下注射人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSC)來源的外泌體可顯著增加體內(nèi)和梗死區(qū)周圍新生血管，保護(hù)心臟功能[14]，還可促進(jìn)皮膚Ⅱ度燒傷后修復(fù)過程中的血管生成[15]。

3.凋亡：凋亡是細(xì)胞經(jīng)歷一系列變化導(dǎo)致死亡細(xì)胞解體，發(fā)生在健康細(xì)胞的正常周期，也發(fā)生在某些病理?xiàng)l件下，如炎癥、感染、自身免疫和癌癥。在惡性疾病中，致癌突變導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞凋亡的平衡失衡。來源于癌細(xì)胞的外泌體對自然殺傷細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，并通過攜帶Fas配體誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。外泌體還可通過轉(zhuǎn)移具有免疫調(diào)節(jié)能力和遺傳信息的物質(zhì)，誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)改變、凋亡和血栓形成，破壞細(xì)胞完整性[6]。

4.抗原呈遞：在免疫方面，外泌體通過傳遞多種生物分子完成抗原呈遞、免疫活化、免疫抑制及免疫耐受[16]。抗原呈遞細(xì)胞分泌外泌體能夠通過攜帶和呈遞調(diào)節(jié)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的功能性主要組織相容性復(fù)合物減輕或刺激免疫反應(yīng)而達(dá)到治療目的。樹突狀細(xì)胞來源的外泌體可有效誘導(dǎo)對寄生蟲和弓形蟲的保護(hù)性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[17]。外泌體工程實(shí)驗(yàn)表明外泌體中的DNA和miRNA參與調(diào)節(jié)適應(yīng)免疫和先天免疫反應(yīng)，如細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌(李斯特菌、嗜肺軍團(tuán)菌)的DNA被吸收到外泌體后刺激鄰近細(xì)胞信號(hào)通路，激活免疫應(yīng)答[18]，這支持了它們在治療方面的效用以及在協(xié)調(diào)對感染性病原體或癌癥的免疫反應(yīng)方面的潛在作用。

5.炎癥反應(yīng)：炎癥由白細(xì)胞啟動(dòng)對抗感染的免疫反應(yīng)以恢復(fù)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。外泌體參與炎癥過程在許多病理狀態(tài)中發(fā)揮作用，如癌癥、炎癥性腸病、Ⅱ型糖尿病、肥胖、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。外泌體含有的炎癥趨化因子mRNA水平升高可引起炎癥，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與腫瘤發(fā)展階段如免疫監(jiān)控和治療抵抗。來源于脂肪組織的外泌體含有55個(gè)miRNAs的改變，其中大部分調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移生長因子β和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)，這些信號(hào)通路調(diào)節(jié)慢性炎癥和胰島素抵抗的進(jìn)程。在帕金森氏病、阿爾茨海默病和克魯茨菲爾德-雅各布病中，細(xì)胞間通過外泌體包含的α-synuclein，淀粉樣蛋白和朊病毒觸發(fā)炎癥信號(hào)細(xì)胞間的連接[19]。這些證據(jù)表明外泌體通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞功能在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

6.細(xì)胞增殖與分化：外泌體介導(dǎo)的分化在治療組織損傷中發(fā)揮著重要作用，其可促進(jìn)MSCs產(chǎn)生不同種類細(xì)胞替代受損或死亡組織中丟失的細(xì)胞。研究表明從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出的前成骨細(xì)胞外泌體可在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)MSCs的譜系特異性分化[20]。腫瘤來源的外泌體可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)瘤變。外泌體還參與了腫瘤微環(huán)境的血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)重建，這是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的關(guān)鍵步驟。癌細(xì)胞分泌的外泌體促進(jìn)癌癥對各種化療藥物和抗體的耐藥性[21]。

三、外泌體的臨床應(yīng)用

外泌體的復(fù)雜性為疾病的診斷和監(jiān)測提供了一個(gè)多組分的診斷窗口。無論是在基礎(chǔ)水平還是應(yīng)用水平，外泌體向病變細(xì)胞運(yùn)送功能物質(zhì)的特性也有利于它們作為治療載體。

(一)外泌體的診斷潛力

外泌體生成過程捕獲的特異性核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)可反映細(xì)胞起源及其生理狀態(tài)，有明顯的疾病特異性，使它們成為理想的生物標(biāo)記物，如阿爾茨海默病、病毒感染、癌癥、肝腎疾病和心肺疾病[22]。外泌體不僅可以作為載體攜帶RNA，還可以保護(hù)其免受RNA酶降解。外泌體-miRNAs參與各種類型的癌癥相關(guān)過程，如血管生成和轉(zhuǎn)移，提示它們可視作癌癥診斷的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物，尤其是卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌及腸癌。外泌體miR-21血清水平可用于鑒別食道鱗癌與良性疾病[23]，在肝癌中也明顯高于慢性乙肝及健康人群[24]。循環(huán)中的miRNA-141和miRNA-375已被證明是診斷前列腺癌的有價(jià)值的生物標(biāo)志物[25]，從人類唾液和羊水中分離出的外泌體含有數(shù)百種穩(wěn)定的miRNAs，是胰腺癌和產(chǎn)前診斷的寶貴工具[26]。與正常組織外泌體相比，肺癌外泌體顯示不同水平的miRNAs(miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200-5p)，可用于肺腺癌的篩查診斷[27]。這些數(shù)據(jù)表明外泌體miRNAs可能成為癌癥和炎癥疾病的早期診斷工具之一。在婦產(chǎn)科疾病方面，有學(xué)者研究了多囊卵巢綜合征(PCOS)患者卵泡液外泌體內(nèi)長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PCOS患者外泌體中l(wèi)ncRNA存在差異性表達(dá)，可能lncRNA在PCOS的發(fā)病中發(fā)揮一定作用;且外泌體中mRNA在卵泡液中的表達(dá)穩(wěn)定，受內(nèi)環(huán)境影響小，加之lncRNA在外泌體中有表達(dá)，有可能成為PCOS患者的早期診斷手段之一[28]。

(二)外泌體的治療潛力

目前外泌體治療研究主要在生物醫(yī)學(xué)、藥物輸送及再生醫(yī)學(xué)這三方面。來自MSCs的外泌體已被嘗試用于多種疾病模型的研究，如呼吸、心血管、神經(jīng)、肌肉骨骼、肝臟、胃腸、皮膚和腎臟疾病[29]，治療心肌梗塞、藥物成癮、癲癇、腦損傷、肝損傷及某些類型的癌癥等[30]。外泌體治療具有特殊優(yōu)勢：無復(fù)制功能故無成瘤風(fēng)險(xiǎn)；有過濾殺菌作用且時(shí)效比干細(xì)胞長；體積小易通過體內(nèi)循環(huán)到達(dá)損傷部位；更低的免疫源性；通過增加或抑制血管形成達(dá)到控制疾病進(jìn)展或組織修復(fù)目的。

1.外泌體在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用：很多研究關(guān)注于干細(xì)胞來源外泌體的治療，動(dòng)物器官損傷模型，如肝、腎及心臟損傷常見的纖維化改變。在肝損傷的動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)HUMSCs來源的250 μg外泌體直接注射入纖維化的肝臟后纖維化程度明顯降低[31]。在心肌梗塞模型中可減少炎性及纖維化，且作用效果明顯高于MSCs。對miRNA增殖分析后發(fā)現(xiàn)在外泌體及MSCs中不同的miRNAs表達(dá)明顯不同，如miR-21及miR-15，這一差異可解釋為什么外泌體較MSCs更具有治療心肌梗塞的優(yōu)勢[32]。在急性腎衰的鼠模型中注射細(xì)胞外囊泡后發(fā)現(xiàn)腎小管細(xì)胞形成明顯增加，在慢性腎損傷的裸鼠模型中MSCs來源的細(xì)胞外囊泡可減少纖維化和腎小管萎縮[33]。

2.藥物輸送：外泌體能介導(dǎo)遺傳物質(zhì)水平的轉(zhuǎn)移，從而改變受體細(xì)胞的生物活性。外泌體可有效載荷多種治療物質(zhì)，包括RNAs、反義寡核苷酸、化療藥物等，且能夠通過不同的生物屏障將這些物質(zhì)直接輸送到靶器官，如巨噬細(xì)胞來源的外泌體能夠有效地穿越血腦屏障傳遞蛋白質(zhì)類物質(zhì)[34]。與脂質(zhì)體相比外泌體能更有效地進(jìn)入其他細(xì)胞，并能在小鼠外源性給藥時(shí)以最小的免疫清除率傳遞功能性物質(zhì)。來自間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的外泌體反復(fù)注射在小鼠體內(nèi)不會(huì)誘導(dǎo)毒性。MSC來源的外泌體治療一名移植物抗宿主的反應(yīng)者顯示重復(fù)注射外泌體有很好的耐受性，無明顯副作用及不良反應(yīng)[35]。工程外泌體上的配體富集也可用于誘導(dǎo)或抑制受體細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)，或?qū)⑼饷隗w靶向到特定細(xì)胞。外泌體還可有效裝載腫瘤的化療藥物，且毒副作用低。因此外泌體作為藥物載體具有良好耐受性及應(yīng)用前景。目前基于外泌體的治療已在胰腺癌患者中開始了一期臨床試驗(yàn)(ClinicalTrials.gov identifier：NCT03608631)。

3.再生醫(yī)學(xué)：MSCs來源外泌體是再生和修復(fù)領(lǐng)域的一種有前途的工具，針對其再生潛力和治療應(yīng)用已進(jìn)行了一些體內(nèi)和體外研究，在多種疾病中已證實(shí)外泌體甚至比MSCs有更好的作用[7]，如減小心梗范圍，在心肌缺血灌注損傷后預(yù)防不良重構(gòu)，皮膚損傷、急性腎損傷、肝損傷、新生兒肺損傷、促進(jìn)視神經(jīng)擠壓時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活、改善視網(wǎng)膜激光損傷、協(xié)調(diào)神經(jīng)保護(hù)。研究顯示皮膚損傷修復(fù)歸因于膠原合成和MSCs誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分泌的外泌體[4]，在婦產(chǎn)科領(lǐng)域，Asherman’s綜合征是治療棘手的疾病。有學(xué)者構(gòu)建宮腔粘連的鼠模型，采用靜脈或?qū)m腔內(nèi)注射干細(xì)胞的方法治療可促進(jìn)血管形成、降低宮腔粘連程度，甚至預(yù)防粘連形成[36]。用鼠模型比較MSCs及MSCs-外泌體的療效后發(fā)現(xiàn)，外泌體治療組纖維化程度及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2表達(dá)降低，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2及MMP-9表達(dá)增加，有關(guān)血管形成的CD31及VEGFR-1表達(dá)高于MSCs組，證實(shí)外泌體對改善宮腔粘連的損害效果優(yōu)于MSCs[37]。有研究人臍帶MSCs對子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體可增加子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的遷移，可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)[38]。然而，外泌體在組織再生中的作用在很大程度上仍未明確是限制其使用的障礙。

四、存在的問題及展望

目前雖然有證據(jù)支持外泌體可作為新的診斷和治療手段，但仍需要臨床驗(yàn)證。外泌體的分離和純化存在一定的局限性。為了達(dá)到有效的劑量至少需要10～100 g的外泌體，然而1 ml培養(yǎng)基的產(chǎn)率通常小于1 μg[39]。此外，從生物體液中分離出來的外泌體高度異質(zhì)且純度低，優(yōu)化分離純化外泌體的方法是關(guān)鍵，在保持其原始組成的同時(shí)要減少由污染物或特定亞群引起的不良副作用，以提高其治療效果[40]。一旦這些限制被克服將有助于我們加深對外泌體功能的了解，并將促進(jìn)新的治療策略的發(fā)展。