溫福利

（聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學實驗室，福州 350025）

兔球蟲?。╮abbit coccidiosis）是由兔球蟲寄生于腸道或膽管引起的一種感染性寄生蟲病[1]。兔球蟲共有11種，其中斯氏艾美耳球蟲（Eimeria stiedai，E.stiedai） 是唯一寄生于肝膽管上皮細胞的兔球蟲，可導(dǎo)致嚴重的肝球蟲病[2]。兔球蟲病在臨床中以腸型和肝型球蟲混合感染為主，經(jīng)過裂殖生殖和配子生殖的E.stiedai卵囊到腸腔后與腸型球蟲一起隨糞便排出[3]。巢式PCR是一種成熟的核酸擴增技術(shù)，通過內(nèi)引物和外引物的雙重基因擴增，可特異地鑒定是否存在E.stiedai感染。在科學實驗中，因E.stiedai寄生部位的特殊性，較易獲取純種卵囊。本研究通過建立兔E.stiedai感染模型可獲取更多卵囊，利用臨床剖檢、顯微鏡觀察、血液生化檢查和病理組織學檢查等方法對建立的模型進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級雄性新西蘭兔9只，40～45日齡，平均體質(zhì)量為0.84 kg，購自福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗場 [SCXK(閩)2014-0001]，有抗球蟲藥物治療記錄。實驗兔飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院普通環(huán)境[SYXK(閩)2018-0005]，動物實驗符合相關(guān)倫理要求并給予人道關(guān)懷。

1.2 主要儀器與試劑

Catalyst One 全自動生化分析儀為美國IDEXX Laboratories公司產(chǎn)品；EG1150H石蠟包埋機、RM2245半自動輪轉(zhuǎn)式切片機、ST5020多功能染色機、CV5030全自動化玻片蓋片機和DM2000生物顯微鏡均為德國Leica公司產(chǎn)品；ABI Veriti PCR儀為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。植物基因組DNA快速抽提試劑盒和DNA擴增相關(guān)試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)擴增儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；FR980凝膠成像系統(tǒng)為上海復(fù)日科技有限公司產(chǎn)品。E.stiedai由中國農(nóng)業(yè)大學索勛課題組提供。

1.3 兔E.stiedai感染模型的建立

將約5×104個E.stiedai通過灌胃法注入實驗組新西蘭兔體內(nèi)，21 d后對實驗兔進行觀察，剖檢肝臟病變。取病變肝臟的一小塊結(jié)節(jié)病灶，加適量0.9%NaCl溶液（即生理鹽水）進行壓片鏡檢，拍照后測量蟲卵長度。采集耳緣靜脈血液于綠色頭蓋標記的肝素鋰采血管中，進行血液生化檢查。同時，分別取實驗組和對照組一小塊肝臟組織（1 cm×1 cm×0.5 cm），置于體積分數(shù)為10%的甲醛溶液中固定24 h。梯度乙醇脫水后二甲苯透明，常規(guī)石臘包埋，切片后進行HE染色，中性樹膠封固后，顯微鏡下觀察。

1.4 血液生化檢查

采用全自動生化分析儀對感染后實驗兔的血糖（GLU）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、血尿素氮/肌酐比（BUN/CREA）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、白蛋白/球蛋白比（ALB/GLOB）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALKP）各項血液生化項目進行檢查。

1.5 巢式PCR檢測方法的建立

1.5.1 卵囊收集 將含有白色結(jié)節(jié)病灶的肝臟剪成小塊并置于攪拌機中攪拌均勻，加入5倍0.25%胰蛋白酶，置于37 ℃振蕩器150 r/min振蕩1 h，消化后肝臟組織分別用1層、2層和4層紗布進行多次過濾，濾液用飽和鹽水漂浮法收集卵囊。以雞柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）、兔巨型艾美耳球蟲（E.maxima）和兔大型艾美耳球蟲（E.magna）為陰性對照，雙蒸水為空白對照。

1.5.2 DNA提取與質(zhì)粒構(gòu)建 將1×106個卵囊和2 000個卵囊分別置于含磁珠的振蕩器振蕩20 min，然后按照植物基因組DNA快速抽提試劑盒說明提取DNA，－20 ℃保存。將2 000個E.stiedai卵囊的DNA稀釋成1個、5個、10個、25個和50個卵囊的DNA模板。E.stiedai的重組質(zhì)粒構(gòu)建于前期實驗，拷貝數(shù)為1.41×1013，質(zhì)粒梯度稀釋后用于敏感性和重復(fù)性實驗。

1.5.3 巢式PCR方法的建立 根據(jù)E.stiedai的ITS1基因序列，用軟件Premier 5.0設(shè)計第一輪PCR的引物，正向引物序列為5'-TTGGGTGGGTTTTCTGTGCC-3'，反向引物序列為5'-CGCGAGCCAAGACATCCATT-3'。配制25 μL的反應(yīng)體系：上下游引物（10 μmol/L）、DNA 模板和dNTP（10 mmol/L）均是0.5 μL，Taq buffer（10×）2.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，不足部分用雙蒸水補充。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，連續(xù)30個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸8 min。

第二輪PCR引物的正向序列為5'-GGTTCGGTCACCTCTGCATT-3'，反向序列為5'-CAGCACCATCATCCACAGGA-3'。配制25 μL的反應(yīng)體系：以第一輪106倍稀釋質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物為模板，進行再次梯度稀釋，其余成分的加入量與第一輪反應(yīng)體系相同，不足部分用雙蒸水補充。退火溫度提高至60℃，連續(xù)25個循環(huán)，反應(yīng)程序與第一輪擴增相同。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。運用Image-pro Plus 6.0軟件對組內(nèi)3次重復(fù)性實驗結(jié)果進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床剖檢

實驗組兔食欲降低，腹圍明顯增大（圖1A）。解剖后見肝臟腫大明顯，肝臟表面和實質(zhì)布滿白色和淡黃色結(jié)節(jié)，膽囊和膽管腫大，膽汁呈淡綠色，感染嚴重的病兔膽汁呈淡黃色（圖 1B）。

2.2 血液生化檢查

GLOB含量偏高， CREA和ALKP含量偏低（表1），其余檢測指標均在全自動生化分析儀提供的兔血液生化檢查參考值范圍內(nèi)。

圖 1 斯氏艾美耳球蟲感染兔的臨床剖檢Figure 1 Clinical biopsy of Eimeria stiedai infected rabbits

表 1 斯氏艾美耳球蟲感染的兔血液生化檢測Table 1 Blood biochemistry of Eimeria stiedai infected rabbits

2.3 顯微鏡觀察

E.stiedai呈長橢圓形，借助于顯微鏡及其計算機輔助系統(tǒng)對蟲卵形態(tài)特征進行觀察鑒定。取肝臟結(jié)節(jié)和膽管上皮進行壓片鏡檢，可見大量未孢子化E.stiedai蟲卵，未孢子化卵囊大小為36.26μm×19.73 μm（圖2A）。將卵囊進行分離培養(yǎng)，鏡下孢子化卵囊大小為34.35 μm×18.32μm，卵囊內(nèi)孢子囊呈卵圓形，有斯氏體（圖2B）。

2.4 病理組織學檢查

圖 2 斯氏艾美耳球蟲感染兔卵囊的顯微鏡觀察（×400）Figure 2 Microscopic observation on oocyst of Eimeria stiedai infected rabbits (×400)

HE組織染色結(jié)果顯示，健康肝組織細胞排列緊密，未見E.stiedai蟲卵（圖3A）。實驗兔肝組織HE染色后，鏡下可見肝臟組織結(jié)節(jié)含大量E.stiedai蟲卵，蟲卵在10倍目鏡下呈空泡樣（圖3B）。肝膽管上皮增生，組織內(nèi)出現(xiàn)大量被切成縱橫等不同斷面的兔E.stiedai蟲卵（圖3C）。40倍目鏡下，可見膽管內(nèi)蟲卵呈橢圓形，粉紅色（圖3D）。

2.5 巢式PCR檢測方法

建立的E. stiedai巢式PCR檢測方法可擴增出特異性片段，最低檢測限為1個卵囊DNA樣本，重組質(zhì)粒最低檢測限為1010倍稀釋的質(zhì)粒，拷貝數(shù)為1.14×103。以E.maxima、E.magna、E.tenella的DNA樣本為陰性對照組，以雙蒸水為空白對照組，兩組均未擴增出條帶（圖4）。分析組內(nèi)3次重復(fù)性實驗結(jié)果表明，變異性系數(shù)＜5%，重復(fù)性較好（表2）。

圖 3 斯氏艾美耳球蟲感染兔肝組織病理學檢查Figure 3 Pathological observation on the liver of Eimeria stiedai infected rabbits

圖 4 巢式PCR檢測斯氏艾美耳球蟲卵囊DNAFigure 4 Detection of oocyst DNA of Eimeria stiedai by nested PCR

表 2 巢式PCR組內(nèi)重復(fù)性實驗Table 2 Intra-group repeatability test of nested PCR

3 討論

實驗兔在醫(yī)學、生命科學等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，已廣泛應(yīng)用于肝癌、肝移植、脂肪肝、肝硬化等相關(guān)基礎(chǔ)研究[4-6]。兔球蟲病危害較大，耐過球蟲病的實驗兔肝損傷難以修復(fù)，并將長期攜帶蟲卵，成為隱性傳染源。本實驗通過解剖感染E.stiedai的實驗兔發(fā)現(xiàn)，與健康肝組織相比，實驗組肝臟腫大1.5～2倍，肝質(zhì)量增加4～5倍，肝臟表面和實質(zhì)布滿結(jié)節(jié)和少量鈣化灶；鏡下病理切片可見大量粉紅色的蟲卵，形狀和大小與E.stiedai相符，初步鑒定建模成功。

GLOB是機體抵抗病毒、寄生蟲等病原入侵的重要指標，它可反映肝臟的病變程度[7]。本實驗對感染E.stiedai的新西蘭兔進行血液生化檢查發(fā)現(xiàn)，GLOB含量顯著上升，輔助驗證了E.stiedai成功感染。CREA和ALKP指標偏低可能與球蟲感染后引起的貧血有關(guān)系。肝臟是代謝過程中的一個重要器官，ALT是反映肝細胞受損的靈敏指標。本實驗未見ALT升高，可能是與感染后肝衰竭，正常細胞減少，導(dǎo)致釋放到血液中的轉(zhuǎn)氨酶減少有關(guān)。

兔球蟲種類有11種，以混合感染為主，在兔糞樣中經(jīng)?？梢詸z測到腸型和肝型球蟲卵囊。目前，主要通過顯微鏡觀察孢子化后卵囊的形態(tài)進行鑒定，該方法的準確性有待提高。PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于兔球蟲的檢測。溫福利等[8]建立了E.stiedai的熒光定量PCR檢測方法。閆文朝等[9]克隆了E.stiedai完整的ITS1-5.8sRNA-ITS2基因序列，建立了PCR檢測方法，最低檢測限為50個卵囊的DNA。許家園等[10]對兔腸型艾美耳球蟲（E.intestinalis）、黃艾美耳球蟲（E.flavesce）、E.magna進行了ITS序列測定，結(jié)果表明ITS序列種內(nèi)同源性高于種間同源性，可用于3種球蟲的分子標志。梁子平等[11]根據(jù)兔球蟲ITS1序列分別設(shè)計了針對11種兔艾美耳球蟲的特異性引物，建立了兔艾美耳球蟲多重PCR檢測方法。宮鵬濤等[12]建立了用于11種兔艾美耳球蟲的巢式PCR檢測試劑盒。本研究通過建立的E.stiedai感染模型收集了足夠卵囊，并根據(jù)ITS1序列設(shè)計了兩對特異性引物，該方法的最低檢測限為1個卵囊DNA樣本，重組質(zhì)粒最低檢測限為1010倍稀釋的質(zhì)粒，說明該方法的靈敏度高。陰性對照和空白對照結(jié)果表明特異性較好，組內(nèi)3次重復(fù)性實驗的變異性系數(shù)＜5%，說明重復(fù)性較好。后期將應(yīng)用該方法對實驗兔生產(chǎn)和使用單位進行E. stiedai檢測。

本實驗成功建立了兔E. stiedai巢式PCR檢測方法，有助于進一步補充和完善E.stiedai的分子生物學檢測方法，更好地保障實驗兔的供應(yīng)質(zhì)量和相關(guān)科學實驗結(jié)果的準確性。