王婧 楊雯 涂琦 江堅(jiān)青

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院，武漢市婦幼保健院產(chǎn)科（武漢430040）

宮頸癌的耐藥性導(dǎo)致臨床治療效果差，成為發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病率高、病死率高的主要原因［1-2］。因此，尋找有效的宮頸癌治療方法迫在眉睫。燈盞花素是首次從石胡荽中提取的倍半萜內(nèi)酯，具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的作用［3-5］。以往的研究表明，燈盞花素的抗腫瘤活性與破壞線粒體氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)態(tài)有關(guān)［6］。然而，燈盞花素在宮頸癌中的詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。最近研究［7］表明，PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN?induced putative kinase 1，PINK1）/E3 泛素連接酶（E3 ubiq?uitin protein ligase，Parkin）介導(dǎo)的有絲分裂在線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡中起重要作用，并且已有研究闡明了PINK1 在多種癌細(xì)胞中的作用。因此，本研究探討了燈盞花素對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖、凋亡、ROS 產(chǎn)生和線粒體功能障礙的作用及其潛在的分子機(jī)制是否與PINK1/Parkin 信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑人宮頸癌細(xì)胞系HeLa購自美國ATCC 公司和人正常宮頸上皮細(xì)胞（HcerEpic）購自廣州萊德爾生物科技有限公司。將這些細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的Dulbecco 改良的Eagle′s 培養(yǎng)基（DMEM，均購自美國Gibco 公司）中培養(yǎng)。燈盞花素（純度> 98%）購自美國Sigma Aldrich 公司。

1.2 MTT試驗(yàn)將HeLa細(xì)胞接種于96孔板（3 000個(gè)/孔）中。經(jīng)過各種處理后，用含有MTT（0.5 mg/mL）的培養(yǎng)基代替細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h 后，取上清液，加入150 μL 二甲基亞砜。測(cè)定570 nm 處的吸光度。

1.3 細(xì)胞凋亡分析收集HeLa 細(xì)胞，用70%乙醇在4 ℃下固定2 h，然后照細(xì)胞周期和凋亡分析試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說明進(jìn)行染色。用流式細(xì)胞術(shù)分析染色細(xì)胞。

1.4 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放測(cè)定為了進(jìn)行LDH 測(cè)定，將每個(gè)樣品的上清液與NADH 和丙酮酸鹽在37 ℃孵育15 min，然后加入0.4 mol/L NaOH 終止反應(yīng)。測(cè)定490 nm 處的吸光度計(jì)算LDH 活性。

1.5 ROS 生成的測(cè)定使用DCFH?DA 熒光探針（上海凱根生物科技有限公司）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。將細(xì)胞與DCFH?DA 在37 ℃黑暗中染色30 min。通過共焦顯微鏡檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度。

1.6 ATP 合成的測(cè)量通過MAK190 ATP 檢測(cè)試劑盒（美國Sigma?Aldrich 公司）測(cè)定HeLa 細(xì)胞中的ATP 合成。將HeLa 細(xì)胞進(jìn)行裂變，離心5 min，將100 μL 上清液與100 μL 的ATP 工作稀釋液混合。測(cè)定340 nm 處的吸光度。

1.7 線粒體腫脹的測(cè)定用線粒體分離試劑盒（美國Thermo Scientific 公司）分離線粒體。首先，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，離心，將分離的線粒體懸浮在新鮮的溶脹緩沖液中，濃度為0.5 mg/mL。加入CaCl2（200 μmol/L），并通過監(jiān)測(cè)540 nm 處的吸光度在20 min 內(nèi)變化計(jì)算線粒體的腫脹。

1.8 短干擾RNA（siRNA）和轉(zhuǎn)染靶向特異PINK1?siRNA 慢病毒（Si?PINK1，序列：5′?ACATAACGAA?TCACTCGTTAT GA?3′）和對(duì)照siRNA（Si?NC，序列：5′?GACGTGGAACGTTCTTCATTTTT?3′）購自美國Santa Cruz 公司。使用Lipofectamine 2000（美國Invitrogen 公司）在6 孔板中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.9 Western blot分析用RIPA裂解緩沖液從HeLa細(xì)胞中提取總蛋白，然后通過電泳分離轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜與一抗Parkin（1∶500），Bax（1∶500），Bcl?2（1∶1 000），PINK1（1∶800），Cleaved caspase?3（1∶1 000），Cyt C、Cyto Cyt C、Mito Cyt C（1∶1 000）或β?actin（1∶2 000，均購自美國Cell Signaling 公司）在4 ℃下孵育過夜。然后，將膜洗滌并與抗小鼠或抗兔二抗在室溫下孵育1 h。用ECL Plus 可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行。當(dāng)P< 0.05 時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素抑制宮頸癌細(xì)胞的存活并誘導(dǎo)其凋亡如圖1A 和B 所示，燈盞花素以時(shí)間和劑量依賴性方式顯示出對(duì)細(xì)胞活力的顯著抑制作用（P<0.001），并且處理24 h 的抑制效果好于12 h。然而，燈盞花素對(duì)正常人細(xì)胞HcerEpic 的細(xì)胞毒性很小，低于HeLa（IC50=112.1 nmol/L）細(xì)胞（圖1C）。LDH 測(cè)定表明，在相同處理?xiàng)l件下，HeLa 細(xì)胞的LDH 泄漏量顯著增加（P<0.01）（圖1D）。此外，用燈盞花素治療24 h后，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，呈劑量依賴性（圖1E）。與對(duì)照組相比，用120 nmol/L 燈盞花素治療可顯著提高凋亡細(xì)胞百分率（16.8 倍）（P<0.001）。

2.2 燈盞花素誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙如圖2A 和B 所示，與對(duì)照組相比，隨著燈盞花素濃度的增加，綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（增加百分率分別為145%、184%和231%）。在燈盞花素處理的細(xì)胞中觀察到ATP 生成減少（減少百分率分別為85%、62%和41%）（圖2C）。此外，隨著燈盞花素濃度的增加，HeLa 細(xì)胞線粒體腫脹逐漸增加，表現(xiàn)為吸光度降低。

2.3 燈盞花素對(duì)線粒體功能障礙的特異性蛋白表達(dá)影響在HeLa 細(xì)胞中，Bax/Bcl?2 的比例、Cyt C和Cleaved caspase?3 隨燈盞花素濃度的增加而上調(diào)。同時(shí)，燈盞花素處理后，Cyto Cyt C 的釋放顯著增強(qiáng)（P< 0.01），而Mito Cyt C 的水平明顯降低（P<0.01）（表1）。

圖2 燈盞花素誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙Fig.2 Brevilin induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in cervical cancer cells

2.4 燈盞花素抑制宮頸癌細(xì)胞中的PINK1/Parkin途徑Western blot 分析（圖3A?B）顯示，與對(duì)照組相比，燈盞花素治療后PINK1（減少百分率分別為84%、61%和38%）和Parkin（減少百分率分別為80%、54%和31%）蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過PINK1 敲低上調(diào)了HeLa 細(xì)胞 中Bax/Bcl?2 比 例、Cleaved caspase?3、Cyt C 和Cyto Cyt C 蛋白表達(dá)，并下調(diào)了Mito Cyt C蛋白表達(dá)，表明抑制PINK1 表達(dá)有助于Cyt C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中（圖3C）。此外，功能學(xué)評(píng)價(jià)顯示，PINK1 敲低顯示出對(duì)HeLa 細(xì)胞活力的顯著抑制作用（降低百分率為49%），并提高凋亡細(xì)胞百分率和ROS（增加百分率為221%）的產(chǎn)生（圖3D?F）。

表1 燈盞花素對(duì)線粒體功能障礙的特異性蛋白表達(dá)影響Tab.1 Effect of brevilin on specific protein expression of mitochondrial dysfunction±s

表1 燈盞花素對(duì)線粒體功能障礙的特異性蛋白表達(dá)影響Tab.1 Effect of brevilin on specific protein expression of mitochondrial dysfunction±s

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

Bax/Bcl?2Cyt C/β?actin Cleaved caspase?3/β?actin Cyto Cyt C/β?actin Mito Cyt C/β?actin 組別Control Brevilin（30 nmol/L）Brevilin（60 nmol/L）Brevilin（120 nmol/L）1.00±0.04 1.96±0.09**4.12±0.28***6.18±0.33***1.00±0.02 1.48±0.15*1.86±0.20*2.22±0.23**1.00±0.04 1.65±0.11*1.94±0.23*2.37±0.28**1.00±0.02 1.25±0.13 1.71±0.19*2.12±0.26**1.00±0.02 0.86±0.07 0.61±0.08*0.44±0.05**

圖3 燈盞花素抑制宮頸癌細(xì)胞中的PINK1/Parkin 途徑Fig.3 Brevilin inhibits PINK1/Parkin pathway in cervical cancer cells

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素在正常HcerEpic 細(xì)胞中具有低細(xì)胞毒性，而在Hela 細(xì)胞中具有時(shí)間和劑量依賴性的抗癌作用。先前的研究［8-9］報(bào)道，燈盞花素對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性高于對(duì)正常細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。據(jù)報(bào)道［10］，天然化合物對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用與細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究中，燈盞花素有效促進(jìn)了Hela 細(xì)胞凋亡。在大多數(shù)癌細(xì)胞中，ROS 的過度產(chǎn)生是典型的凋亡現(xiàn)象［11-12］。HeLa 細(xì)胞暴露于燈盞花素后，ROS 水平升高并呈劑量依賴性，這導(dǎo)致LDH 的高釋放速率和脂質(zhì)過氧化程度。此外，細(xì)胞凋亡是由多種凋亡相關(guān)基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，越來越多的證據(jù)支持線粒體信號(hào)通路在天然化合物觸發(fā)的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用［13-14］。Bax、Bcl?2 等凋亡蛋白改變了線粒體膜通透性，釋放Cyt C，激活Caspase?3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9］。本研究中，HeLa 細(xì)胞暴露于燈盞花素會(huì)導(dǎo)致Bax/Bcl?2 比例上調(diào)，并且Cyt C 從線粒體到細(xì)胞質(zhì)的釋放量增加以及Caspase?3 級(jí)聯(lián)被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明線粒體信號(hào)通路介導(dǎo)了燈盞花素誘導(dǎo)的HeLa 細(xì)胞凋亡。

最近的研究［15-19］證實(shí)，PINK1/Parkin 信號(hào)通路在線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡中起樞軸作用。YAO 等［16］證明，敲低PINK1 可以顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的癌相關(guān)表型并阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程。此外，在宮頸癌中，PINK1 表達(dá)增加，促進(jìn)癌細(xì)胞惡性增殖和化療耐藥［20］。本研究中，燈盞花素治療后PINK1 和Parkin 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低。此外，PINK1 基因敲除與燈盞花素治療產(chǎn)生了類似的體外活性結(jié)果。所有這些數(shù)據(jù)表明燈盞花素介導(dǎo)的線粒體功能誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡至少部分歸因于PINK1/Parkin 途徑抑制。

綜上所述，燈盞花素治療抑制了PINK1/Parkin通路，從而抑制HeLa 細(xì)胞活力，提高凋亡細(xì)胞百分率和促進(jìn)ROS 產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)支持燈盞花素成為一種新的抗宮頸癌藥物。