石銘蕓，蔣中英

(伊犁師范大學(xué)電子與信息工程學(xué)院 微納電傳感器技術(shù)與仿生器械實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊寧 835000)

電場與生物工程相結(jié)合可產(chǎn)生高效、有益的現(xiàn)象，例如改變細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)傷口愈合和細(xì)胞生長、誘導(dǎo)外源分子跨膜輸運(yùn)等。若將生物細(xì)胞或組織暴露于脈沖電場中，可導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并增強(qiáng)其導(dǎo)電性或滲透性。研究者成功開發(fā)了最小細(xì)胞膜系統(tǒng)模型——囊泡，該模型可以更好地解釋細(xì)胞膜的多種響應(yīng)機(jī)理。目前，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的大部分理解都是基于這一簡單模型的研究[1]。囊泡的大小從幾十納米到幾十微米不等。囊泡由于組分及其溶液環(huán)境存在差異而呈現(xiàn)出不同的電特性，因此，在電場中可以對(duì)囊泡進(jìn)行精準(zhǔn)控制。囊泡在強(qiáng)脈沖電場作用下，脂質(zhì)雙分子層形成瞬時(shí)孔隙，脂質(zhì)膜的通透性顯著提高[2]，這種現(xiàn)象被稱為電穿孔或電滲透。作者主要以巨型單層囊泡(giant unilamellar vesicles，GUVs)暴露于脈沖電場為例，簡要介紹電穿孔技術(shù)的發(fā)展歷程，主要綜述脈沖電場導(dǎo)致囊泡成孔的作用機(jī)制，并展望未來的發(fā)展趨勢(shì)。

1 電穿孔技術(shù)的發(fā)展歷程

1965年，Coster[3]在進(jìn)行單細(xì)胞的電特性研究時(shí)，首次提出穿透效應(yīng)這一概念。1977年，Zimmermann等[4]發(fā)現(xiàn)，巨藻細(xì)胞在外加壓力下，臨界擊穿電位會(huì)隨外加壓力的增加而相應(yīng)降低，說明電場作用下的囊泡具有電場擊穿效應(yīng)[5]。1996年，Weaver等[6]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施加電場強(qiáng)度為kV·cm-1量級(jí)、持續(xù)時(shí)間約為微秒至毫秒量級(jí)的電脈沖刺激細(xì)胞時(shí)，脂質(zhì)雙分子層會(huì)出現(xiàn)孔隙，其電導(dǎo)率發(fā)生改變[7]。自2012年以來，一些科學(xué)家如Lee等[8]、Geng等[9]、Casciola等[10]給出了個(gè)案的經(jīng)驗(yàn)性指導(dǎo)，包括重要的電場控制參數(shù)的設(shè)置等。2017年，de Figueiredo等[11]從理論上分析了外部電場對(duì)脂質(zhì)分子和其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響。2020年，Karal等[12]討論了膽固醇對(duì)GUVs電穿孔的影響。因此，可以認(rèn)為GUVs的電穿孔行為強(qiáng)烈依賴于脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)。

國內(nèi)關(guān)于細(xì)胞電穿孔現(xiàn)象的研究也基于細(xì)胞模型揭示了脂質(zhì)膜的多種響應(yīng)機(jī)理，并得出了一般規(guī)律。1994年，劉纓等[13]研究表明，電穿孔大小、愈合速率與電脈沖參數(shù)有關(guān)。2006年，張弘[14]指出，施加的脈沖幅度是影響電穿孔的主要因素。2012年，談亞芳[15]定量分析了腫瘤細(xì)胞外膜、內(nèi)膜電穿孔效應(yīng)的波形參數(shù)條件，得到脂質(zhì)膜發(fā)生電穿孔的電脈沖波形參數(shù)閾值條件。2016年，Liu 等[16]研究表明，脂質(zhì)膜的電透性與囊泡脂質(zhì)雙層膜的組分直接相關(guān)。2017年，Rao等[17]采用微流控電穿孔技術(shù)促進(jìn)紅細(xì)胞膜磁性納米粒子的合成。2020年，姚陳果等[18]深入研究了微/納秒脈沖電場誘導(dǎo)電穿孔時(shí)細(xì)胞物理特性的差異。電穿孔技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并為癌癥的診斷和治療提供了更具體的數(shù)據(jù)參考和理論支撐。雖然電穿孔技術(shù)應(yīng)用廣泛，但關(guān)于外場作用下的脂質(zhì)膜形成孔隙和再組裝的動(dòng)力學(xué)過程及調(diào)控因素的研究仍較少。因此，深入開展該領(lǐng)域的研究有助于更好地實(shí)現(xiàn)電場對(duì)生物細(xì)胞及組織組裝行為的調(diào)控。

2 脈沖電場下囊泡成孔的作用機(jī)制

2.1 感應(yīng)跨膜電壓

脂質(zhì)雙分子層的兩親性結(jié)構(gòu)使離子無法滲透脂質(zhì)膜，其疏水層在外電場中呈弱極性。相較于周圍的水溶液，脂質(zhì)膜可以看作是一層薄的介電層，如果將該模型暴露于強(qiáng)直流電場環(huán)境中，可以觀察到電穿孔現(xiàn)象。脈沖電場作用下，囊泡如獨(dú)立的球體懸浮在均勻的直流電場中(圖1)。電場驅(qū)動(dòng)內(nèi)部和外部溶液中的帶電離子，使脂質(zhì)膜像電容器一樣帶電，通過膜電荷e積累形成感應(yīng)跨膜電壓Um。根據(jù)H.P.Schwan方程[16]，電場強(qiáng)度E增大時(shí)，Um隨時(shí)間t延長而增加。

Um=1.5ERcosθ(1-e-t/tchg)

(1)

圖1 暴露在電脈沖下的囊泡示意圖Fig.1 Schematic diagram of vesicles exposed to electrical pulse

其中，感應(yīng)跨膜電壓Um與囊泡半徑R成正比，隨脂質(zhì)膜上電場方向與指定點(diǎn)法線之間的夾角θ而變化；tchg為電荷在電場作用下脂質(zhì)雙分子層上累計(jì)的時(shí)間，它與膜電容Cm和脂質(zhì)雙分子層內(nèi)部溶液電導(dǎo)率λi及外部溶液電導(dǎo)率λe有關(guān)，可以表示為：

(2)

如果囊泡在電場中脈沖的持續(xù)時(shí)間長于充電時(shí)間，Um達(dá)到穩(wěn)態(tài)，即：

Um=1.5ERcosθ

(3)

隨著外加電場強(qiáng)度增大，脂質(zhì)膜上的膜電壓也隨之增加，當(dāng)Um=Ucr，囊泡將出現(xiàn)電穿孔現(xiàn)象，此時(shí)誘導(dǎo)膜電壓Ucr為跨膜臨界(閾值)電壓。為了確定變形或電穿孔時(shí)囊泡上的Um，通常需要使用數(shù)值計(jì)算。方程式(1)(3)僅適用于球形和未變形的囊泡，只能給出參考值。在實(shí)際中，需要考慮多種因素的影響，例如：囊泡大部分是不規(guī)則的球形；不同的囊泡其脂質(zhì)膜組分也不同；不同的培養(yǎng)條件以及不同的溶液成分造成生理環(huán)境存在差異，進(jìn)而對(duì)電穿孔有不同程度的影響。

2.2 脂質(zhì)膜上孔隙的形成

在沒有電場的情況下，脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性基于兩種相互競爭的能量，即：

E=2πaΓ-πa2τ

(4)

式中：第一項(xiàng)表示切割分子間相互作用所需要的能量以及建立半徑為a的柱形孔隙邊緣所需要的能量，用線張力Γ表示；第二項(xiàng)為在膜張力τ作用下通過釋放孔膜面積所獲得的能量。在這兩種能量的相互作用下產(chǎn)生了孔隙的臨界半徑，脂質(zhì)膜上的孔隙若超過該臨界半徑，囊泡發(fā)生不可逆破裂。

孔隙的形成改變了邊界條件，增強(qiáng)了電場效應(yīng)，根據(jù)Helfrich理論模型，當(dāng)施加電場后，電場下孔隙的成長方程式[19]為：

(5)

式中：Eproe為影響脂質(zhì)膜成孔的電場強(qiáng)度；d為膜厚度；ε0為真空介電常數(shù)；εW為水的相對(duì)介電常數(shù)；ε1為脂質(zhì)相對(duì)介電常數(shù)；V0為外加電壓。

當(dāng)跨膜的外加電壓V0增加時(shí)，導(dǎo)致Γeff=0或τeff=0(Γeff和τeff為電場加入后的有效值，Γ和τ為理想?yún)?shù))。當(dāng)Γeff=0時(shí)，V0的增加導(dǎo)致臨界半徑減小并促使囊泡破裂；反之，當(dāng)τeff=0時(shí)，V0的增加使脂質(zhì)膜上形成穩(wěn)定的孔隙。電導(dǎo)率導(dǎo)致孔隙周圍的電場線顯著變形；若孔隙半徑a過大，膜厚度d可忽略不計(jì)(圖2)。

2.3 脂質(zhì)膜的不穩(wěn)定性

囊泡的脂質(zhì)膜可看作是一個(gè)自放電式的電容，在脈沖電場的作用下，脂質(zhì)膜的充放電時(shí)間是非常重要的參數(shù)。肖華娟等[5]研究了電穿孔與電脈的關(guān)系，結(jié)果表明，脂質(zhì)膜的成孔率隨電場強(qiáng)度、脈沖個(gè)數(shù)或脈沖寬度的增加而提高(圖3)。Mauroy等[20]

圖2 孔隙形成后脂質(zhì)膜在外部電場中的示意圖Fig.2 Schematic diagram of lipid membrane after pore formation in external electric field

圖3 脈沖強(qiáng)度(a)、脈沖個(gè)數(shù)(b)、脈沖寬度(c、d)對(duì)脂質(zhì)膜成孔率的影響Fig.3 Effect of pulse intensity(a),pulse number(b),and pulse width(c,d) on pore formation probability of lipid membrane

沖參數(shù)之間也證實(shí)了脂質(zhì)損失是由電場中脈沖的持續(xù)時(shí)間所控制。Dimova等[21]進(jìn)一步研究了外加交流電場的頻率和囊泡內(nèi)、外部水溶液電導(dǎo)率的比值(χ=λi/λe)，發(fā)現(xiàn)囊泡可以變形成長橢球體(χ>1)或扁橢球體(χ<1)。通過在交流電場中測量囊泡的電變形，可以得到脂質(zhì)膜的相關(guān)機(jī)械性能，如抗彎剛度、電性能和電容等。Riske等[22]利用相差顯微鏡和高速數(shù)碼相機(jī)研究了GUVs在50～300 μs脈沖下的電變形，發(fā)現(xiàn)了類似的GUVs變形對(duì)電導(dǎo)率比值χ的依賴關(guān)系，并強(qiáng)調(diào)了離子在外部溶液中的影響。在無離子存在的情況下，GUVs變形成長橢球體；加入離子后，GUVs瞬間變形成特殊的圓柱形，同樣取決于電導(dǎo)率比值χ(圖4a)。此外，他們通過測定變形的GUVs長寬比a/b來確定變形的程度(圖4c)。結(jié)果表明，變形程度隨電場強(qiáng)度的增加或脈沖持續(xù)時(shí)間的延長而提高，同時(shí)也取決于GUVs的初始張力。關(guān)于脈沖電場誘導(dǎo)不規(guī)則形狀細(xì)胞的電穿孔行為，Mescia等[23]又提出了一種數(shù)值算法，并根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)案例分析了電穿孔過程中細(xì)胞類型、形狀對(duì)電穿孔特性的影響。結(jié)果表明，該模型是研究任意形狀細(xì)胞電穿孔問題的有效數(shù)值工具。值得注意的是，GUVs在電場脈沖過程中的變形是動(dòng)態(tài)的，并取決于脈沖持續(xù)時(shí)間、電場強(qiáng)度、χ以及外部溶液中存在的離子等。

a.在200 s、2 kV·cm-1的脈沖作用下，χ=1.38、λi=16.5 μs·cm-1、λe=12 μs·cm-1時(shí)GUVs呈管狀變形

綜上所述，通過對(duì)脈沖反饋信號(hào)測量結(jié)果的分析可進(jìn)一步了解脈沖電場與脂質(zhì)膜相互作用機(jī)制，從而更加準(zhǔn)確地模擬細(xì)胞在脈沖電場作用下的動(dòng)態(tài)行為，為進(jìn)一步推進(jìn)脈沖電場的應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)也建議通過此反饋信號(hào)來建立電穿孔效果實(shí)時(shí)評(píng)估體系。

2.4 脂質(zhì)膜的組分

囊泡的使用對(duì)于控制其脂質(zhì)膜的組分具有顯著的優(yōu)勢(shì)，改變膜組分可調(diào)整膜的流動(dòng)性和均一性，并獲得特定外場作用下孔隙的尺寸和提高孔隙的穩(wěn)定性。Dimova等[24]發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)電脈沖可誘導(dǎo)電中性磷脂酰膽堿(PC)囊泡成孔，并在脈沖結(jié)束后該孔隙又重新封閉，其中導(dǎo)致電穿孔的脈沖電壓是跨膜臨界電壓的數(shù)倍以上，而負(fù)電荷磷脂酰甘油(PG)囊泡則在強(qiáng)脈沖作用下出現(xiàn)破裂、崩解或出芽等現(xiàn)象。Gurtovenko等[25]研究顯示，與1-棕櫚?；?2-油?；字Ｄ憠A (POPC)囊泡相比，1-棕櫚酰基-2-油?；字Ｒ掖及?POPE)囊泡雙分子層的臨界電壓更高。分析表明，POPE比POPC的密度更大，阻礙了水分子在雙分子層中的滲透，并減緩了脂質(zhì)頭部基團(tuán)進(jìn)入孔隙的重新定向過程。Riske等[26]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PC與PG按1∶1的比例組成的負(fù)電荷GUVs暴露在電脈沖下時(shí)，可觀察到一種爆破效應(yīng)(圖5)。

此外，膽固醇的添加也可以降低或提高電穿孔臨界電壓。Mauroy等[27]研究表明，POPC囊泡上膽固醇濃度的增大會(huì)導(dǎo)致臨界電壓升高，而該膽固醇對(duì)PC囊泡的臨界電壓沒有顯著影響。Karal等[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)和膽固醇混合GUVs膜中膽固醇濃度的增大，在外加電場作用下脂質(zhì)膜的成孔率和成孔速率常數(shù)降低(圖6)。表明在電場作用下，GUVs膜的線張力隨膽固醇濃度增大而增大，是造成成孔速率常數(shù)減小的主要原因?？偟膩碚f，膽固醇對(duì)脂質(zhì)雙分子層的影響是不同的，并且強(qiáng)烈依賴于脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)。因此，可以根據(jù)不同脂質(zhì)膜組分優(yōu)化其電化學(xué)參數(shù)，這對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)意義也有著重要的影響[28]。

a.脈沖參數(shù)：1.4 kV·cm-1,tpulse=200 μs

3 結(jié)語

目前，電穿孔技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)及遺傳工程等多個(gè)領(lǐng)域，在電脈沖結(jié)合抗癌藥物加速腫瘤細(xì)胞消亡的研究、遺傳物質(zhì)的電轉(zhuǎn)染技術(shù)、非熱效應(yīng)殺菌、經(jīng)皮給藥[29]、抑制基因表達(dá)等方面都具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。但是電穿孔技術(shù)在應(yīng)用中對(duì)部分細(xì)胞特性的分析并不是十分完善，特別是在如何由更復(fù)雜的GUVs系統(tǒng)來闡明活細(xì)胞膜成孔時(shí)的作用機(jī)制等方面仍然面臨很大的挑戰(zhàn)。

圖6 單個(gè)GUVs的孔隙形成的熒光圖像(a)、GUVs的隨機(jī)孔隙形成時(shí)間(b)、不同膽固醇(chol)組分GUVs的線張力(Γ)與GUVs在時(shí)長60 s內(nèi)成孔率(Ppore)的關(guān)系(c)、添加15%膽固醇的GUVs在Γ為7 mN·m-1、8 mN·m-1和9 mN·m-1時(shí)的時(shí)間歷程(d)Fig.6 Fluorescence images of pore formation of single GUVs(a),random pore formation time of GUVs(b),relationship between thread tension(Γ) of GUVs with different cholesterol components and pore formation probability(Ppore) of GUVs in 60 s(c),and time course of GUVs with 15% cholesterol at Γ=7 mN·m-1,8 mN·m-1，and 9 mN·m-1(d)

今后，脂質(zhì)膜成孔級(jí)聯(lián)過程重新打開孔隙的所需時(shí)間與一般脂質(zhì)膜系統(tǒng)所需時(shí)間的數(shù)量級(jí)比較及原因探究，將是未來的努力研究方向；膜蛋白在受到電場作用時(shí)，影響細(xì)胞膜通透性改變的成因分析也將是未來的研究重點(diǎn)。展望未來，還將開辟一個(gè)領(lǐng)域，即利用電場作為一種非接觸式診斷工具來測量細(xì)胞機(jī)械性能的變化，并區(qū)分與疾病進(jìn)展相關(guān)的重要生物學(xué)因素(如病理、遺傳和表觀遺傳等)。