顧翰琦 邵玲智 劉冉 劉曉光 李玲 劉倩 李潔 張雅麗

（1. 河北民族師范學院生物與食品科學系，承德 067000；2. 河北琢酒集團有限公司，承德 067600）

木質(zhì)纖維素具有環(huán)境友好性和可再生性的特點，是纖維素乙醇最具發(fā)展?jié)摿Φ纳a(chǎn)原料［1］。但在利用木質(zhì)纖維素原料之前需要進行預處理破壞其復雜致密的結(jié)構(gòu)［2］。在預處理過程中會產(chǎn)生酚類、呋喃類和有機弱酸類毒性物質(zhì)，這對微生物細胞活性以及乙醇發(fā)酵具有很大的抑制作用。其中酚類物質(zhì)的毒性最強，特別是酚酸抑制物種類多、濃度高，對纖維素乙醇生產(chǎn)過程產(chǎn)生嚴重影響［3］。因此有必要篩選或構(gòu)建酚酸耐受性釀酒酵母，并對其耐受機制進行研究。

為應(yīng)對木質(zhì)纖維素預處理衍生抑制物的毒害作用，已有研究通過脫毒法、基因工程改造和適應(yīng)進化等策略提高酵母細胞對抑制物的耐受性［4-5］。其中，適應(yīng)進化方法是在無需相關(guān)遺傳信息和分子作用機制的背景下，通過定向的適應(yīng)和篩選能夠有效獲得耐受菌株的策略［6］。其具有能夠在較短的時間內(nèi)有效定向的改變菌株的某些表型或者生理特性并且基本不會影響目的表型以外的其他優(yōu)良性狀的優(yōu)點。在前期研究中已經(jīng)通過適應(yīng)進化策略構(gòu)建了酚酸耐受性酵母菌株，并且發(fā)現(xiàn)適應(yīng)進化菌株在酚酸脅迫下能表現(xiàn)良好的細胞膜完整性［7］，但是其耐受性提高的作用機制尚不明確。

細胞膜作為細胞與外界環(huán)境的屏障，對于維持細胞膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、控制物質(zhì)進入、信息傳遞及能量流動都有著重要作用［8］。在工業(yè)微生物抗逆性研究方面，已有大量研究從酵母細胞質(zhì)膜組分代謝和調(diào)控應(yīng)答、細胞膜信號途徑、質(zhì)膜抗逆基因等方面揭示酵母細胞質(zhì)膜抗逆應(yīng)答機制［9］。當外界環(huán)境中存在抑制物、高滲、低滲、pH等脅迫因素時，首先對細胞膜造成嚴重的破壞。研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)纖維素衍生的酚酸化合物對發(fā)酵微生物抑制作用主要因其具有疏水性芳香環(huán)，從而容易進入細胞膜并破壞膜的完整性［7，10］。鞏林林等［11］研究發(fā)現(xiàn)乙腈會溶解細胞膜表面脂質(zhì)，增加細胞膜的流動性，導致酵母細胞膜部分出現(xiàn)裂痕，從而增加致死率。郭紅等［12］研究表明極端高糖產(chǎn)生的高滲脅迫下通過干預脂肪酸的組成和含量影響細胞膜的流動性和滲透性，從而提高細胞對高滲的耐受性。其他多項研究表明脂肪酸飽和度和?；L度的變化可以維持細胞膜的流動性，提高酵母細胞對乙醇的耐受性［8］。Tian等［13］研究發(fā)現(xiàn)通過降低細胞中飽和脂肪酸和短鏈脂肪酸含量，同時提高麥角固醇含量能夠抵御環(huán)境脅迫。上述研究說明壓力脅迫下細胞膜的性質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)組成變化對微生物抗逆性起到非常重要作用。

磷脂、甾醇和鞘脂作為酵母細胞膜的主要組成成分，對于維持細胞膜結(jié)構(gòu)和生物學功能有重要作用。脂質(zhì)組學研究方法作為代謝組學的一個分支主要對細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝物進行檢測、鑒定和系統(tǒng)的比較分析。本研究在適應(yīng)進化構(gòu)建酚酸耐受性釀酒酵母的基礎(chǔ)上，通過脂質(zhì)組學分析方法對酚酸脅迫下野生型和適應(yīng)進化型菌株的脂質(zhì)成分進行系統(tǒng)分析。主要從細胞膜磷脂的種類分布及其脂酰鏈結(jié)構(gòu)變化等方面進行統(tǒng)計分析。并通過統(tǒng)計學分析方法篩選酚酸耐受性酵母的顯著差異的磷脂成分。為細胞膜工程改造理性構(gòu)建抗逆性菌株提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），購自安琪酵母股份有限公司。以其作為原始菌株經(jīng)過混合酚酸適應(yīng)進化得到耐受性菌株S. cerevisiaePAT01（能耐受導致酵母細胞產(chǎn)生50%生長抑制的酚酸濃度），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC No.18021。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck公司）；甲酸、L-2-氯-苯丙氨酸為色譜純（美國Sigma-Aldrich公司）；香草酸、對羥基苯甲酸、丁香酸為分析純（上海阿拉丁化工有限公司）；Yeast Extract為生物試劑（英國Oxoid公司）；其他試劑均為分析純，購自天津科密歐化學試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、2 g/L K2HPO4、1 g/L MgSO4、1 g/L（NH4）2SO4、10 g/L Yeast Extract溶于水后121℃高壓滅菌20 min?；旌戏铀崤囵B(yǎng)基：合成培養(yǎng)基中加入適量香草酸、對羥基苯甲酸和丁香酸溶于二甲基亞砜的母液，使培養(yǎng)基中最終濃度分別1.44 g/L、0.87 g/L和0.72 g/L。PBS緩沖液：8.00 g/L NaCl，0.20 g/L KCl，1.42 g/L Na2HPO4，0.24 g /L KH2PO4，pH7.4。

1.2 方法

1.2.1 酵母細胞培養(yǎng)收集 將釀酒酵母野生型菌株WT和適應(yīng)進化菌株P(guān)AT01分別在20 mL合成培養(yǎng)基中活化18 h，取適量菌液調(diào)節(jié)菌體密度至600 nm吸光值（OD600）為7-8，以10%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接至混合酚酸培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h后收集菌體。2 mL菌液與等體積預冷的60%（V/V）甲醇溶液混合［10］，4427×g，4oC離心10 min，棄上清。稱取菌體沉淀（濕重）不少于200 mg，-80oC保存?zhèn)溆?。參考相關(guān)脂質(zhì)組學研究［14-15］，確定每種菌株制備3個平行樣品。

1.2.2 細胞脂質(zhì)提取 稱取酵母細胞樣品200 mg，加入甲醇溶液（含5 μg/mL L-2-氯-苯丙氨酸作為內(nèi)標）300 μL，在50 Hz條件下勻漿2 min，冰水浴超聲20 min。在4℃，11167×g離心10 min，最后取200 μL上清液待測。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析 使用Agilent 1290 Infinity和Agilent 6545 UHD Accurate-Mass Q-TOF系統(tǒng)（美國Agilent公司）進行LC-MS分析。液相色譜條件：色譜柱為Waters XSelect HSS T3（2.5 μm，100 mm×2.1 mm）（美國Waters公司），柱溫35oC，流動相A為0.1%甲酸的水溶液，流動相B為0.1%甲酸的乙腈溶液，流速350 μL/min，梯度 洗 脫：0-2 min，5% B；2-10 min，5%-95% B；10-15 min，95% B；15-18 min，95%-5% B， 進樣量2 μL；質(zhì)譜條件：毛細管電壓為3.5 kV，干燥氣體流速10 L/min，溫度325℃，噴霧器壓力為20 psig。正、負離子模式下質(zhì)譜的掃描范圍分別為100-3000 m/z和100-1700 m/z。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 LC-MS數(shù)據(jù)處理：將LC-MS檢測的原始數(shù)據(jù)通過Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.08.00軟件（美國Agilent公司）轉(zhuǎn)換成mz.data格式。然后使用XCMS 3.2.0程序?qū)?shù)據(jù)進行峰識別、保留時間校正、峰匹配等操作，得到包含m/z、RT和樣品特征信號強度匹配信息的.csv格式數(shù)據(jù)包。將數(shù)據(jù)包通過LipidFinder在線數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得樣品脂質(zhì)信息，然后對上述數(shù)據(jù)進行內(nèi)標歸一化處理。最后通過正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）方法篩選WT和PAT01兩酵母菌株顯著性差異脂質(zhì)分子。

2 結(jié)果

2.1 酵母細胞主要脂質(zhì)成分分析

脂質(zhì)分子是細胞膜的酵母細胞膜組成成分，不同種類脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)存在明顯差異直接影響細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。因此，通過LC-MS方法對釀酒酵母WT和PAT01兩菌株脂質(zhì)成分進行檢測，進一步分析適應(yīng)進化酵母對酚酸耐受性的分子機制。結(jié)果如圖1所示，同一菌株的平行樣品在正、負離子模式總離子流譜圖中的色譜峰信號強度和保留時間均表現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。而兩菌株在特定保留時間區(qū)域的峰信號強度存在明顯差異。這說明檢測系統(tǒng)穩(wěn)定，所得數(shù)據(jù)可靠，而且兩菌株脂質(zhì)成分含量存在差異。進一步對兩菌株脂質(zhì)成分進行鑒定和統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖2所示。WT和PAT01菌株在正、負離子模式下共檢測到565種脂質(zhì)分子，所有脂質(zhì)分子共涉及21種亞類，分別歸屬于甾醇（Ste、C24-Pr-S、Sec、Stigma、Ste-con、Erg、Other-ST），鞘脂（Cho、Sul、Other-SP、N-GLS、Cer、PSL、Sph、GM）和磷脂（PA、PC、PE、PG、PI、PS）三大類脂質(zhì)。其中，磷脂的種類最多，占總脂質(zhì)種類的80%以上，這與酵母細胞膜中磷脂含量基本一致［16］。

2.2 酵母細胞膜磷脂組成分析

磷脂雙分子層作為細胞膜的基本支架，磷脂的親水頭部基團種類和疏水尾脂酰鏈的長度與飽和度等對細胞膜的性質(zhì)和功能起決定作用［17］。因此，進一步從以上3個方面對WT和PAT01菌株細胞膜磷脂分布進行比較分析。主要包括：磷脂酸（PA）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰絲氨酸（PS）。結(jié)果如圖3所示，不同頭部基團種類的磷脂分布方面，WT菌株中PE、PG和PS相對含量較高，含量分別超過20%，而酚酸耐受的進化菌株P(guān)AT01中相對含量最高的磷脂分別為PE、PC和PI，比WT中相應(yīng)磷脂增加1.8、3.8和2.22倍（圖3-a）。根據(jù)脂酰鏈不飽和鍵數(shù)量對磷脂分布統(tǒng)計，WT菌株中含飽和脂酰鏈、一個不飽和鍵和兩個不飽和鍵脂酰鏈的磷脂含量分布相對平均，相對含量均在30-40%。而適應(yīng)進化菌株P(guān)AT01中含兩個不飽和鍵的磷脂含量明顯增加，占總磷脂含量的70%以上（圖3-b）。進一步根據(jù)磷脂脂酰鏈碳的原子數(shù)量統(tǒng)計含有不同脂酰鏈長度的磷脂分布，WT菌株磷脂脂酰鏈長度主要分布在C28、C32、C34和C36，另外少量分布在超長鏈C40以上，其中C28的磷脂含量最高。而PAT01菌株集中分布在含C32、C34和C36的磷脂組分，大部分由C16、C18和C20的長鏈不飽和脂肪酸構(gòu)成（圖3-c）。結(jié)果表明，適應(yīng)進化酵母細胞膜磷脂發(fā)生了明顯的重塑現(xiàn)象。

2.3 顯著性差異磷脂成分分析

利用正交偏最小二乘判別對WT和PAT01菌株的脂質(zhì)測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析（OPLS-DA），篩選對適應(yīng)進化菌株酚酸耐受性起重要作用的顯著差異磷脂標志物。結(jié)果如圖4所示，OPLS-DA得分結(jié)果表明WT和PAT01菌株組間具有明顯的分離趨勢，x軸第一主成分t［1］反映了組間差異最大化，y軸to［1］正交主成分表現(xiàn)出兩組數(shù)據(jù)的組內(nèi)變異情況（圖4-a-b）。Permutation檢驗圖用于反映模型的可靠性，其中R2代表模型解釋率，Q2代表模型預測率，數(shù)值越大說明模型具有更好的解釋和預測能力。正離子模式下兩組累積R2Y=0.99，Q2=0.82；負離子模式累積R2Y=1.00，Q2=0.90（圖4-c-d）。該模型的S-plot圖中，分布在右上角和左下角離原點越遠的點表明對組間差異的貢獻度越大，模型得到的變量權(quán)重值（VIP）也越大，這些點代表WT和PAT01兩菌細胞中存在顯著差異的脂質(zhì)分子（圖4-e-f）。

圖1 酚酸脅迫下釀酒酵母脂質(zhì)成分LC-MS分析總離子流圖（TIC）

圖2 酚酸抑制物作用下釀酒酵母脂質(zhì)種類分布

圖3 酚酸脅迫下酵母菌株細胞膜磷脂相對含量分布

圖4 酚酸適應(yīng)進化菌株脂質(zhì)正負離子模式下OPLS-DA模型分析

根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值（≥1），并結(jié)合獨立樣本t檢驗P值（＜0.05）以及差異倍數(shù)（FC＞2或＜0.5）作為標準，進一步篩選WT與PAT01菌株之間的顯著性差異脂質(zhì)代謝物［18］。FC代表兩菌株中不同磷脂分子相對含量的比值，以2為底取對數(shù)得到log2FC，可以直觀判斷不同磷脂分子相對含量的變化情況，log2FC＞0，表示磷脂相對含量增加，反之降低［19］。結(jié)果如表1所示，兩菌株顯著性差異變化的磷脂種類主要集中在PC和PE。PAT01菌株相比WT菌株，PC類中含有短脂酰鏈、飽和脂酰鏈的磷脂分子，以及只含有單個脂酰鏈的溶血磷脂酰膽堿（LPC）相對含量減少（LPC 4：0、LPC 5：0、LPC 14：0），而PC和PE含有長鏈和不飽和脂酰鏈的磷脂相對含量增加（PC 34：2、PC 35：2、PC 36：1、PC 36：2、PE 34：2、PE 36：2、PE 40：2）。這與上述磷脂組成分布統(tǒng)計結(jié)果一致，說明適應(yīng)進化菌株P(guān)AT01對酚酸耐受性提高可能是由于細胞膜磷脂重塑導致，特別是PC和PE磷脂分子結(jié)構(gòu)和分布變化起重要作用。

表1 PAT01/WT顯著性差異磷脂分子

3 討論

木質(zhì)素降解產(chǎn)生酚酸化合物對發(fā)酵微生物抑制作用機制主要表現(xiàn)在其疏水性芳香環(huán)能夠進入細胞膜并破壞其完整性，同時酚酸進入細胞后解離釋放質(zhì)子，從而導致細胞內(nèi)物質(zhì)外泄、ROS增加、pH紊亂及嚴重的細胞自噬等。我們前期研究發(fā)現(xiàn)通過酚酸適應(yīng)進化的釀酒酵母菌株P(guān)AT01與初始菌株WT相比，在酚酸作用下能夠保持更高的細胞膜完整性和較低的滲透性。細胞膜的這些性質(zhì)與其磷脂成分的頭部親水基團種類和尾部脂酰鏈結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究通過脂質(zhì)組學分析方法對釀酒酵母細胞膜磷脂成分進行系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對酚酸有耐受性的進化菌株磷脂種類分布和脂酰鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其顯著性差異的磷脂分子主要是PC和PE類含長鏈不飽和脂酰鏈的磷脂分子。首先，進化菌株P(guān)AT01與WT菌株相比，PE、PC和PI相對含量增加。PC和PE是細胞膜中主要的磷脂成分，說明進化菌株P(guān)AT01在酚酸作用下仍能保持相對正常的細胞膜組分，而WT菌株則可能由于細胞膜被破壞導致磷脂成分分布發(fā)生明顯變化。PE和PC合成代謝之間存在密切聯(lián)系，PE主要在線粒體中合成，部分運送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過連續(xù)甲基化轉(zhuǎn)化為PC，因此PE的含量直接影響PC的合成。酵母細胞PC和PE相對含量對調(diào)節(jié)細胞膜曲率、維持細胞膜的穩(wěn)定方面起重要作用。PE由于頭部乙醇胺基團很小呈圓錐形，自由組裝成膜時容易形成負向彎曲，而PC頭部基團為帶有3個甲基乙醇胺基團，相對較大，與脂酰鏈形成圓柱形，趨于形成平行的雙層膜。因此，兩種磷脂的分布比例能夠有效調(diào)節(jié)膜的曲率和橫向應(yīng)力，從而保持膜穩(wěn)定［17］。已有研究表明，釀酒酵母在含有木質(zhì)纖維素衍生抑制物乙酸、糠醛和苯酚壓力脅迫下，PE/PC比例明顯增加，有效提高了細胞膜完整性并降低了細胞膜通透性，從而提高酵母對抑制物的耐受性［20］。另外，真核細胞中PE是調(diào)節(jié)細胞膜流動性的關(guān)鍵因素，PE的頭部基團能夠與附近磷脂分子的氨基頭部基團和磷酸殘基形成氫鍵，因此PE含量增加能夠有效提高膜穩(wěn)定性和剛性［17，21-22］，這有助于提高膜對外界毒性分子的屏蔽作用。已有研究報道，釀酒酵母在含有高濃度鎘、鋅、鐵或鋁離子的環(huán)境中培養(yǎng)時，細胞磷脂含量明顯增加，其中PE含量增加最顯著，從而維持細胞膜穩(wěn)態(tài)［23-24］。此外，由于磷脂頭部基團所帶電荷不同，PC和PE均屬于兩性離子類磷脂，而其余PA、PG、PI和PS都屬于陰離子類磷脂，細胞膜中陰離子類與兩性離子類磷脂的比例對膜電勢又調(diào)控作用，增加膜電勢有助于細胞去極化從而使細胞具有更大的柔韌性，對環(huán)境壓力不敏感。已有研究報道，陰離子類與兩性離子類磷脂的比值下降時釀酒酵母細胞對鹽離子表現(xiàn)出更強的耐受能力［25］。此外，另一種含量明顯增加的磷脂PI與細胞活性有關(guān)，在調(diào)控細胞生長功能等方面起重要作用［13］。PI相對含量增加有助于提高釀酒酵母對木質(zhì)纖維素預處理抑制物耐受性。已有研究表明，含有長脂酰鏈的PI對提高細胞膜流動性和降低滲透性有重要作用［20］。通過補充PI的生物合成前體物質(zhì)肌醇能夠有效改善釀酒酵母對木質(zhì)纖維素衍生抑制物耐受性［26］。

另一方面，磷脂尾部脂酰鏈結(jié)構(gòu)對膜的性質(zhì)功能同樣起到重要作用。已有大量研究通過基因工程改造調(diào)控細胞膜的飽和與不飽和脂肪酸比例或降低短鏈脂肪酸含量等策略應(yīng)對細胞膜損傷問題［27］。飽和脂酰鏈在生理溫度下趨于形成不流動緊密結(jié)合的凝膠狀態(tài)，而不飽和脂酰鏈使膜具有流動性［28］。有研究證明增加不飽和脂肪酸含量不僅能提高釀酒酵母對辛酸的耐受性而且減輕膜滲漏［29］。通過過表達脂肪酸去飽和酶（ELO1和OLE1）能夠有效提高油酸含量，增加膜穩(wěn)定性，進一步提高酵母對乙酸的耐受性［30-31］。脂酰鏈的長度與磷脂雙分子層的厚度呈正相關(guān)，細胞膜厚度增加從而增加外界有毒物質(zhì)跨膜的行程和阻力，從而降低膜的通透性。有研究通過在釀酒酵母細胞過表達脂酰鏈酰基延長酶能夠提高硬脂酸和油酸含量以及平均鏈長度，從而使其細胞膜完整性增強［27］。

4 結(jié)論

通過對釀酒酵母野生型菌株WT與酚酸耐受性適應(yīng)進化菌株P(guān)AT01進行脂質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)PE、PC和PI相對含量明顯增加，含有長鏈脂酰鏈的磷脂成分以及含有兩個不飽和脂酰鏈的磷脂成分相對增加。據(jù)此推斷適應(yīng)進化酵母菌株對酚酸耐受性提高的機制在于細胞膜發(fā)生磷脂成分重塑，有效提高細胞膜完整性，使細胞膜在酚酸壓力脅迫下仍能保持穩(wěn)態(tài)，從而對酚酸抑制物起到選擇性屏障作用。