趙 晗 于麗佳 吳志生 張穎琳 張華偉 師曉棟

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委職業(yè)安全衛(wèi)生研究中心，北京 102308；2.泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)管理委員會(huì)，江蘇 泰州 225300)

鉛(Pb)在自然環(huán)境中穩(wěn)定性強(qiáng)且不易降解，長(zhǎng)期接觸會(huì)在人體內(nèi)累積[1]，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2-4]、腎臟[5]、生殖系統(tǒng)[6]、骨骼[7]等造成損害。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、高效且特異性強(qiáng)的鉛離子檢測(cè)方法對(duì)人體健康和環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

目前，關(guān)于重金屬檢測(cè)比較成熟的方法主要有原子吸收法[8]、原子熒光法[9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10]、雙硫腙比色法[11]等，這些方法具有準(zhǔn)確度高、選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但存在前處理復(fù)雜、需要大型儀器支持、檢測(cè)速度慢等缺點(diǎn)。近年來(lái)，一些依賴于納米材料或核酸適配體的新型檢測(cè)技術(shù)也常被用于重金屬檢測(cè)，主要包括電化學(xué)分析法[12]、熒光法[13]、化學(xué)發(fā)光法[14]、比色分析法[15]等。核酸適配體是一段具有三維空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA或RNA，其可以與靶標(biāo)發(fā)生特異性結(jié)合[16]。因此，構(gòu)建檢測(cè)方法時(shí)，適配體可被用作一種優(yōu)良的分子識(shí)別元件。由于適配體是在體外設(shè)計(jì)和篩選的，原則上任何靶標(biāo)都可以有其對(duì)應(yīng)的適配體，且適配體在信號(hào)傳導(dǎo)和化學(xué)修飾方面具有更加優(yōu)良的特性，因此應(yīng)用適配體技術(shù)的檢測(cè)方法往往具有更高的靈敏度。

近年來(lái)，菁染料以其良好的物理化學(xué)性質(zhì)在生物檢測(cè)領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注[17-18]。菁染料是一類非常重要的有機(jī)功能染料，具有摩爾吸收系數(shù)高、光譜范圍廣、熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)[19]。相比于傳統(tǒng)單分子探針，菁染料超分子聚集體的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在：① 菁染料在溶液體系中可以自組裝形成高級(jí)聚集體；② 菁染料的聚集體對(duì)環(huán)境敏感，超分子聚集體可以被調(diào)控，自身的濃度、結(jié)構(gòu)、體系中所帶的電荷和環(huán)境溫度可以調(diào)控菁染料聚集體；③ 菁染料的聚集體識(shí)別信號(hào)可以級(jí)聯(lián)放大[20]。研究擬利用Pb2+適配體和噻菁染料結(jié)合生成特異識(shí)別模塊，使其與Pb2+發(fā)生高特異性結(jié)合形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，此G-四鏈體可將體系中以二聚體形式存在的噻菁染料(Dye2)誘導(dǎo)解聚為單體，比較其吸光度差異，以實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+簡(jiǎn)便、快速、高效的檢測(cè)，旨在構(gòu)建一種快速高效檢測(cè)水中Pb2+的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鉛離子適配體：序列為T30695(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)，生工生物工程(上海)股份有限公司；

MgCl2·6H2O、ZnCl2、NiCl2·6H2O、CoCl2·6H2O、CrCl3·6H2O、NaCl：分析純，北京化工集團(tuán)有限公司；

Pb2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL，中國(guó)計(jì)量學(xué)院；

2-甲基苯并[1,2-d]噻唑：薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

2-(甲硫基)苯并噻唑、1，3-丙磺酸內(nèi)酯：梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101K型，鄭州恒巖儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-201D型，鞏義市河洛德正儀器廠；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV 3600 Plus型，日本島津公司；

手提式紫外分析儀：WFH-2048型，杭州齊威儀器有限公司。

1.2 重金屬Pb2+檢測(cè)原理

T30695[21]作為Pb2+適配體，可以在Pb2+存在的情況下形成G-四鏈體。試驗(yàn)研究在Pb2+存在下通過(guò)寡核苷酸序列T30695對(duì)噻菁染料的二聚體和單體進(jìn)行組裝和拆卸的物理過(guò)程。該噻菁染料(Dye2)在甲醇中主要以單體形式存在，在水溶液中主要以二聚體形式存在，以T30695為模板可將Dye2的二聚體誘導(dǎo)成單體?；卩巛既玖显诙垠w和單體之間的組裝轉(zhuǎn)化特性，通過(guò)Uv-vis光譜變化在T30695的存在下構(gòu)建一種簡(jiǎn)單的Pb2+檢測(cè)方法(見(jiàn)圖1)。在體系中缺乏Pb2+的情況下，Dye2的二聚體不能被T30695解聚；加入Pb2+后，二聚體可被誘導(dǎo)成單體與G-四鏈體相互作用。

矩形代表Dye2單體，菱形代表G-四分體圖1 重金屬Pb2+檢測(cè)機(jī)制示意圖Figure 1 Schematic diagram of heavy metal Pb2+ detection mechanism

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.2 Dye2在溶液中的聚集狀態(tài) 將3.5 μL 500 μmol/L 的Dye2儲(chǔ)備液分別加入到346.5 μL不同比例的甲醇—超純水混合液中(V甲醇∶V超純水分別為0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0)，室溫下避光反應(yīng)2 h，測(cè)定紫外吸收光譜。

1.3.3 體系中適配體T30695濃度優(yōu)化 將3.5 μL 500 μmol/L 的Dye2儲(chǔ)備液分別加入到不同體積的超純水中，再加入不同體積的100 μmol/L的T30695和21 μL 500 μmol/L的鉛離子溶液，室溫下避光反應(yīng)2 h，測(cè)定紫外吸收光譜。

1.3.4 體系反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 向超純水中加入500 μmol/L 的Dye2儲(chǔ)備液3.5 μL和100 μmol/L適配體T30695 26.25 μL，再加入500 μmol/L鉛離子溶液21 μL，渦旋后立即檢測(cè)紫外吸收光譜，并每隔2 min檢測(cè)一次，直至混合液的紫外吸收光譜無(wú)變化。

1.3.5 鉛離子紫外光譜檢測(cè) 將Dye2溶解于甲醇中，制成500 μmol/L的儲(chǔ)備液。先向EP管中加入不同體積的超純水，再加入500 μmol/L的Dye2儲(chǔ)備液3.5 μL，渦旋并避光保存10 min。然后加入100 μmol/L的核酸適配體T30695 26.25 μL和不同體積的鉛離子溶液500 μmol/L，渦旋，最終混合液總體積為350 μL。將混合液于室溫下避光反應(yīng)2 h，同時(shí)配制空白樣品作為比對(duì)。將混合液轉(zhuǎn)移至比色皿中，檢測(cè)300～600 nm的紫外吸收光譜。

1.3.6 離子特異性 向每個(gè)EP管中依次加入超純水，500 μmol/L 的Dye2儲(chǔ)備液3.5 μL和100 μmol/L適配體T30695 26.25 μL ，分別向每個(gè)EP管中加入不同的金屬離子溶液(Mg2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Cr3+、Na+、Pb2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+)，最終混合液總體積為350 μL。溶液充分振蕩，避光反應(yīng)2 h，測(cè)定紫外吸收光譜。

1.3.7 回收率試驗(yàn) 向每個(gè)EP管中加入稀釋1 000倍后的自來(lái)水(稀釋是為了減少自來(lái)水中其他離子對(duì)試驗(yàn)的干擾)、500 μmol/L的Dye2儲(chǔ)備液3.5 μL和100 μmol/L 適配體T30695 26.25 μL，再加入不同濃度的鉛離子儲(chǔ)備液，渦旋，最終混合液總體積為350 μL。將混合液于室溫下避光反應(yīng)0.5 h，檢測(cè)300～600 nm的紫外吸收光譜。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 噻菁染料Dye2的聚集狀態(tài)

由圖2可知，超純水中，Dye2在422 nm處有主要吸收峰，445 nm處有一個(gè)小肩峰，與文獻(xiàn)[23-25]報(bào)道相似。422 nm 處的吸收峰為二聚體峰，445 nm處為單體峰，二聚體的形成主要?dú)w因于染料與水分子之間的氫鍵作用形成面對(duì)面的堆積模式。

由圖3可知，隨著溶劑中甲醇比例的增加，Dye2紫外吸收峰由422 nm(二聚體)向445 nm(單體)轉(zhuǎn)化，即二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w；當(dāng)V(甲醇)∶V(超純水)≥7∶3時(shí)，A422 nm/A445 nm幾乎不變，表明此時(shí)體系中反應(yīng)已達(dá)平衡。

Chibisov等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Dye2的類似物即芳環(huán)上修飾甲氧基和氯原子的化合物，單體和二聚體之間的轉(zhuǎn)化受體系溫度的影響。由圖4可知，當(dāng)體系溫度為4～70 ℃ 時(shí)，二聚體與單體的吸光度比值不變，說(shuō)明低于70 ℃ 時(shí)，Dye2聚集體受外界溫度影響不大，因此試驗(yàn)選擇室溫條件下進(jìn)行。

圖2 Dye2在不同比例的甲醇和超純水中的聚集狀態(tài)Figure 2 Aggregation state of Dye2 in different VMeOH/VH2O

圖3 不同比例的甲醇和超純水對(duì)Dye2聚集狀態(tài)的影響Figure 3 Effects of different VMeOH/VH2O on the aggregation state of Dye2

圖4 溫度對(duì)Dye2聚集狀態(tài)的影響Figure 4 Effects of different temperature on the aggregation state of Dye2

2.2 T30695濃度優(yōu)化

T30695作為Pb2+的核酸適配體，在鉛離子存在條件下能形成G-四鏈體，該過(guò)程涉及到序列由單鏈轉(zhuǎn)化DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)G-四鏈體，核酸空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化可能會(huì)影響聚集體的空間構(gòu)型。由圖5可知，隨著T30695濃度的增加，Dye2在422 nm處吸收峰(二聚體)逐漸降低，445 nm處吸收峰(單體)逐漸升高。由圖6可知，A422 nm/A445 nm隨鉛離子濃度的增加逐漸降低，說(shuō)明體系中T30695的濃度會(huì)影響Dye2的聚集狀態(tài)。當(dāng)T30695濃度增加至3 μmol/L 時(shí)，A422 nm值達(dá)到峰值，體系主要以二聚體形式存在，當(dāng)T30695濃度增加至15 μmol/L時(shí)，A422 nm/A445 nm不再改變，體系主要以單體形式存在，說(shuō)明此時(shí)體系達(dá)到平衡。

2.3 體系反應(yīng)平衡時(shí)間

固定鉛離子的濃度，考察不同時(shí)間點(diǎn)Dye2聚集體轉(zhuǎn)化情況。先檢測(cè)未加Pb2+的情況，再加入Pb2+后立即進(jìn)行檢測(cè)，此后每2 min檢測(cè)一次。由圖7可知，當(dāng)加入Pb2+6 min后，樣品的Uv-vis光譜再無(wú)變化，此時(shí)的A422 nm/A445 nm變化幅度較小(見(jiàn)圖8)，反應(yīng)接近平衡，表明此方法需6 min即可檢測(cè)樣品中的Pb2+，因此，鉛離子最佳的反應(yīng)時(shí)間為6 min。

圖5 T30695濃度對(duì)Dye2紫外吸收的影響Figure 5 Effects of different concentrations of T30695 on absorption spectra of Dye2

2.4 線性范圍與檢測(cè)限

在最佳試驗(yàn)條件下，向體系中加入不同濃度的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察Dye2聚集體轉(zhuǎn)化與鉛離子濃度的關(guān)系(圖9)。由圖9、10可知，最佳試驗(yàn)條件下，當(dāng)Pb2+濃度為0.25～10.00 μmol/L時(shí)，A422 nm/A445 nm與鉛離子濃度呈良好的線性關(guān)系，校正曲線方程為y=1.497-0.046x，檢出限為0.115 μmol/L。

圖7 不同反應(yīng)平衡時(shí)間的Uv-vis光譜Figure 7 The Uv-vis spectra of the reaction equilibrium time

圖8 反應(yīng)平衡時(shí)間對(duì)A422 nm/A445 nm的影響Figure 8 Effect of reaction equilibricum time on A422 nm/A445 nm

圖9 Pb2+濃度對(duì)聚集體的影響Figure 9 Effect of increasing Pb2+ concentration on aggregates

圖10 A422 nm/A445 nm與Pb2+濃度的關(guān)系Figure 10 The illustration is the relationship between A422 nm/A445 nm and Pb2+ concentration

2.5 特異性

為了驗(yàn)證此方法的特異性，一共選擇了11種金屬離子(Pb2+，Na+，Cu2+，Cd2+，Mn2+，Cr3+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Hg2+和Fe3+母液濃度為500 μmol/L，工作液濃度為7.5 μmol/L)在最優(yōu)條件下進(jìn)行試驗(yàn)(圖10)。將每種離子測(cè)得的A422 nm/A445 nm比值作對(duì)比(圖11)，與其他金屬離子相比，加入鉛離子的A422 nm/A445 nm顯著下降，且差異最大，表明此方法具有良好的Pb2+特異性。雖然T30695序列中含有堿基T，但是Hg2+離子沒(méi)有產(chǎn)生較大干擾，可能是沒(méi)有形成T-Hg-T的雙鏈構(gòu)型[27]。研究[28]表明，K+可誘導(dǎo)T30695形成G-四鏈體，尤其是低濃度下也可形成G-四鏈體。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)K+的干擾顯著降低。

圖11 體系中加入不同金屬離子的Uv-vis光譜Figure 11 The Uv-vis spectra of different metal ions added to the system

圖12 Dye2/T30695體系對(duì)Pb2+的特異性影響Figure 12 The specificity of Dye2/T30695 system for Pb2+

2.6 回收率試驗(yàn)

為了測(cè)試噻菁染料Dye2的潛在應(yīng)用能力，用該方法進(jìn)行了回收率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，當(dāng)加標(biāo)量為2，4，5，7 μmol/L時(shí)，實(shí)際測(cè)試的樣品濃度與加入量的濃度差值較小，回收率為93.5%～101.4%，RSD<7%，具有較好的準(zhǔn)確度和回收率，表明所建立的方法可用于自來(lái)水中鉛離子檢測(cè)。

3 結(jié)論

研究建立了一種基于噻菁染料Dye2-適配體T30695快速、高靈敏度、高特異性檢測(cè)重金屬鉛離子的方法，此方法的檢出限為0.115 μmol/L，加入鉛離子后僅用6 min即可使反應(yīng)達(dá)到平衡，從而實(shí)現(xiàn)快速高效的檢測(cè)水中鉛離子。由于自來(lái)水中含有一定的鉀離子且適配體對(duì)其響應(yīng)，因此需對(duì)自來(lái)水進(jìn)行倍比稀釋以降低背景干擾。試驗(yàn)所建立的方法在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中可滿足高濃度鉛離子(>23.8 mg/L)的檢測(cè)需求，后續(xù)可通過(guò)構(gòu)建雙鏈體系來(lái)降低鉀離子的干擾，同時(shí)提高其檢測(cè)限。

表1 自來(lái)水中的Pb2+回收率Table 1 The recovery results of Dye2 with addition of different concentrations of Pb2+ in tap water (n=3)