胡章薇，楊 帆，閆佳會，侯 璐，翁 華，姚 強

（青海大學農林科學院/青海省農業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室/農業(yè)農村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海西寧810016）

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudum Hook.f.）又名裸大麥，為禾本科大麥屬植物，屬于栽培大麥的變種，其特點是成熟時籽粒內外稃與穎果分離，籽粒裸露[1]。青稞在藏族同胞的食物結構中舉足輕重，起著重要的營養(yǎng)與健康平衡作用。因其適宜生長在高原冷涼的區(qū)域，具有耐寒性強、生長期短、高產早熟、適應性廣等特點，以及獨特的營養(yǎng)結構和保健作用，青稞已成為極具開發(fā)利用價值的高原特色農作物之一[2]。青稞產業(yè)的健康發(fā)展，對于保障青藏高原地區(qū)糧食安全、社會穩(wěn)定和高原特色產業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

青稞條紋病為種子傳播的系統(tǒng)性病害，病菌潛伏于種子中，成為翌年發(fā)病的菌源?？刂圃摬『τ行У姆椒ň褪鞘褂媒】盗挤N，但受經濟發(fā)展和環(huán)境條件等的限制，目前青稞生產用種60%以上依靠農戶自留。以糧代種造成了條紋病發(fā)生逐年加重，在青海造成的年均產量損失達10%左右，嚴重的高達25%。青稞條紋病菌為真菌門子囊菌綱盤菌目盤菌科核腔菌屬麥類核腔菌Pyrenophora.graminea，傳統(tǒng)絲狀真菌無性階段形態(tài)相近，因此，分類鑒定主要依據(jù)真菌的孢子形態(tài)進行。青稞條紋病菌在人工培養(yǎng)基上較難產生分生孢子[3]，難以通過表觀形態(tài)鑒定，而rDNA-ITS序列分析使絲狀真菌的鑒定更容易且更準確[4]。rDNA-ITS包括ITS1、5.8S和ITS2的全長ITS區(qū)域序列，擁有相對豐富的信息，因而全長序列的ITS分析在真菌分子生物學鑒定中比較常用[5]。吳寬然對來自不同地理區(qū)域的菌株進行ITS序列分析，將供試菌株分為3個大類，共發(fā)現(xiàn)13個變異位點，15種單核苷酸多態(tài)性類型[6]。通過rDNA-ITS序列分析能揭示菌株的核苷酸變異，可以更加穩(wěn)定和直接地研究菌株的遺傳分化。本研究通過對青海省不同地區(qū)青稞條紋病株進行病原菌分離、純化，基于rDNA-ITS進行條紋菌群體的遺傳多樣性分析，以期為明確該病害的發(fā)生流行規(guī)律以及制定相關防控技術體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株。供試菌株采自青海青稞主產區(qū)（表1）典型條紋病癥狀的發(fā)病葉片標樣，保存于標本夾，常溫保存。

1.1.2 供試試劑與儀器。供試試劑：瓊脂粉、葡萄糖，均購自北京索萊寶科技有限公司；DNA提取試

劑盒HP Fungal DNA Kit，購于Omega Bio-Tek科技有 限 公 司；dNTP Mixture、Loading Buffer，均 購 于TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 發(fā)病葉片樣品采集信息

供試儀器：TissueLyser II組織研磨儀，購自凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司；微量核酸蛋白測定儀、sorvall ST 16R高速冷凍離心機，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀，均購自愛普拜斯應用生物系統(tǒng)貿易（上海）有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制。PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基配制：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉18 g，加水調至1 L，121℃下滅菌20 min。

1.2.2 供試菌株分離、純化及保存。病樣沖洗處理干凈后，剪取病、健交界處的組織小段約3 mm，通過表面消毒處理（75%乙醇30 s，5%次氯酸鈉1 min），無菌水沖洗3次后，接種在PDA平板培養(yǎng)基上，每皿5塊病組織。各地區(qū)病樣各分離10皿，置于22℃恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落長出后，先用挑針挑取上層菌絲，待菌絲長至培養(yǎng)皿的2/3時用手術刀切取尖端菌絲，反復純化5～7次，直至菌絲形態(tài)一致。

由本實驗室分離、純化得到的條紋病菌菌株用濾紙片法保存并驗證其活性后，于-20℃冰箱保存。

1.2.3 基因組DNA提取。對長滿培養(yǎng)基的各供試菌株，小心挑取菌絲于2 mL離心管中，參考DNA提取試劑盒HP Fungal DNA Kit說明書提取DNA。獲得的基因組DNA經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，同時，DNA稀釋10倍后保存于-20℃冰箱，原液保存于-80℃冰箱。

1.2.4 rDNA-ITS區(qū)間擴增及遺傳多樣性分析。利用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增條紋病病菌rDNA-ITS區(qū)間，PCR體系為：dNTP Mixture12.5μL，引物各1μL，DNA模板2μL，添加無菌去離子水至25μL。PCR反應程序為：92℃預變性10 min；92℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。

PCR產物經電泳后確定片段為600 bp左右，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。各菌株測序結果于GenBank比對后，經MEGA和DNAsp軟件分析病原菌群體間的遺傳分化關系。

2 結果與分析

2.1 青稞條紋病病原菌的分離及菌落形態(tài)特征

采自青海青稞主產區(qū)（42個采集地點）典型條紋病癥狀的發(fā)病葉片，經分離純化得到79株病株。培養(yǎng)初期菌絲白色，邊緣整齊，生長10 d后部分菌株產生白色、灰色、墨綠色和橙色等可溶性色素，導致菌落顏色多變，但均不產生分生孢子（圖1）。

2.2 青稞條紋病病原菌DNA提取及PCR產物電泳結果

提取已純化的病菌菌絲基因組總DNA經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2-a所示，其總基因組DNA條帶明亮，表明DNA質量較好。條紋病病原菌rDNA-ITS區(qū)間片段大小為600 bp左右，利用通用引物ITS1和ITS4擴增rDNA-ITS區(qū)間，取2 μL PCR產物經2%瓊脂糖電泳凝膠顯色確定，擴增片段為600 bp左右（圖2-b）。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.3 條紋病菌遺傳多樣性分析及鄰接聚類分析

采用引物ITS1和ITS4擴增79株條紋病菌rDNA-ITS區(qū)間，其長度范圍為597～599 bp。各菌株測序結果于GenBank比對后，其中75株與麥類核腔菌Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）同源性最高為98.31%～99.49%，其他4株不確定。經MEGA 7.0.14軟件分析75株病原菌的遺傳關系。對75條rDNA-ITS序列區(qū)間，以DNAsp軟件進行群體多態(tài)性位點分析，最終確定長度為569 bp序列用于分析。

所有變異位點共定義了5個單倍型（表2），H1包含70個菌株，菌株源于青海青稞主要種植區(qū)。2個單倍型（H2和H3）菌株（DLXRD1和DLXRD2）采自海西蒙古族自治州都蘭縣香日德鎮(zhèn)。其余2個單倍 型（H4和H5）的 菌 株（LDMY1、LDMY2和GNSD2）分別采自海東市樂都縣馬營鄉(xiāng)和海南藏族自治州貴南縣森多鄉(xiāng)。結果表明，該段序列具有較低的遺傳多樣性水平。根據(jù)DNAsp軟件分析，得到多態(tài)位點有18個，占總位點的3.16%，其中有8個位點是因為堿基缺失造成的。這18個多態(tài)性位點中單類型多態(tài)性位點有14個，簡約性信息位點有4個，沒有3種或4種多態(tài)性位點。分析表明，Pyrenophora graminea的該段序列較為保守，突變也較為隨機，僅有點突變。

鄰接（Neighbor-Joining，NJ）聚類分析表明（圖3），75個rDNA-ITS序列聚成5支，且遺傳相似度較高（0.002～0.027）；H4（LDMY1和LDMY2）與Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）聚 為一支；H5（GNSD2）獨立聚為一支，與其他支遺傳距離距離較遠。

表2 Pyrenophora graminea 5個單倍型的ITS序列差異位點

3 討論與結論

本研究所分離純化的條紋病菌株在菌絲顏色、菌絲形態(tài)方面存在差異，且同株分離的條紋病菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)多樣，但基于rDNA-ITS的測序結果表現(xiàn)一致?？赡苁强刂粕睾托螒B(tài)的基因不在rDNA-ITS區(qū)間。如需劃分生理小種，還要進一步選取其他基因序列。

rDNA-ITS區(qū)在真菌種間存在著豐富的變異，在種內卻高度保守，同時，ITS片段的進化速率是18SrDNA的10倍，這是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎[7]，已廣泛運用于植物檢疫[8-9]。本研究采樣寄主均為青稞，各菌株測序結果于GenBank比對后，其中75株與麥類核腔菌Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）同 源性最高。rDNA-ITS序列區(qū)間經DNAsp軟件進行群體多態(tài)性位點分析，所有變異位點共定義了5個單倍型，有5株菌株發(fā)生點突變，變異位點有18個，共3種變異類型。吳寬然檢測大麥條紋病菌株間ITS變異位點，共檢測到13個變異位點，15種位點變化[6]，與本研究相比，變異位點更少但變異類型更多，可能與青海特殊地理環(huán)境及本試驗樣品采集樣本的寄主均為青稞有關。其中H5（GNSD2）獨立聚為一支且變異位點較多，可能是由于其采集點的海拔最高，地理位置相對其他區(qū)域較遠引起的。單倍型多樣性（Hd）和鄰接聚類分析是評價遺傳多樣性的重要指標。根據(jù)單倍型多樣性（H）和鄰接聚類分析數(shù)據(jù)表明，所有變異位點共定義了5個單倍型，75個rDNA-ITS單倍型聚成5支，且遺傳相似度較高（0.002～0.027），與單倍型結果一致，表明該群體具有較低的遺傳多樣性水平，且遺傳多樣性與地理位置的分布無相關性。這與Bayraktar等[10]和司二靜等[4]的研究結果類似，造成該現(xiàn)象的原因可能與青稞條紋病為種傳病害有關。

本研究在青稞生長季節(jié)對主要種植區(qū)的條紋病采集標樣，進行病原菌分離、培養(yǎng)和純化，基于條紋病菌群體的rDNA-ITS序列進行群體遺傳多樣性分析及變異位點分析，明確了青海條紋病菌優(yōu)勢毒性類群及其相應的差異位點。抗病育種是病害防治經濟有效的途徑，抗性評價是抗病育種的前提條件，本研究對青海條紋病優(yōu)勢毒性類群進行了初步的分類，可為青海青稞品種抗性評價提供主要毒性類群。同時，本研究所分離純化的菌株培養(yǎng)10 d后，其生長速度、菌絲顏色和菌絲致密程度等方面均存在差異，可為生理小種的劃分提供理論依據(jù)。