鄧兵，唐天才，向陽

（1.四川省綿陽市安州區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，四川 安州 622650；2.宜賓學(xué)院，四川 宜賓 644000；3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

石渠縣地處青藏高原東部，四川省西北部，是草地資源豐富的純牧業(yè)縣，牦牛飼養(yǎng)規(guī)模居全省前列[1]。蜱蟲是當(dāng)?shù)仃笈ｓw表最為常見的體外寄生蟲，也是多種病毒、細(xì)菌、螺旋體、立克次氏體和原蟲的貯存宿主及傳播媒介[2-3]。

蜱蟲的鑒定通常借助于光學(xué)顯微鏡觀察，但僅通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法難以對其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[4]。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對蜱蟲的鑒定多采用形態(tài)學(xué)加分子生物學(xué)相結(jié)合的手段。石渠縣當(dāng)?shù)啬撩衽c牦牛接觸密切，存在被蜱蟲叮咬而感染蜱傳疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開展石渠縣牦牛源蜱的鑒定對防控當(dāng)?shù)貏游锛膊『腿诵蠊不疾【哂蟹e極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 2018 年3～8 月，分別在石渠縣阿日扎鄉(xiāng)、麻呷鄉(xiāng)、長須干瑪鄉(xiāng)和德榮瑪鄉(xiāng)4個(gè)鄉(xiāng)的牦牛體表采集蜱蟲。為了讓樣本具有代表性，采集樣本時(shí)應(yīng)在不同的鄉(xiāng)選取2～3個(gè)不相鄰的村，每個(gè)村選擇2～3個(gè)不相鄰的牦牛群。從每頭牦牛體表采集蜱蟲5～6 只，裝入收集管后5 d內(nèi)送至西南民族大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后加入75%乙醇溶液，置4 ℃冰箱中冷藏待檢。

1.1.2 主要試劑 組織基因組DNA 提取試劑盒（EasyPure Genomic DNA Kit）；Trans 2K Plus DNA marker、2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金公司）。引物合成及測序均由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（成都公司）完成。

1.1.3 主要儀器 Leica 體式顯微鏡（S9D），Bertin Precellys 24 研磨器，Eppendorf 臺式高速離心機(jī)（5402 型），Bio-Rad 伯樂梯度PCR 擴(kuò)增儀（RTC240型），北京六一儀器廠電泳儀（DYY-6），全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（Tanon 5200 Multi）。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)分類 根據(jù)《中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志》（第十五冊）[5]和《中國畜禽寄生蟲形態(tài)分類圖譜》[6]中對蜱蟲形態(tài)學(xué)的描述，使用體式顯微鏡分別對雌蜱和雄蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。主要對蜱蟲的背面、腹面、假頭、假頭基、盾板、雄蜱肛側(cè)板、雌蜱孔區(qū)、氣門板和生殖孔進(jìn)行觀察，并做好記錄。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定后，選取其中20%形態(tài)結(jié)構(gòu)不同且采樣點(diǎn)不同的蜱進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.2.2 DNA 提取 從75%酒精溶液中取出待檢蜱蟲樣本，用無菌生理鹽水反復(fù)洗滌3次，用吸水紙擦干后沿蜱的縱向中軸線切開。其中半只放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存，余下半只置于研磨器中加入500 μL 無菌水進(jìn)行充分研磨。研磨器設(shè)置參數(shù)如下：每管加入直徑0.5 mm 和2 mm 的陶瓷珠20珠和5珠，5 500 r∕min研磨2次，4 000 r∕min研磨1 次。取200 μL 研磨液，按照EasyPure Genomic DNA Kit 試劑盒說明書中的方法提取蜱DNA，置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 檢測 參照Ondrejicka 等[7]報(bào)道的方法對蜱進(jìn)行分子鑒定，引物信息見表1。

表1 PCR引物信息

PCR 擴(kuò)增體系如下：模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL，充分混勻。設(shè)陽性對照和陰性對照（去離子水）。蜱COI 基因擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸55 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫。

1.2.4 序列分析及統(tǒng)計(jì)分析 將全部陽性樣品送至生工生物工程公司測序，使用DNA Star軟件對所得全部序列進(jìn)行拼接分析，在NCBI 網(wǎng)站中使用BLAST 進(jìn)行比對，再使用MEGA 6.0 軟件以Neighbor-Joining 法（Bootstrap 值1 000）構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 樣本采集數(shù)量及形態(tài)學(xué)鑒定 在阿日扎鄉(xiāng)、德榮瑪鄉(xiāng)、麻呷鄉(xiāng)和長須干瑪鄉(xiāng)分別采集到成蜱168 只、192 只、224 只和234 只，共818只。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，本次采集的蜱蟲有2個(gè)種，分別是青海血蜱和西藏革蜱，形態(tài)學(xué)特征見表2。其中青海血蜱的比例為21.03%（172∕818），西藏革蜱的比例為78.97%（646∕818），見表3。

表2 青海血蜱和西藏革蜱的形態(tài)學(xué)特征

表3 采樣點(diǎn)的蜱種類及數(shù)量只

2.2 蜱的分子鑒定

2.2.1 蜱COI 基因擴(kuò)增 以提取的蜱DNA 為模板，采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增蜱的線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I（COI）基因片段，結(jié)果在658 bp 左右處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期片段大小相符。詳見圖1。

圖1 蜱COI基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2 蜱COI 基因遺傳進(jìn)化分析 將測序所得的全部序列進(jìn)行拼接、比對后共得到5 條序列，其中1條為青海血蜱（H.qinghaiensis.Shiqu），其余4 條為西藏革蜱（D.everestianus.Shiqu 1、D.everestianus.Shiqu 2、D.everestianus.Shiqu 3、D.everestianus.Shiqu 4）。選取經(jīng)BLAST 比對后同源性最高的1～2 條序列已確定種（即青海血蜱及西藏革蜱），在NCBI中選取分離自不同地區(qū)的青海血蜱和西藏革蜱的COI 基因序列，再選取幾個(gè)其他種的血蜱和革蜱的COI基因序列作為參考序列，構(gòu)建分子進(jìn)化樹（見圖2）。從圖可知，分離株D.everestianus.Shiqu 1、D.everestianus.Shiqu 2、D.everestianus.Shiqu 3、D.everestianus.Shiqu 4與西藏革蜱（KJ396938）聚為一支，同源性達(dá)98.0%～99.5%。分離株H.qinghaiensis.Shiqu與甘肅天祝青海血蜱分離株（MF981066）和甘肅臨洮青海血蜱分離株（MF981034）聚為一支，同源性達(dá)99.09% ；與青海湟源青海血蜱分離株（MF981069）、甘肅永靖青海血蜱分離株（MF982056）的同源性分別達(dá)98.63%、98.48%。

圖2 蜱COI基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 討論

通過光學(xué)顯微鏡或掃描電子顯微鏡對蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定的傳統(tǒng)方法易受主觀因素的影響，且難以對某些形態(tài)學(xué)特征相似的蟲種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分[8]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于寄生蟲的蟲種鑒定。通過PCR 擴(kuò)增及測序，可在基因水平上對蜱種進(jìn)行鑒定，具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。本研究就采用形態(tài)學(xué)加分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對石渠縣牦牛體表寄生的蜱進(jìn)行了蟲種鑒定。

COI 基因是線粒體DNA 上一段保守的蛋白質(zhì)編碼基因，近年來被廣泛運(yùn)用于寄生蟲的種類鑒定[9]。本研究以蜱COI 基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)普通PCR 鑒定，對測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明石渠縣牦牛體表寄生的蜱蟲為青海血蜱和西藏革蜱，其中青海血蜱的占比為21.03%，西藏革蜱的占比為78.97%。說明西藏革蜱是石渠縣牦牛體表寄生蜱的優(yōu)勢蟲種，這可能與西藏革蜱和青海血蜱的生活習(xí)性、采集地的海拔、降雨量、氣候等因素有關(guān)。在本次調(diào)查的4 個(gè)鄉(xiāng)中，僅麻呷鄉(xiāng)鑒定出了青海血蜱，可能與當(dāng)?shù)貧夂?、海拔和?qū)蟲藥的使用等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究對石渠縣牦牛源蜱開展了形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果表明，石渠縣存在青海血蜱和西藏革蜱，其中西藏革蜱是當(dāng)?shù)仃笈ｓw表寄生蜱的優(yōu)勢蟲種。接下來筆者建議進(jìn)一步擴(kuò)大石渠縣家畜體表蜱的調(diào)查范圍和樣本采集數(shù)量，以期為石渠縣動物疾病及人畜共患病的防控提供更確實(shí)的數(shù)據(jù)。