江鈺娜，方 威，吳瑜瑋，高俊峰，馮志聰，黃婧柯，劉國元，張 健

(南通大學 生命科學學院觀賞植物遺傳育種重點實驗室，江蘇 南通 226019)

我國的鹽堿地面積巨大，主要分布在西北和沿海地區(qū)[1]。其中江蘇沿海灘涂面積超過1 000萬畝，占全國灘涂面積的1/4以上[2]。鹽害嚴重制約了農林業(yè)生產，對生態(tài)環(huán)境造成了巨大的威脅[3-4]。在改良灘涂鹽堿地進程中，種植耐鹽林木是一種投入成本低、效果比較好的手段[5]。

柳樹是楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)和鉆天柳屬(Chosenia)樹種的統(tǒng)稱，分為喬木與灌木，亞洲是柳樹的起源中心，僅我國就有275種。它樹姿美觀，是重要的園林觀賞植物，不僅有速生、耐寒、耐旱與耐污染等優(yōu)點，還有耐鹽、保持水土的能力，是重要的用材及生物質能源樹種[6]。圍繞柳樹的耐鹽性，研究人員開展了許多工作，如季永華[7]選用12種楊樹、柳樹無性系進行田間扦插，分析樹種生長指標與土壤含鹽量相關性，結果表明樹種成活率、保存率、生長量等均與土壤含鹽量呈負相關，得出樹木生長的耐鹽量極限值。通過水培條件下鹽脅迫5個優(yōu)良柳樹無性系，隋德宗[8]發(fā)現低鹽濃度刺激了柳樹的根系活力，隨著鹽濃度的增加，莖葉鮮重、葉片葉綠素含量、SOD逐漸降低，MDA、相對電導率、脯氨酸含量逐漸增加，并且指出鹽處理28 d后的相對莖高和鹽脅迫40 d后的葉綠素含量可作為早期鑒定柳樹無性系耐鹽性的形態(tài)指標和生理指標[8]。聶莉莉等[9]采用盆栽試驗模擬低海拔地區(qū)柳樹生長，結果發(fā)現：鹽脅迫抑制了柳樹地上部分和根的生長，金絲垂柳的耐鹽能力高于旱柳。李敏[10]比較2個柳樹親本耐鹽性，結果得出9901柳耐鹽能力大于沿江柳。李晶等[11]設置4個耐鹽梯度比較3種柳樹耐鹽性，結果得出耐鹽能力強弱：109柳>青竹柳>329柳。田生昌等[12]比較鹽柳1號在3種鹽分處理下的株高和地徑生長，發(fā)現該樹種的生長存活率都很高，有較強的耐鹽能力。柳樹的耐鹽能力與其植株表型、存活率、體內生理物質等多方面因素密切相關。當土壤的含鹽量達到3‰，大部分植物都會受到傷害甚至難以生長，因此3‰含鹽量為衡量植物耐鹽程度的重要分界線[13-14]。我們采用水培法，用50 mmol·L-1NaCl(約等于3‰的鹽濃度)對15個喬木柳品種進行鹽處理，對其地上部分6個指標(萌芽期、葉片數、總萌枝數、總萌枝長、葉鮮干重、葉含水量)和地下部分6個指標(萌根期、最長根長、總根長、總根數、根鮮干重、根含水量)以及2個生理指標(根MDA含量、相對電導率)進行測定，擬通過多項表型指標和生理指標組合測定，較為全面了解鹽脅迫下不同喬木柳品種地上和地下部位的鹽響應表型以及生理指標差異，篩選出耐鹽在臨界值以上的喬木柳品種，為沿海灘涂防護林建設提供材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料采自南通大學生命科學學院植物園，15個品種分別為柳樹優(yōu)良無性系J2087(Salix×jiangsuensis‘J2087’)、柳樹優(yōu)良無性系J2187(Salix×jiangsuensis‘J2187’)、旱垂柳287(S.babylonica×S.matsudana‘287’)、蘇柳795(Salix×jiangsuensis‘J795’)、蘇柳172(Salix×jiangsuensis‘J172’)、蘇柳932(Salix×jiangsuensis‘J932’)、金絲垂柳J1010(Salix×aureo-pendula‘J1010’)、蘇柳799(Salix×jiangsuensis‘J799’)、龍爪柳(S.matsudanaf.tortuosa)、紫桿柳(S.wilsonii)、東營柳1號(S.matsudana‘DongYingliu-1’)、東營柳2號(S.matsudana‘DongYingliu-2’)、渤海柳1號(S.matsudana‘Bohai-1’)、鹽柳1號(S.psammophila‘Yanliu-1’)和竹柳(S.matsudana‘Zhuliu’)。統(tǒng)一截取1年生8 cm長、3～5 mm粗的扦插條，在南通市觀賞植物遺傳育種重點實驗室內的人工氣候室進行水培試驗，并測定不同表型與生理指標。

1.2 試驗方法

由于3‰含鹽量為植物耐鹽程度的分界線，因此采用50 mmol·L-1NaCl(約等于3‰的鹽濃度)進行鹽脅迫，同時設清水作為CK。水培采用240 mL的塑料杯。每杯置100 mL溶液，扦插條每10根置于1個杯子作為1個處理，試驗共設3次重復，人工氣候室日照/黑暗12 h，光強3 000 lx，溫度22℃±2℃，每3 d更換1次鹽溶液同時測定數據，試驗從10月14日開始至11月5日結束，共21 d。

1.3 生長指標的測量

試驗過程中，從第3天開始統(tǒng)計其萌根期和萌芽期，第21天記錄所有品種的最長根長、總根長、總生根數、葉片數、總萌枝數、總萌枝長，測定葉鮮重、葉干重、根鮮重、根干重。其中始根期、始芽期、總生根數、總萌枝數等指標，均采用目測，所有的長度指標通過直尺測量，干鮮重的測量采用數字天平，其中干重用烘箱65℃干燥直至恒重后測量。

1.4 生理指標的測定

丙二醛依據硫代巴比妥酸法用試劑盒測定；電導率測定方法：量取50 mL超純水加入提前用超純水潤洗過的離心管中，稱取0.15 g完整根系用紙吸干水分后，用超純水漂洗1～2次，然后再吸干水分，并放入離心管，完全浸泡后2 h后測水的電導率。

1.5 數據處理

用Excel 2019、SPSS26軟件和R語言進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對喬木柳插條的生長指標的影響

鹽脅迫下植株根系、地上部、生物量等多個生長指標都會受到抑制，比較不同時間鹽處理對15個品種扦插條的影響，發(fā)現處理第21天時不同喬木柳品種扦插條受鹽脅迫影響嚴重，枝條出現葉片發(fā)黃、枯萎，柳樹根脫落、皺縮，且不同柳樹品種間的表型區(qū)分明顯。

2.1.1 鹽脅迫對喬木柳插條的根、葉萌發(fā)時間的影響 由表1可知，鹽脅迫下多數喬木柳的萌根、萌葉的時間普遍推遲。方差分析表明：鹽處理下鹽柳1號的萌根期提前，且與對照組差異顯著，渤海柳1號、龍爪柳、東營柳2號、蘇柳799這4個品種萌根期雖然提前但與對照組差異不顯著，而J2087、J2187、東營柳1號等10個品種萌根期延遲且與對照組差異顯著，從萌根期來看，受鹽處理影響最大的是蘇柳172，最小的是鹽柳1號。鹽柳1號比對照組提前了15.17%，說明鹽處理顯著可以促進鹽柳1號的根萌發(fā)。柳樹地下部分所吸收的水和養(yǎng)分會傳輸到地上部分以供給整株生長。觀察葉萌發(fā)情況發(fā)現鹽脅迫下J2087、蘇柳799、287、蘇柳172的葉萌發(fā)時間延遲且與對照組差異顯著，而其余品種萌發(fā)時間雖有推遲但差異不顯著。綜上所述，50 mmol·L-1鹽可促進鹽柳1號生根，對蘇柳172根、葉的萌發(fā)有較強的抑制作用。

表1 不同喬木柳品種的萌根期和萌芽期Table 1 Rooting period and starting shoot time of different arbor varieties

2.1.2 鹽脅迫對喬木柳插條的根生長的影響 根長是根重要的表型指標，根長的增加說明根的活性良好。圖1展示了15個喬木柳的最長根長、總生根數和總根長3個根生長指標數據。對照組的最長根長區(qū)間從4.75～8.55 cm，與對照組相比，處理組中增量(處理/對照)最大的是蘇柳795，最小的是蘇柳932(圖1a)。處理組的總生根數是對照組的65%～240%，增量最大的是蘇柳795，最小的是蘇柳932(圖1b)。處理組中總根長增量最大的是蘇柳795，最小的是蘇柳932(圖1c)。結合方差分析，鹽處理下，蘇柳795的總生根數和總根長均顯著高于CK。渤海柳1號和蘇柳799的總生根數顯著高于CK，而J2087、龍爪柳和蘇柳932均有指標顯著低于CK，蘇柳795的根生長最強，蘇柳932的根生長最弱。綜上所述，50 mmol·L-1鹽處理一定程度促進了蘇柳795、渤海柳1號、蘇柳799這3個品種的根生長，而對J2087、龍爪柳和蘇柳932的根生長抑制較大。根據3個根生長指標的相關性分析(表2)，總根長與總生根數、最長根長相關性顯著，總生根數與最長根長相關性不明顯。

注：不同大寫字母表示同一品種在處理組與對照組差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示不同品種之間的差異顯著(P<0.05)。下同。圖1 不同喬木柳品種的根生長情況Fig.1 Root growth of different arbor willow varieties

表2 最長根長、總生根數、總根長相關性分析Table 2 Correlation analysis of the longest root length,total root number,total root length

2.1.3 鹽脅迫對喬木柳插條的萌枝生長的影響 圖2反映的是15個柳樹品種第21天的總萌枝數、總萌枝長和總葉片數。處理組的總萌枝數增量最多的是竹柳，最少的是蘇柳172。竹柳、紫桿柳、鹽柳1號、東營柳2號、渤海柳1號的總萌枝數在鹽處理時增加(圖2a)。處理組的總萌枝長增量最大的是蘇柳799，最小的是J1010(圖2b)。在15個品種中，對照組葉片數最多的是龍爪柳，最少的是J1010，處理組增量均<1(圖2c)。方差分析表明：總萌枝長中J2187、龍爪柳、鹽柳1號顯著低于CK?？偯戎抵兄窳@著高于CK，J2187、蘇柳795、蘇柳172、蘇柳799顯著低于CK。總葉片數中J2087、J2187、287、蘇柳795、蘇柳799、龍爪柳顯著低于CK。其余品種處理組差異不顯著。說明50 mmol·L-1鹽處理促進了竹柳的萌枝生長，抑制了J2187的萌枝生長，而對渤海柳1號、東營柳1號、東營柳2號、紫桿柳、J1010和蘇柳932的萌枝生長影響較小。

圖2 不同喬木柳品種的萌枝生長情況Fig.2 Growth of the shoots of different arbor willow varieties

2.1.4 鹽脅迫對喬木柳插條的根、葉干鮮重的影響 生物量是鹽脅迫下植株生長量最直接的反映結果。圖3展示了不同喬木柳品種的根、葉干鮮重在鹽處理和對照間的質量差異。通過對根鮮重的測定發(fā)現，對照組中最大的是蘇柳799，最小的是紫桿柳，增量最大的是紫桿柳，最小的是蘇柳932(圖3a)；根干重對照組中最大的是蘇柳799，最小的是紫桿柳，增量最大的是紫桿柳，最小的是東營柳2號(圖3b)。對照組的葉鮮重中最大的是蘇柳799，最小的是J1010，處理組中增量最大的是紫桿柳，最小的是J2187(圖3c)；葉干重的對照組中最大的是渤海柳1號、紫桿柳，最小的是J1010，增量最大的渤海柳1號，最小的是蘇柳932，在鹽處理下葉干重均低于CK(圖3d)。方差分析表明：蘇柳932的根鮮重顯著低于CK，蘇柳799的根干重顯著低于CK，其余品種在根的干鮮重與對照差異不顯著。而與對照相比，各品種葉的干鮮重差異顯著的較多，J2087、J2187、蘇柳172、蘇柳932、蘇柳799、龍爪柳和竹柳的葉鮮重與對照差異顯著，蘇柳172、蘇柳932、蘇柳799、渤海柳1號、竹柳這5個品種的葉干重與對照組差異顯著，說明50 mmol·L-1鹽處理對所測的多數喬木柳品種的葉生物量影響較大，而對根生物量影響不大。

圖3 不同喬木柳品種的根、葉干鮮重Fig.3 Dry weight and fresh weight of the roots and leaves of different arbor willow varieties

2.2 鹽脅迫對喬木柳插條生理指標的影響

2.2.1 鹽脅迫對喬木柳插條的丙二醛(MDA)的影響 鹽脅迫會使活性氧(ROS)積累過多，進而造成氧化損傷，會損傷植物細胞膜系統(tǒng)，最終分解成丙二醛(MDA)等化合物，引起膜脂過氧化反應[15]，因此常以植物組織中MDA含量作為判斷膜脂過氧化作用的主要指標。在試驗中，測定了根的MDA含量(圖4)，結果發(fā)現：與對照相比，J2087、287、蘇柳932、龍爪柳、紫桿柳、東營柳2號、渤海柳1號等7個品種的MDA含量有所增加。方差分析表明：蘇柳932的MDA含量顯著高于CK，J1010的MDA含量顯著低于CK，其余品種的處理組和對照組差異不顯著，各品種間的MDA含量差異也不顯著，說明50 mmol·L-1鹽處理對15個喬木柳的細胞傷害不大。

圖4 不同喬木柳品種的MDA含量Fig.4 MDA content of different arbor willow varieties

2.2.2 鹽脅迫對喬木柳插條的根系質膜透性的影響 植物在受到鹽脅迫時最先受到傷害的是根部，然后根組織的細胞膜受到傷害，膜的透性增加，選擇透性喪失，細胞內部分電解質外滲，外滲的物質進入環(huán)境介質，根據浸泡根組織液的相對電導率可以判斷根組織在有無鹽處理下的破壞程度，從而反映柳樹耐鹽能力的強弱[16]。從圖5看出，龍爪柳在鹽處理下根相對電導率略有下降，而其他的喬木柳品種的相對電導率都增加。說明50 mmol·L-1鹽處理對喬木柳的根質膜透性產生了一定的破壞影響。

圖5 不同喬木柳品種的相對電導率Fig.5 Relative conductivity of different arbor willow varieties

2.3 喬木柳表型和生理指標的相關分析

將柳樹地上部分和地下部分12個表型指標與2個生理指標的進行了相關分析，表明根系的MDA與總萌枝數呈極顯著正相關，而其相對電導率與葉片數和葉干重呈極顯著負相關(表3)。總萌枝數還與葉片數極顯著正相關，葉片數與最長根長負相關。總萌枝長與始根期和始芽期負相關，與葉鮮重正相關。

表3 喬木柳生理和生長指標相關性分析Table 3 Correlation analysis of physiology and growth index of arbor willow

2.4 15種喬木柳品種表型和生理指標聚類分析

用R語言中的“factoextra”軟件包進行聚類分析，距離計算采用“euclidean”算法，并采用最長距離法(complete)對15個喬木柳品種的12個表型指標和2個生理指標進行層次聚類并繪圖,可以分為3類(圖6)。第1類有5種：鹽柳1號、東營柳2號、竹柳、渤海柳1號、紫桿柳；第2類有4種：287、J2087、龍爪柳、蘇柳932；第3類6種：蘇柳795、J2187、蘇柳172、東營柳1號、金絲垂柳J1010、蘇柳799，表明第1類耐鹽性較強，第2類耐鹽性中等，第3類耐鹽性較弱。

圖6 喬木柳表型和生理指標的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of phenotype and physiological index of arbor willow

3 結論與討論

在50 mmol·L-1NaCl鹽處理下，不同喬木柳鹽響應迥異。結合地上部分和地下部分的12個生長表型指標和2個生理指標的聚類分析，得出鹽柳1號、東營柳2號、竹柳、渤海柳1號、紫桿柳的耐鹽性較強，287、J2087、龍爪柳、蘇柳932的耐鹽能力中等，蘇柳795、J2187、蘇柳172、東營柳1號、金絲垂柳J1010、蘇柳799的耐鹽能力較弱。

鹽脅迫下，不同喬木柳品種的生長都受到了抑制。從地下和地上2部分生長分析，表型指標變化差異較大。其中鹽柳1號的根萌發(fā)時間提前，蘇柳795、渤海柳1號、蘇柳799的總生根數、總根長和最長根長得到一定的增加，這與在其他柳樹無性系、長穗偃麥草、油菜等植物在鹽脅迫下的影響相一致，如隋德宗等[17]發(fā)現低鹽濃度刺激柳樹根系生長，在長穗偃麥草中發(fā)現低鹽濃度對其胚根生長有一定的促進作用一致[18]，在油菜的鹽處理試驗中發(fā)現在隨著鹽濃度增加，油菜根長經歷了先升高后降低的趨勢[19]，這些都說明鹽濃度較低時，植物根系受到一定刺激生長。在本研究中，我們還發(fā)現柳樹的生理指標變化也不是一致的，已有研究表明，滲透調節(jié)、活性氧清除系統(tǒng)是鹽脅迫響應的2個常見途徑[20-22]，電導率是反映滲透調節(jié)的常用指標之一，在植物活性氧清除過程中，丙二醛含量、可溶性糖隨著鹽濃度增加而增加，過氧化物酶隨著鹽濃度先增加后減少，根部積累Na+影響根系生長，因鹽脅迫減弱K+吸收[ 23-25]。試驗中J2187、蘇柳795、蘇柳172、J1010、蘇柳799、東營柳1號、鹽柳1號和竹柳等8個品種的MDA含量比CK低，這與劉鐸等[26]研究中發(fā)現鹽柳1號在25 mmol·L-1和50 mmol·L-1鹽濃度時MDA與對照相比有所下降一致，而龐元湘等[27]研究鹽脅迫下“魯柳1號”的生長發(fā)育情況發(fā)現，MDA的含量隨著鹽濃度的增加而增加，在7‰時達到最大，之后隨著時間的延長而含量減少。在其他植物中，低鹽濃度處理下不同品種的電導率和MDA含量也會出現減少的情況。趙銳明等[28]在比較2種黃芪幼苗耐鹽性時發(fā)現鹽處理下，蒙芪Z09-1相對電導率CK，同時蒙芪L07-22幼苗的MDA含量僅是對照的79.85%[28]。本結果中鹽處理部分喬木柳品種的MDA含量出現下降，可能與不同柳樹品種的膜抗氧化酶系統(tǒng)結構的完整性及其抗氧化酶的合成有著密切的關系，說明了不同柳樹品種的MDA含量對鹽濃度響應各異。另外，鹽處理下龍爪柳的電導率較之CK有所下降，其余品種的電導率均>CK，可能其根部區(qū)隔鹽分的能力有所不同，這與有研究發(fā)現有些柳樹基因型的首選排毒機制是排鹽，而不是作為“便宜”的滲透調節(jié)劑來容忍組織中鹽濃度升高一致[29]。

相關性分析表明：總萌枝數與MDA正相關，葉片數和葉干重與相對電導率負相關?？偯戎?、葉片數可能與柳樹插條耐鹽性的表型鑒定有重要關系?？偯戎悼赡芘c根系細胞膜損失程度有關，短期內，在鹽濃度刺激下，植物組織內的活性氧積累開始增加，初期低濃度的活性氧不會對植物產生危害，反而能在植物細胞信號轉導途徑中充當第二信使來介導應答反應[30]，可能一定程度刺激了柳樹萌枝數的生長，隨著時間的推移，ROS過量則抑制柳樹生長。葉片數和葉干重可能與細胞質膜透性有關，細胞膜受到鹽濃度的破壞，膜的透性增加，選擇透性喪失，細胞內部分電解質外滲，這部分電解質包括鹽類、有機酸等，根系的養(yǎng)分運輸不到地上部分，葉片受損加重，出現萎蔫，枯敗等現象，表現出葉片數和葉干重降低。表明鹽脅迫下，根系的滲透調節(jié)可能主要與地上部葉片數、生物量等長期生長指標有關，而根系中活性氧含量可能主要在脅迫前期影響地上部萌芽數等前期性狀。

在柳樹耐鹽機制中，滲透調節(jié)和抗氧化系統(tǒng)在不同品種里作用不同，這可能還有其他作用機制共同響應鹽脅迫。本研究采用人工氣候室恒溫水培進行NaCl脅迫試驗，方法簡單快捷，研究結果可為了解不同柳樹品種的耐鹽性選定提供參考，另外生理指標多為應激指標和單一的表型指標均無法準確鑒定柳樹品種間不同的耐鹽能力，所以試驗選用多種地上地下表型指標進行測定，為柳樹耐鹽性鑒定提供指標依據。