鄭宵陽, 王余廣, 李博, 劉睿楠, 李崢, 萬靜茹, 王東旭, 張?zhí)煊? 叢厚義

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率和死亡率也居高不下，早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療至關(guān)重要。近年來，隨著人們對健康的重視程度不斷增高及影像技術(shù)的發(fā)展，越來越多的肺磨玻璃結(jié)節(jié)(ground-glass opacity nodules，GGO-nodules)被檢出[1,2]。GGO結(jié)節(jié)術(shù)后病理多為腺癌，并遵守一種循序漸進的惡變發(fā)展方式[3]。近年來隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，許多與肺腺癌病理和預后有關(guān)的分子標志物成為眾多學者研究的重點，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)[4]、Ki67[5]、蛋白酪氨酸磷酸酶PKM2蛋白[6]及絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型 ( serine protease inhibitor Kazal 1，SPINK1)[7]等。通過研究這些分子標志物的表達水平，可以幫助判斷患者預后和制定臨床治療方案。然而，目前這些分子標志物的檢測都是有創(chuàng)性的，需通過獲得活體組織標本，結(jié)合病理診斷結(jié)果才能完成。因此，非侵襲性預測這些分子標志物的表達對肺腺癌的精準診療具有重要意義，尤其是對于那些有臨床特征但不能接受有創(chuàng)性檢查的患者。影像檢查具有方便、快速、無創(chuàng)等優(yōu)點[8]。已有多篇研究報道MSCT征象對預測GGO結(jié)節(jié)肺腺癌患者的EFGR突變具有一定意義[9-11]，然而在預測Ki67、PKM2、SPINK1這些重要分子標志物上還較少有研究報道。因此，本研究旨在通過探討GGO結(jié)節(jié)肺腺癌的MSCT征象與Ki67、PKM2、SPINK1表達間的相關(guān)性，以期為術(shù)前無創(chuàng)性評估肺腺癌預后以及疾病的臨床診治提供參考。

材料與方法

1.病例資料

搜集2018年9月-2020年6月于本院行手術(shù)治療的肺腺癌患者。病例納入標準：①經(jīng)病理診斷為肺腺癌；②術(shù)前行MSCT平掃，影像表現(xiàn)為磨玻璃結(jié)節(jié)；③術(shù)前未行放、化療等前期輔助治療；④無縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處器官轉(zhuǎn)移；⑤臨床、病理及影像學資料完整。病例排除標準：①存在肺炎等其他肺部疾病或肺部先天性疾?。虎诨加衅渌课粣盒阅[瘤；③有胸廓手術(shù)史；④合并心、腦、肝、腎疾病或其他全身性疾病。最終納入80例患者，其中男58例，女22例，年齡47～78歲，平均(57.60±8.27)歲。本研究獲本院醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均自愿加入本研究，并簽署了知情同意書。

2.檢查方法

MSCT檢查采用東芝aquillon 64排128層螺旋CT，胸部CT掃描范圍為肺尖至膈底，掃描參數(shù)：管電流100～200 mA，管電壓120 kV，矩陣512×512，螺距1.2，重建層厚1.0 mm，層間距0.5 mm，數(shù)據(jù)傳輸至PACS系統(tǒng)及后處理工作站進行重建。掃描前訓練患者憋氣，囑患者掃描時吸一口氣憋住，避免呼吸運動造成的偽影對位于肺底的結(jié)節(jié)評估產(chǎn)生影響。應用西門子三維后處理軟件MM Reading及分析軟件Oncology處理發(fā)現(xiàn)的結(jié)節(jié)，進行圖像重建，測量并記錄結(jié)節(jié)大小、實性部分最大徑、類型(單純性GGN、混合性GGN)、個數(shù)(單發(fā)、多發(fā))、形態(tài)、邊緣及內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征(包括分葉、毛刺、血管集束、空泡、胸膜凹陷、充氣支氣管征)。由2位經(jīng)驗豐富的放射診斷醫(yī)師共同閱片，結(jié)果有分歧時通過協(xié)商達成一致。

3.免疫組織化學方法及判定標準

取術(shù)后病理組織標本，采用免疫組織化學檢測Ki67、PKM2、SPINK1蛋白表達水平，試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Ki-67表達判定標準：主要定位于細胞核，呈棕黃色，染色程度越深得分越高，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色細胞所占比例越高得分越高，陰性為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后將染色程度分值與染色細胞比例分值相乘得到最終分值，<3分為低表達，≥3分為高表達。PKM2表達判定標準：主要定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色，染色程度計分中無染色為0分，弱染色(淺黃色)為1分，中度染色(黃棕色)為2分，強染色(棕色)為3分；染色細胞所占比例計分中未見陽性細胞為0分，<25%為1分，25～50%為2分，50～75%為3分，>75%為4分；染色指數(shù)=染色強度×陽性細胞比例，以染色指數(shù)中位數(shù)(8分)為分界點，<8分為PKM2無表達或低表達，≥8分為PKM2高表達。SPINK1表達判定標準：主要定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色，染色程度越深得分越高，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色細胞所占比例越高得分越高，陰性為 0 分，1%～10% 為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。以染色強度得分和細胞比例得分的乘積為判斷標準，<3分為低表達，≥3分為高表達。

圖1 浸潤性腺癌患者，男，49歲，Ki67高表達，MSCT示左肺上葉結(jié)節(jié)(箭)分葉征。 圖2 微浸潤性腺癌患者，女，46歲，Ki67高表達，MSCT示右肺下葉結(jié)節(jié)(箭)分葉征。 圖3 浸潤性腺癌患者，女，53歲，PKM2高表達，MSCT示右肺下葉不規(guī)則結(jié)節(jié)(箭)、分葉征和胸膜凹陷征。 圖4 浸潤性腺癌患者，男，50歲，PKM2高表達，MSCT示右肺上葉不規(guī)則結(jié)節(jié)(箭)、分葉征和胸膜凹陷征。 圖5 微浸潤性腺癌患者，男，50歲，SPINK1高表達，MSCT示右肺上葉混合性GGN(箭)、分葉征和胸膜凹陷征。 圖6 浸潤性腺癌患者，女，54歲，SPINK1高表達，MSCT示右肺上葉混合性GGN(箭)、分葉征和胸膜凹陷征。

4.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗；定性資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。對單因素分析結(jié)果中有意義的因素進行二元Logistic分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.病理及免疫組化結(jié)果

80例肺腺癌患者中，浸潤性腺癌52例，微浸潤腺癌13例，原位腺癌5例。腫瘤直徑0.6～3.1 cm，平均(1.69±0.42) cm。Ki67高表達46例(57.5%)，低表達34例(42.5%)；PMK2高表達42例(52.5%)，低表達38例(47.5%)；SPINK1陽性45例(56.3%)，陰性35例(43.7%)。

2.Ki67、PKM2、SPINK1蛋白表達水平與MSCT征象間的關(guān)系

Ki67的表達水平與MSCT征象中的結(jié)節(jié)單發(fā)或多發(fā)、有無分葉征有關(guān)，Ki67高表達患者中出現(xiàn)多發(fā)結(jié)節(jié)、分葉征的比例顯著高于低表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而其他MSCT征象與Ki67的表達水平均無統(tǒng)計學相關(guān)性(P>0.05，表1，圖1、2)。

表1 Ki67蛋白表達水平與MSCT征象間的關(guān)系

PKM2的表達水平與MSCT征象中的形態(tài)、有無分葉征、胸膜凹陷征及實性部分最大徑有關(guān)，PKM2高表達患者中出現(xiàn)不規(guī)則形結(jié)節(jié)、分葉征和胸膜凹陷征的比例均顯著高于低表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且前者的實性部分最大徑顯著高于后者，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而其他MSCT征象與PKM2的表達水平均統(tǒng)計學相關(guān)性(P>0.05，表2，圖3、4)。

表2 PMK2蛋白表達水平與MSCT征象間的關(guān)系

SPINK1的表達水平與MSCT征象中的結(jié)節(jié)類型、有無分葉征和胸膜凹陷征有關(guān)，SPINK1高表達患者中出現(xiàn)混合性GGN、分葉征和胸膜凹陷征的比例均顯著高于低表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而其他MSCT征象與SPINK1的表達水平均無統(tǒng)計學相關(guān)性(P>0.05，表3，圖5、6)。

表3 SPINK1蛋白表達水平與MSCT征象間的關(guān)系

3.二元Logistic回歸分析

對單因素分析中的變量賦值(表4)，分別以Ki67、PKM2、SPINK1表達水平為因變量(低表達=0；高表達=1)，以各自單因素分析結(jié)果中有統(tǒng)計學意義的變量作為自變量，進行二元Logistic分析。Logistic分析結(jié)果顯示，MSCT征象中出現(xiàn)分葉征是肺腺癌Ki67高表達的獨立危險因素(P<0.05)，出現(xiàn)分葉征和胸膜凹陷征是PKM2高表達的獨立危險因素(P<0.05)，出現(xiàn)分葉征和胸膜凹陷征是肺腺癌PKM2高表達的獨立危險因素(P<0.05，表5)。

表4 MSCT征象各變量的賦值

表5 Logistic回歸分析結(jié)果

討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，已成為癌癥死亡的主要原因，非小細胞肺癌約占全部肺癌的80%，而肺腺癌是非小細胞肺癌中最常見的組織學亞型。由于肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制十分復雜，并且尚不明確，近年來隨著分子生物學的發(fā)展，許多學者致力于對肺腺癌病理和預后分子標志物進行研究，以期找到肺腺癌分子靶向治療的突破點。Ki67是一種與增殖細胞有關(guān)的核抗原，對判斷腫瘤的惡性程度及侵襲力有一定意義。最近的一項研究結(jié)果顯示，隨著肺腺癌患者Ki67表達水平增高，患者的復發(fā)率增高，總生存率降低，并且預后不良[12]，所以研究者認為Ki67蛋白高表達肺腺癌患者術(shù)后應盡可能予以積極治療。PKM2是一種代謝酶，可激活糖酵解和脂質(zhì)合成，并且PKM2還可在癌癥的發(fā)生和進展中作為信號調(diào)節(jié)因子。相關(guān)研究顯示PKM2在肺腺癌組織中表達增高，下調(diào)PKM2的表達可抑制肺腺癌的腫瘤生長和侵襲，并且PKM2的高表達與患者預后不良有關(guān)[13]。SPINK1的主要生理作用是抑制胰蛋白酶原等多種絲氨酸蛋白酶原活性，拮抗胰腺等組織的“自身消化”；相關(guān)研究表明，SPINK1與表皮細胞生長因子結(jié)構(gòu)相似，可通過自分泌形式激活表皮細胞生長因子信號傳導通路，從而促進細胞增殖[14]。相關(guān)研究結(jié)果表明，SPINK1可促進人肺腺癌細胞的增殖，并且SPINK1表達升高提示患者預后不良[7,14]。因此，這些分子標志物都是與肺腺癌預后有關(guān)的分子標志物，而通過探討GGO結(jié)節(jié)肺腺癌的MSCT征象與Ki67、PKM2、SPINK1表達之間的相關(guān)性，可為術(shù)前無創(chuàng)性評估肺腺癌預后提供一定參考依據(jù)。

本研究單因素分析結(jié)果顯示，Ki67的表達水平與MSCT征象中的結(jié)節(jié)單發(fā)或多發(fā)、有無分葉征有關(guān)，PKM2的表達水平與MSCT征象中的形態(tài)、有無分葉征、胸膜凹陷征及實性部分最大徑有關(guān)，SPINK1的表達水平與MSCT征象中的結(jié)節(jié)類型、有無分葉征和胸膜凹陷征有關(guān)。進一步的多因素分析結(jié)果表明出現(xiàn)分葉征是肺腺癌Ki67高表達的獨立危險因素，出現(xiàn)分葉征和胸膜凹陷征是PKM2高表達的獨立危險因素，出現(xiàn)分葉征和混合性GGO結(jié)節(jié)是肺腺癌PKM2高表達的獨立危險因素。以上結(jié)果提示，分葉征和胸膜凹陷征的出現(xiàn)對判斷肺腺癌預后分子標志物的表達水平至關(guān)重要。

分葉是指腫塊的輪廓表面通常呈現(xiàn)起伏不平的多個弧形，而并非呈現(xiàn)規(guī)則的圓形或橢圓形，形似多個融合在一起的結(jié)節(jié)。分葉征出現(xiàn)的病理學基礎(chǔ)包括以下幾個方面：肺的結(jié)締組織間隔、進入腫瘤的血管或支氣管分支、從腫瘤內(nèi)向外生長的血管和結(jié)締組織等引起腫瘤生長受限；腫瘤邊緣各部位腫瘤細胞的分化程度不一，生長速度不同；腫瘤內(nèi)部纖維組織的收縮[15]。相關(guān)研究表明，惡性GGO結(jié)節(jié)更容易出現(xiàn)分葉征，而惡性程度高的腫瘤往往也預后較差[16,17]。胸膜凹陷征的主要病理基礎(chǔ)是瘤內(nèi)纖維化，而纖維母細胞在腫瘤血管形成中扮演至關(guān)重要的角色。新發(fā)腫瘤病灶內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)相對而言缺乏完整性，且血管內(nèi)皮的間隙較大，因此更容易使血液中的纖維蛋白原滲入組織間隙，從而生成纖維母細胞；此外，惡性腫瘤細胞增殖旺盛，組織內(nèi)缺氧會導致腫瘤病灶產(chǎn)生纖維化收縮，從而使得胸膜凹陷征的發(fā)生概率進一步增高[18]。相關(guān)研究表明，胸膜凹陷征也是良惡性GGO結(jié)節(jié)鑒別的一個重要征象，在惡性GGO結(jié)節(jié)中胸膜凹陷征的出現(xiàn)比例顯著增高[18]。因此，分葉征和胸膜凹陷征在一定程度上反映了肺腺癌的不良預后，是預后的重要預測因素。然而，本研究也存在一些局限性，本研究樣本量不大，這可能會對結(jié)果的穩(wěn)健性產(chǎn)生一定影響，在未來有條件的情況下，我們會納入更多患者，以得到更準確的研究結(jié)果。

綜上所述，MSCT征象中的分葉征和胸膜凹陷征有助于預測磨玻璃結(jié)節(jié)樣肺腺癌Ki67、PKM2、SPINK1的表達狀態(tài)，從而為疾病的預后評估和臨床診治提供參考依據(jù)。