李晨 李曉媚 劉亭 雷超 劉聰 劉志華

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院前沿醫(yī)學(xué)交叉研究中心，廣州市加速康復(fù)腹部外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院肛腸科（廣州510700）

高鹽被認(rèn)為是高血壓和心血管疾病的最常見危險(xiǎn)因素之一。有研究［1-3］表明，高鹽飲食可促進(jìn)腸道炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展，已知高鹽飲食不但會(huì)影響腸道菌群組成，促進(jìn)腸道炎癥因子的表達(dá)，還會(huì)加重小鼠結(jié)腸炎癥狀。研究［4］還發(fā)現(xiàn)長期的高鹽、高糖和高蛋白質(zhì)飲食與炎癥性腸病（IBD）發(fā)病率增加具有顯著相關(guān)性［5-6］，高鹽或高脂飲食可能會(huì)破壞腸屏障，從而導(dǎo)致全身炎癥，腸屏障功能障礙是腸道疾病的重要特征，近期已有研究通過腦-腸軸將高鹽與腸道菌群聯(lián)系起來［7］，但高鹽飲食誘導(dǎo)腸功能損傷的機(jī)制尚未完全清楚。

Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）通路是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同途徑，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程［8-9］。實(shí)際上，由細(xì)胞因子引發(fā)的大多數(shù)免疫反應(yīng)都依賴于STATs［10-11］。已有批準(zhǔn)或正在研究抑制JAK/STAT 信號(hào)通路的抑制劑作用于IBD的治療［12-20］，JAK/STAT 抑制劑在IBD 的小鼠模型中顯示了與阻斷多種自身免疫途徑一致的強(qiáng)大療效［21］。高鹽飲食是否通過激活JAK/STAT 通路誘導(dǎo)腸屏障功能障礙的機(jī)制尚未明確，因此，本研究通過制備高鹽飲食小鼠模型，檢測各組結(jié)直腸組織的腸屏障蛋白和JAK/STAT 通路蛋白的改變，并進(jìn)行相關(guān)性分析。此外，在細(xì)胞水平上，采用高濃度NaCl 對(duì)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM-460 細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察高濃度NaCl 對(duì)腸細(xì)胞的腸屏障蛋白和JAK/STAT 通路蛋白的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證高鹽是否能激活JAK/STAT 通路，并降低腸屏障緊密連接蛋白的表達(dá)，即引起腸屏障功能障礙。

1 材料與方法

1.1 主要試劑JAK1抑制劑Ruxolitinib，購于Sigma公司；兔抗ZO-1、β-actin 抗體購于艾博抗公司；鼠抗Occludin 抗體購于Proteintech 公司；兔抗JAK1、P-JAK1、STAT3、P-STAT3 抗體購于Cell Signaling TECHNOLOGY，CST 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購于Gibco 公司；DMSO，戊巴比妥鈉，購于Sigma 公司；脫脂奶粉購于伊利公司；吐溫20購于天津科密歐化學(xué)試劑廠；無水乙醇購于廣州市番禺力強(qiáng)化工；BCA Protein Assay Kit、蛋白maker 購于Thermo Scientific；5×loading buffer、一抗稀釋液購于上海碧云天生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管購于Corning 公司。

1.2 模型制備與分組

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體質(zhì)量為（20 ± 5）g 的SPF 級(jí)健康雄性C57BL/6 小鼠購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［合格證號(hào)為：SCXK（粵）2018-0002］；小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分組，每組5 只，組別為正常飲食對(duì)照組（control）、高鹽飲食組（high salt diet，HSD），正常飲食對(duì)照組按照常規(guī)飼養(yǎng)方法，高鹽飲食組采用高鹽特制飼料（NaCl 成分為8%）飲食12 周。兩組小鼠予以自由飲食、飲水、予同等的光照時(shí)間，晝夜比12 h∶12 h，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)未出現(xiàn)小鼠死亡，喂養(yǎng)12 周后小鼠分別予1.5 % 戊巴比妥鈉麻醉處死，開腹取出結(jié)腸組織，迅速收集所需數(shù)據(jù)，立即放入預(yù)先做好標(biāo)記的凍存管中并放入液氮，再進(jìn)行-80 ℃凍存。

1.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM-460 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)組別：（1）正常對(duì)照組（control）；（2）高濃度NaCl組（high NaCl，50 mmol/L）；（3）高濃度NaCl+JAK1 抑制劑共孵育組high NaCl（50 mmol/L）+ Ruxolitinib（50 μmol/L），然后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白提取和樣品制備在收集好的結(jié)直腸組織，或處理過的腸細(xì)胞置于冰上，加入適量體積的含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解，結(jié)直腸組織在組織破碎儀的作用下制備成樣品勻漿液，4 ℃離心10 000 ×g，10 min。收集樣品上清液，然后取少量上清液，采用BCA Protein Assay Kit 檢測樣品的蛋白濃度，剩余上清液做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 Western blot 實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣本取30 μg 蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃下?lián)u晃過夜，加辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，最后行ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，用凝膠成像系統(tǒng)（chemiDoclM xRs+system，Bio-Rad）采集圖像，用Image-Pr0 Plus軟件進(jìn)行灰度掃描。

1.3.3 口服糖耐量的測定先將兩組禁食12 h 后經(jīng)尾靜脈采血測定空腹血糖值（blood glucose，BG），然后一次性灌胃給予40%葡萄糖溶液（2 g/kg），分別在灌胃后30、60、90 和120 min 檢測血糖值，繪制血糖-時(shí)間曲線，并采用梯形法計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），AUC（mmol/L·min）=1/2 ×（BG 0 min + BG 30 min）× 30 min + 1/2 ×（BG 30 min+BG 60 min）×30 min+1/2×（BG 60 min+BG 90 min）×30 min+1/2×（BG 90 min+BGl 20 min）×30 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高鹽飲食對(duì)小鼠的體質(zhì)量和腸道的代謝影響高鹽飲食12 周后，與正常飲食對(duì)照組相比，高鹽飲食組小鼠不僅體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），結(jié)直腸的腸重量和腸長度也都顯著降低（表1）；此外，12 周的高鹽飲食還誘導(dǎo)了小鼠的糖耐受異常，在口服糖耐量試驗(yàn)測得糖負(fù)荷60、90 和120 min 時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度均顯著高于正常飲食對(duì)照組（P＜0.01，圖1 A），并且計(jì)算所得的血糖-時(shí)間曲線下面積（AUG）也明顯增加（P＜0.01，圖1 B），這些結(jié)果提示，高鹽飲食可誘導(dǎo)小鼠的體重和腸道等體內(nèi)代謝異常。

表1 高鹽飲食小鼠模型的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果Tab.1 Results of various indicators in a mouse model of high-salt diet ± s

表1 高鹽飲食小鼠模型的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果Tab.1 Results of various indicators in a mouse model of high-salt diet ± s

注：control 組為正常飲食對(duì)照組，HSD 組為高鹽飲食組，*P ＜0.05 vs. 正常飲食對(duì)照組（control）

組別control 組HSD 組體質(zhì)量（g）23.80 ± 0.90 18.90 ± 2.20*結(jié)直腸重量（g）0.196 3 ± 0.01 0.169 3 ± 0.01*結(jié)直腸長度（cm）8.10 ± 0.23 7.50 ± 0.21*

2.2 高鹽飲食對(duì)小鼠腸屏障功能的影響腸上皮屏障主要由細(xì)胞間的緊密連接蛋白（Occludin、ZO-1 等）、下端粘附連接和細(xì)胞橋粒等形成的機(jī)械屏障，調(diào)控腸道通透性，使得跨細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸保持動(dòng)態(tài)平衡，所以緊密連接蛋白的表達(dá)量是衡量腸屏障功能的重要指標(biāo)之一。通過Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測兩組小鼠腸組織中的緊密連接蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，相對(duì)于正常飲食對(duì)照組，高鹽飲食組小鼠的結(jié)直腸組織的緊密鏈接蛋白ZO-1 和Occludin蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05，圖2），結(jié)果提示高鹽飲食可降低腸組織的緊密連接蛋白，影響小鼠腸屏障功能。

圖l 兩組小鼠口服糖耐量試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of oral glucose tolerance test in two groups of mice

2.3 高鹽飲食對(duì)小鼠結(jié)直腸組織JAK1/STAT3 通路蛋白的影響本實(shí)驗(yàn)檢測了兩組小鼠腸組織中的JAK1/STAT3 通路蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，相對(duì)于正常飲食對(duì)照組，JAK1/STAT3 通路中的p-JAK1磷酸化蛋白明顯升高（P＜0.05），p-STAT3 磷酸化蛋白也具有明顯的增加趨勢（P＞0.05），結(jié)果表明高鹽飲食可激活腸組織JAK1/STAT3 通路。見圖3。

2.4 高濃度NaCl 對(duì)人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞JAK1/STAT3 通路的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證高鹽是否直接誘導(dǎo)了腸道JAK1/STAT3 通路激活，采用高濃度NaCl（50 mmol/L）孵育處理人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM-460 細(xì)胞48 h，然后經(jīng)過Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，高濃度NaCl 可誘導(dǎo)p-JAK1磷酸化蛋白顯著升高（P＜0.05），p-STAT3 磷酸化蛋白表達(dá)顯著增多（P＜0.001），即JAK1/STAT3通路蛋白的磷酸化水平上升；但采用JAK1 抑制劑Ruxolitinib 共孵育48 h 后，該作用可被JAK1 抑制劑逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，高濃度NaCl 可直接激活腸道JAK1/STAT3 通路。見圖4。

2.5 高濃度NaCl 對(duì)人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞腸屏障緊密連接蛋白的影響在高濃度NaCl 孵育處理人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，高濃度NaCl 除了可激活JAK1/STAT3 通路外，也顯著地降低了腸屏障緊密連接蛋白ZO-1 和Occludin 的表達(dá)（P＜0.05）；但是采用JAK1 抑制劑Ruxolitinib 與高濃度NaCl 共同孵育48 h 后，與高濃度NaCl 處理組相比，JAK1 抑制劑可使ZO-1和Occludin 的蛋白表達(dá)恢復(fù)至正常對(duì)照組的水平（P＜0.05）。綜上結(jié)果表明，高濃度NaCl 可通過激活JAK1/STAT3 通路誘導(dǎo)腸屏障蛋白表達(dá)受損。見圖5。

注：A，結(jié)直腸組織緊密連接蛋白電泳條帶；B，緊密連接蛋白ZO-1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量；C，緊密連接蛋白Occludin 的蛋白相對(duì)表達(dá)量；control 組為正常飲食對(duì)照組，HSD 組為高鹽飲食組，*P ＜0.05，**P ＜0.01 vs. 正常飲食對(duì)照組（control）

圖3 各組小鼠的結(jié)直腸組織JAK1/STAT3 通路蛋白Fig.3 JAK1/STAT3 pathway protein in colorectal tissue of each group of mice

圖4 高濃度NaCl 對(duì)人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞JAK1/STAT3 通路的影響Fig.4 The effect of high concentration NaCl on JAK1/STAT3 pathway in human normal colorectal epithelial cells

3 討論

當(dāng)腸屏障緊密連接蛋白遭到破壞，腸上皮屏障功能障礙會(huì)導(dǎo)致腸通透性增加，隨后是有毒代謝物或管腔促炎分子的滲透，導(dǎo)致持續(xù)的炎癥和組織損傷，炎癥性腸病IBD 患者中表現(xiàn)出腸細(xì)胞旁通透性增。高鹽飲食誘導(dǎo)免疫細(xì)胞在腸道中積累，促炎性細(xì)胞因子增加，嚴(yán)重還可加劇神經(jīng)炎癥［22］，并引起血管神經(jīng)認(rèn)知功能障礙［23-25］。作為人體重要防線的腸上皮屏障，具有防止腸內(nèi)高負(fù)荷的細(xì)菌和毒素穿過腸粘膜進(jìn)入人體血液循環(huán)的重要作用。因此，研究誘發(fā)腸屏障功能障礙的機(jī)制，可為社會(huì)提供針對(duì)腸道疾病的有效治療和預(yù)防方法。腸道作為食物吸收的重要器官，飲食習(xí)慣對(duì)腸道屏障功能的影響最大，而近年來也越來越多的研究發(fā)現(xiàn)高鹽飲食與慢性腸炎，腸易激等都密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)12 周高鹽飲食明顯抑制腸道組織的屏障蛋白ZO-1 和Occludin的表達(dá)，并且降低結(jié)直腸的重量和長度，提示腸道功能受損。WILCK 等［26］也曾報(bào)道過中度高鹽飲食可導(dǎo)致人體高血壓，伴有腸菌紊亂和腸道過度免疫性損傷，并且高血壓患者血清中腸道脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP）、連蛋白（腸道上皮緊密連接蛋白調(diào)節(jié)因子）以及脂多糖LPS 等都顯著升高，該結(jié)果是對(duì)本研究高鹽飲食誘導(dǎo)小鼠腸道屏障功能障礙的有力佐證，但其中的機(jī)制尚未明確。

圖5 高濃度NaCl 對(duì)人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞腸屏障緊密連接蛋白的影響Fig.5 The effect of high concentration of NaCl on tight junction protein of intestinal barrier of human normal colorectal epithelial cells

JAK/STAT 通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程。本研究除了發(fā)現(xiàn)高鹽飲食激活了小鼠腸組織JAK/STAT 通路和損傷腸屏障功能外；在腸上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，高濃度NaCl 也顯著增加了JAK1 和STAT3 的磷酸化，并降低細(xì)胞的腸屏障蛋白表達(dá)，但是這些作用可被JAK 抑制劑阻斷，恢復(fù)腸細(xì)胞的屏障蛋白表達(dá)。DENG 等［27］在腦部星形膠質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也報(bào)道過相似結(jié)果，高鹽環(huán)境可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞的STAT3 磷酸化增加，使用JAK 抑制劑則阻斷高鹽對(duì)STAT3 的磷酸化作用；LOPERENA等［28］也在具有高鹽飲食習(xí)慣的高血壓患者的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)STAT3、STAT5 磷酸化被激活；還有研究在大鼠腸道缺血再灌注損傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)，腸組織的JAK/STAT 通路激活并伴有腸上皮細(xì)胞凋亡，使用右美托咪或小檗堿處理抑制JAK/STAT 通路活性后，可顯著減輕腸道缺血損傷及腸上皮細(xì)胞凋亡［29-31］。以上國內(nèi)外研究結(jié)果從側(cè)面佐證了本研究提出“高鹽環(huán)境可能通過激活JAK1/STAT3 通路蛋白磷酸化誘導(dǎo)腸屏障功能障礙”的觀點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過高鹽環(huán)境的動(dòng)物模型和細(xì)胞模型，揭示了高鹽飲食損傷腸上皮屏障功能障礙的機(jī)制與JAK1/STAT3 通路激活密切相關(guān)，此外還發(fā)現(xiàn)JAK1 抑制劑具有治療高鹽誘導(dǎo)的腸上皮屏障功能障礙的作用，為治療腸道疾病提供新的輔助治療靶點(diǎn)、藥物和預(yù)防方法。