尹 鑫，趙尊康，王惠明，俞 瑩，周春火*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學國土資源與環(huán)境學院/江西省農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用與面源污染防控產(chǎn)教融合重點創(chuàng)新中心/南昌市農(nóng)業(yè)農(nóng)田養(yǎng)分資源管理與農(nóng)業(yè)面源污染防控重點試驗室，江西南昌 330045；2.江西省農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護站，江西南昌 330046）

【研究意義】水葫蘆，又名鳳眼藍、鳳眼蓮，于20世紀引入我國，因其較高的觀賞價值、營養(yǎng)價值和藥用價值被大量養(yǎng)殖[1]。然而，近年來由于工、農(nóng)業(yè)的發(fā)展和人民生活水平的提高，大量的工、農(nóng)業(yè)廢水和生活污水的排放導致自然水體污染加劇，水體富營養(yǎng)化嚴重。水葫蘆須根發(fā)達，生長繁殖極快，嚴重擠壓了其他水生植物的生長營養(yǎng)和生存空間，對本地生物多樣性構(gòu)成威脅[2]。當前，由于水葫蘆惡性增長導致河道、航道堵塞和排灌困難的環(huán)境事件層出不窮。因此，水葫蘆的綜合防治研究具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】長期以來，水葫蘆的綜合防治是一項世界性難題。目前各國對于水葫蘆的防治主要有物理防治、化學防除和生物防治。物理防治主要是采用人工打撈或機械清除的方式，該方法對小范圍水葫蘆防治見效較快，但對于水葫蘆發(fā)生面積較大的防治往往不盡如人意。水葫蘆物理防治人力成本高、勞動強度大并且運輸成本高。而且物理防治方法并不能殺死水葫蘆種子，長期防治效果不佳。生物防治主要是引進天敵水葫蘆象甲，目前已經(jīng)在多個國家和地區(qū)取得成功。我國王慶梅等[3]通過引進水葫蘆象甲取得了很好的試驗效果。然而，水葫蘆象甲受到環(huán)境氣候影響較大，該昆蟲幼蟲在我國越冬困難，需要重復引進，引進成本較高。而且，水葫蘆象甲也屬于外來生物，引進有可能導致帶來另外的生態(tài)風險導致新的生態(tài)問題[4]。目前，治理水葫蘆泛濫最快的方法是化學防除，即使用化學除草劑殺死水葫蘆。江洪濤等[1]利用草甘膦防治水葫蘆取得了較好的效果，草甘膦能夠通過內(nèi)吸傳導抑制幼芽、幼葉生長。Ashwini 等[5]研究發(fā)現(xiàn)當草甘膦濃度為0.8%時，其可以與象甲共存減少水葫蘆分蘗并控制葉片生長達到控制水葫蘆的目的。游泳等[6]研究表明，投加濃度為1.9 g/L的草甘膦異丙胺鹽可以很好的抑制水葫蘆的新根和葉片，但對葉柄和鮮質(zhì)量的防除效果較差。蔡英杰等[7]采用克無蹤防治水葫蘆也取得了比較好的效果，噴藥后8 d其死亡率即達到了99%的效果；陳若霞等[8]發(fā)現(xiàn)水花生凈對水葫蘆具有更好的防治效果。此外，草克星（10%吡磺嘧隆可濕粉）和農(nóng)達（41%草甘膦水劑）對于水葫蘆的快速防治也具有一定的效果。然而，盡管化學控制效果明顯，但已有的化學除草劑都難免會對自然水體造成污染，進而影響水生生物的正常生長，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。而且，水葫蘆對于農(nóng)藥會逐漸產(chǎn)生抗藥性，使得防治水葫蘆的農(nóng)藥量呈逐年增加的趨勢[9]。因此，一些新型低毒、高效除草劑的引進和安全性評估對于水葫蘆的防治具有重要的意義。

【本研究切入點】近年來，原卟啉原IX 氧化酶（PPO）抑制劑引起了農(nóng)藥研究者的廣泛關注。PPO 是生物體葉綠素和血紅素合成鏈上的最后一個酶，廣泛存在于高等動物、植物、細菌和真菌等多種生命形式中[10]。植物體內(nèi)有2種PPO，分別活躍于葉綠體和線粒體上。定位于雜草細胞葉綠體上的PPO 被抑制后，生物合成葉綠素機制被阻斷，使得細胞產(chǎn)生破壞進而使雜草生長受到抑制或死亡。PPO 抑制型除草劑具有高效、低毒、作用時間快、藥效持久度高等一系列優(yōu)點[11]。而且，相對于其他除草劑而言，PPO類除草劑的抗性增長較為緩慢，關于PPO 除草劑抗性的報道較少。目前，PPO 抑制劑主要分為二苯醚類和雜環(huán)類2種。二苯醚類抑制劑研究起步較早，主要包括乙氧氟草醚、福鎖草醚和氟磺胺草醚等抑制劑，這類抑制劑目前仍然被應用于雜草的去除。近年來，一些雜環(huán)如三氟甲基被引入，經(jīng)過進一步的結(jié)構(gòu)修飾形成了一些新的PPO抑制劑型除草劑如雙苯醚草酮、苯醚環(huán)草胺，極大的提高了除草劑的活性并且減少了藥劑的使用量。顯然，根據(jù)其作用機制，有理由相信PPO抑制劑也會對水葫蘆的生長具有一定的抑制作用[12]。但是目前還沒有關于PPO 抑制劑類除草劑作用于水葫蘆的相關研究，作用于水體的安全性評估也未有報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究選取幾種具有代表性的基于PPO抑制劑，考察其對水葫蘆的防治效果，并對其作用于水體后的殘留進行安全性評估。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的水葫蘆來自江西農(nóng)業(yè)大學水處理實踐基地污水處理池。

本試驗所用的抑制劑主要有氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺，均購于美國西格瑪奧德里奇生命科學與高科技集團公司。按照Park等[13]描述的方法，首先將抑制劑溶于二甲基亞砜中，所配置的母液濃度為100 mmol/L。再將母液和超純水按照體積比為0.05%配置為水劑。

本試驗所用的四尾柵藻取自實驗室藻種庫。

1.2 盆栽試驗

首先，從水處理實踐基地污水處理池中選取大小和長勢基本一致的15 株水葫蘆置于36 cm×36 cm的塑料盆內(nèi)，深度為10 cm，培養(yǎng)水源為水處理實踐基地污水（江西農(nóng)業(yè)大學生活污水）。按照Park 等[13]描述的方法水葫蘆噴藥量為100 mL，分別在噴藥后第1、5、10、20 和30 天觀察抑制效果并記錄死亡天數(shù)和1個月之后的復活率。

1.3 毒性試驗

根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》設置實驗方案如下：設置抑制劑濃度梯度為0，0.25，0.5，1.0，2.0，3.0 mg/L。將抑制劑加入四尾柵藻初試濃度為190 個/mL 的BG11 培養(yǎng)液后搖勻放入光照培養(yǎng)箱，設置光照培養(yǎng)箱光照強度為4 000 lx，連續(xù)光照，溫度為（23±1）℃，每24 h 取樣在顯微鏡下觀察藻密度。試驗結(jié)果按照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》進行抑制劑毒性等級劃分。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗調(diào)查過程中，葉片和葉柄采用分級統(tǒng)計方法，枯葉（枯柄）防效和鮮質(zhì)量防效主要計算公式如下：

統(tǒng)計學分析采用SPSS 和Origin 軟件，并分別用單因素方差分析和Duncan 法進行分析不同處理間的差異和多重比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類抑制劑對水葫蘆鮮質(zhì)量的影響

首先，分別考察了氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺對水葫蘆鮮質(zhì)量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當分別噴灑這4 種抑制劑后，水葫蘆移栽后的生長表現(xiàn)存在明顯的差別（圖1）。移栽后第1 天，經(jīng)過抑制劑作用后的水葫蘆鮮質(zhì)量均沒有明顯的增加或者減退跡象。移栽后第5天，對照水葫蘆鮮質(zhì)量從0.35 kg 增加到0.42 kg，鮮質(zhì)量增加了20%，經(jīng)過氟磺胺草醚施加后的水葫蘆也增加到0.37 kg，相比移栽前僅增加了5.7%。顯然，氟磺胺草醚的增加雖然沒有對水葫蘆產(chǎn)生防效但是也抑制了水葫蘆的生長，鮮質(zhì)量防效為11.9%。但是，與氟磺胺草醚同為醚類物質(zhì)的乙氧氟草醚施加5 d后，水葫蘆鮮質(zhì)量降到了0.33 kg，其導致水葫蘆的5 d 鮮質(zhì)量減退防效達到了8.50%，鮮質(zhì)量防效達到了23.8%。此外，研究結(jié)果顯示草胺類抑制劑的施加對于水葫蘆具有更好的防效，丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺的施加，使得移栽5 d后水葫蘆鮮質(zhì)量分別只有0.31和0.30 kg，水葫蘆鮮質(zhì)量減退率分別達到了11.4%和14.3%。相比對照的鮮質(zhì)量防效高達26.2%和28.6%。然而，隨著時間的延長，醚類抑制劑和草胺類抑制劑出現(xiàn)了明顯不同的趨勢。當盆栽實驗進行到第30 天時，施加氟磺胺草醚和乙氧氟草醚后的水葫蘆出現(xiàn)了一定程度的返青現(xiàn)象，其鮮質(zhì)量相比移栽前鮮質(zhì)量都有所增加。相比移栽前，其鮮質(zhì)量分別增加了68.6%和57.1%。但是，施加氟磺胺草醚和乙氧氟草醚后對水葫蘆具有一定的防效，其鮮質(zhì)量低于對照，防效率分別為20.3%和25.7%。施加草胺類PPO抑制劑的水葫蘆呈現(xiàn)明顯的鮮質(zhì)量減退現(xiàn)象。第30天，丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺的施加水葫蘆的鮮質(zhì)量分別只有0.24 和0.22 kg，其鮮質(zhì)量減退率達到了31.4%和37.4%，鮮質(zhì)量防效更是達到了66.7%和69.4%。試驗結(jié)果表明，4種PPO抑制劑均對水葫蘆有一定的鮮質(zhì)量防效，但是草胺類抑制劑的鮮質(zhì)量防效明顯高于醚類抑制劑。丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺雖然與氟磺胺草醚、乙氧氟草醚等二苯醚類PPO 抑制劑的作用機理相似，但化學結(jié)構(gòu)完全不同。丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺等PPO 抑制劑結(jié)構(gòu)中引入了大量的雜環(huán)化合物。Yang 等[14]研究表明，雜環(huán)和鹵素取代基的引入可能使化合物的PPO的活性腔結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，并直接影響抑制劑的范德華力與受體蛋白的結(jié)合能，這可能是草胺類PPO抑制劑對水葫蘆具有更好防效的根本原因。

圖1 不同PPO抑制劑噴施后水葫蘆鮮質(zhì)量隨時間的變化Fig.1 The variation of fresh weight over time after different PPO inhibitors application

圖2 不同PPO抑制劑噴施后水葫蘆分蘗隨時間的變化Fig.2 The variation of tiller numbers over time after different PPO inhibitors application

2.2 不同種類抑制劑對水葫蘆分蘗的影響

水葫蘆通過合軸分支的生長方式進行生長繁殖，通過葉腋間長出腋芽最終生成新株，因此如能控制水葫蘆的分蘗對于其防治將能夠起到事半功倍的效果[15]。因此試驗還分別考察了氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺對水葫蘆分蘗的影響。如圖2 所示，4 種PPO 抑制劑的施加對水葫蘆的分蘗均產(chǎn)生了一定的抑制，但抑制效果存在一定的差異性。施藥前，水葫蘆的分蘗平均數(shù)為3.37 個，當施氟磺胺草醚和乙氧氟草醚30 d 后，水葫蘆分蘗增長到了20.3 和18.9 個，相比對照的30.6，2 種草醚類PPO 抑制劑對水葫蘆的分蘗防效分別為33.9%和38.5%。顯然，草醚類PPO 抑制劑雖然抑制了水葫蘆的分蘗，但對水葫蘆并沒有起到完全的滅殺作用。但是，經(jīng)過丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺的施加，30 d 后水葫蘆的分蘗數(shù)減少到了1.35和0.61個，2種草胺類抑制劑對水葫蘆的分蘗防效達到了95.6%和98.0%，水中水葫蘆幾乎被完全滅殺。顯然，相比2種二苯醚類PPO 抑制劑，加入雜環(huán)的新型PPO 抑制劑對于水葫蘆的分蘗防效更佳。

2.3 不同種類抑制劑對水葫蘆葉面和葉柄的影響

抑制劑主要通過葉面吸收抑制植物細胞的葉綠素生物合成鏈上的PPO，導致植物光合作用被破壞最終使得植物生長被抑制而死亡。如表1所示，無論是對照還是抑制劑處理后的水葫蘆葉面枯葉指數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢。但經(jīng)過抑制劑處理后的水葫蘆葉面枯葉指數(shù)明顯上升更快。而且，與鮮質(zhì)量結(jié)果不一樣的是，抑制劑噴施過后的第1 天，水葫蘆即出現(xiàn)了明顯的枯葉，4 種抑制劑的枯葉指數(shù)分別為6.06%、6.15%、7.27%和8.02%。相比前人研究結(jié)果，PPO 抑制劑噴施后的水葫蘆與其他除草劑相比枯葉出現(xiàn)的頻率明顯更快。此外，4種抑制劑噴施后的效果存在較大的不同。氟磺胺草醚藥后第20天，枯葉指數(shù)達到了77.6%，并且之后出現(xiàn)了明顯的返青現(xiàn)象，藥后30 d，枯葉指數(shù)又上升到了65.4%。與氟磺胺草醚相比，乙氧氟草醚枯葉增長率明顯更快，藥后第20 天，枯葉指數(shù)均達到了100%并且不再返青。相比二苯醚類PPO抑制劑，草胺類抑制劑對水葫蘆的枯葉防效更好，藥后第10天其枯葉指數(shù)均達到了100%，且不再返青。

表1 不同種類抑制劑對水葫蘆葉面枯葉指數(shù)的影響Tab.1 Effects of different PPO on leaf surface of water hyacinth%

表2 不同種類抑制劑對水葫蘆葉柄枯柄指數(shù)的影響Tab.2 Effects of different PPO on petiole of water hyacinth%

如表2所示，4種PPO抑制劑對葉柄的防效與葉面防效大致相同，5試驗枯柄指數(shù)大致均呈現(xiàn)上升的趨勢，對照第30天枯柄指數(shù)大約為6.46%。但噴施PPO 抑制劑后出現(xiàn)枯柄的時間明顯晚于葉片，這可能與抑制劑的傳輸存在一定的關系。藥后第1 天，并沒有出現(xiàn)明顯的枯柄，直到藥后第5 天才有明顯的枯柄出現(xiàn)。與葉面結(jié)果類似，氟磺胺草醚藥后第30天，葉柄也出現(xiàn)了一些返青現(xiàn)象，藥后30 d，其枯葉指數(shù)達到了44.0%。乙氧氟草醚、丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺在藥后第30 天、20 天和20 天枯葉指數(shù)均達到了100%且不再返青。根據(jù)前人研究成果，盡管作用于防治水葫蘆的基本原理大致相同，但由于其化學機構(gòu)的區(qū)別導致其自由活化能大不相同，并且其與水葫蘆細胞的結(jié)合能也存在很大的區(qū)別，最終導致不同的PPO抑制劑對水葫蘆具有不同的防效[16]。

2.4 不同種類抑制劑對水葫蘆根系的影響

王長方等[17]認為由于除草劑對水葫蘆不同部位的毒力不同，采樣株防效或鮮質(zhì)量作為評價標準不能準確反映除草劑對水葫蘆各部位的防效。因此本試驗還分別考察了不同種類PPO抑制劑對水葫蘆根長和新根的影響。如圖3a所示，移栽30 d后，對照水葫蘆根長從3.95 cm長到了23.95 cm，增長了5.06倍。而施加氟磺胺草醚和乙氧氟草醚的水葫蘆根長30 d 后僅僅分別長到了15.58 和14.87 cm，相比移栽前增長了2.94和2.76倍，但是相比對照減少了34.95%和37.9%。顯然，與前面鮮質(zhì)量和分蘗的結(jié)果類似，二苯醚類PPO抑制劑對水葫蘆具有一定的防治效果，但防治效果欠佳。但是，施加丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺后，水葫蘆根基本上不再生長。產(chǎn)生此類現(xiàn)象的原因可能是因為草胺類PPO抑制劑雖然僅僅施加于葉面抑制葉片進行光合作用，但是也很快影響了根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因而導致水葫蘆根不再生長。

此外，本試驗還考察了PPO抑制劑對于新根的防效。與根長結(jié)果類似，草胺類PPO抑制劑對于新根的防效有明顯強于二苯醚類抑制劑。移栽后，對照和施加抑制劑的水葫蘆根系均出現(xiàn)了新根的生長，但對照明顯生長更快。噴施后第5天，對照和噴施氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺的水葫蘆新根數(shù)分別為1.68、1.5、1.11、1.04和0.98個，并且一直到噴施抑制劑后10天新根均持續(xù)生長。但是到第20天，噴施乙氧氟草醚、丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺的水葫蘆新根數(shù)不再繼續(xù)增長，此時這3個試驗組的水葫蘆新根數(shù)為2.31、1.92和1.64個。噴施苯嘧磺草胺的新根防效依然最好，其新根防效達到了53.7%。前人研究表明，在光的作用下PPO抑制劑通過對PPO的抑制，會導致光敏性物質(zhì)原卟啉IX短期內(nèi)在細胞質(zhì)內(nèi)大量聚集并向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，最終經(jīng)過一系列的復雜反應導致細胞膜發(fā)生過氧化反應導致細胞死亡，從而使得葉片和葉柄枯萎。該類抑制劑雖然僅僅作用于葉片和葉柄，但植物合成有機物必須通過葉片和葉柄光合作用來生成[18]。顯然，光合作用被破壞不僅會導致水葫蘆葉片枯萎而無法進行光合作用，而且會使得根部吸收的營養(yǎng)無法向葉柄和葉面轉(zhuǎn)移，最終使得根部無法繼續(xù)增長，新根無法生成。

圖3 不同種類抑制劑處理后的水葫蘆根長和新根數(shù)對比Fig.3 Comparison of length of root and new roots numbers after different PPO inhibitors application

2.5 不同種類抑制劑對四尾柵藻的應急毒性

根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》，農(nóng)藥的使用必須進行安全風險評估。因此，本試驗通過考察不同種類、不同濃度PPO 抑制劑對四尾柵藻生長速率的影響和應急毒性評估其對水體的安全風險。試驗設置的抑制劑濃度梯度0，0.25，0.5，1，2，3 mg/L。研究結(jié)果表明二苯醚類和草胺類PPO 抑制劑對四尾柵藻生長速率的抑制呈現(xiàn)不同的趨勢，如圖4 所示。以氟磺胺草醚抑制劑為例，當抑制劑濃度從0 增加至1 mg/L 時，藻種雖然生長率有所抑制，但生物量依然隨時間延長呈現(xiàn)增長的趨勢。但小瓶反應至96 h 時，藻種密度從190 個/mL 增加到300 個/mL，增長了57.9%，相比對照（380 個/L）生物量減少了21.1%。隨著濃度的繼續(xù)升高至2.0 mg/L 和3.0 mg/L 時，其生長率和生物量均持續(xù)降低。相比對照，其生物量抑制率分別達到了51.3%和73.7%。乙氧氟草醚與氟磺胺草醚趨勢相似，其半抑制濃度均小于3.0 mg/L 但大于0.3 mg/L，對于四尾柵藻而言，屬于中度農(nóng)藥。丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺兩種抑制劑對四尾柵藻生長的影響與二苯醚類有所不同，在本試驗設置的濃度梯度內(nèi)四尾柵藻雖然生長率有所抑制，但其生物量在96 h內(nèi)一直呈現(xiàn)上升的趨勢。以苯嘧磺草胺為例，當濃度達到3.0 mg/L時，96 h后，對照組和試驗組的四尾柵藻密度分別為370和310個/mL，生物量抑制率為16.2%。因此，根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》，本試驗采用的4 種PPO 抑制劑，氟磺胺草醚和氟磺胺草醚對于四尾柵藻而言屬于中度，丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺屬于低毒。但是前人研究表明，在生態(tài)毒理試驗中，不同藻類對同一農(nóng)藥的敏感性并不一樣，敏感性強的一旦接觸農(nóng)藥生長數(shù)量就會馬上受到影響。同一類藻，農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)是造成毒性效應差異的主要原因。鄒立等[19]發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥中苯環(huán)的存在加劇了該類農(nóng)藥的毒性。孫玲玉等[20]發(fā)現(xiàn)盤星藻對于手性農(nóng)藥甲霜磷的毒性比斜生柵藻要敏感。但是對于同一種藻而言，農(nóng)藥的毒性越強，藻細胞的生長速率越緩慢。因此本試驗雖然不能完全表征這4種抑制劑屬于哪個農(nóng)藥毒性等級，但可以證明草胺類抑制劑的毒性風險相比二苯醚類要更弱，并且對于水葫蘆的滅殺效果更強，更適合用于水葫蘆的防治。

圖4 不同種類抑制劑對四尾柵藻生長的影響Fig.4 the effects of different PPO inhibitors on the growth of Scenedesmus quadricauda

3 結(jié)論與討論

通過盆栽和應急毒性試驗分別考察了4 種PPO 抑制劑對水葫蘆生長的影響并做了安全評估。研究結(jié)果表明：（1）草胺類PPO抑制劑丙炔氟草胺和苯嘧磺草胺對水葫蘆的鮮質(zhì)量、分蘗、根長、新根、葉面和葉柄的防效均強于二苯醚類抑制劑氟磺胺草醚和乙氧氟草醚；（2）相比草胺類抑制劑，應用二苯醚類抑制劑更容易出現(xiàn)返青現(xiàn)象；（3）毒性試驗結(jié)果表明，草胺類抑制劑的毒性風險相比二苯醚類要更弱。綜合對比結(jié)果顯示，草胺類抑制劑更適合水葫蘆的綜合防治。

采用化學防治水葫蘆具有見效快的特點，但如何減少化學用藥量，降低化學藥劑對水生生物的毒性依然是一個任重而道遠的重要課題。本研究利用盆栽試驗證明了PPO抑制劑在水葫蘆防治上具有一定的優(yōu)勢，但是其是否能應用較大水面并對水生生物保證低毒性依然有待進一步研究。而且，化學除草劑的抗藥性是一個永恒的話題，PPO抑制劑作用于水葫蘆的機理研究和抗藥性研究也具有十分重要的意義。