張光磊，梁云坤，金麗蘭

吉林省敦化市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧站，吉林敦化 133700

胰島移植被認(rèn)為是治療Ⅰ型糖尿病的最理想的方法。豬胰島細(xì)胞和人胰島細(xì)胞的氨基酸序列僅相差一個，能夠在人體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖水平的正常功能。所以，豬胰島已經(jīng)成為治療人Ⅰ型糖尿病的最理想供體。關(guān)于豬胰島分離純化方面已經(jīng)積累了大量研究資料。結(jié)果表明，豬胰腺結(jié)締組織發(fā)達，內(nèi)分泌與外分泌連接緊密；胰島周圍缺乏被摸保護，容易破碎。此外，豬的年齡、品系和體外缺血時間等同樣是影響胰島產(chǎn)量和活力的客觀因素。此外，朱海濤等認(rèn)為豬胰島細(xì)胞一般來源于胎豬、新生豬或成年豬，但是何時期的豬胰島細(xì)胞更適合于人類進行異種移植，現(xiàn)仍存在爭議。因此，本試驗為進一步探討完善并建立豬胰島細(xì)胞分離純化方法提供參考數(shù)據(jù)，以出生1日齡、50日齡、100日齡、150日齡豬為試驗動物，采用膠原酶注射法、DTZ染色法、histopaque法等進行豬胰島形態(tài)學(xué)觀察及胰島分離純化，并采用葡萄糖刺激胰島素釋放試驗檢測1日齡和150日齡豬胰島體外功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用出生1日齡、50日齡、100日齡及150日齡健康長白豬的胰腺組織各5例。

1.2 試劑與儀器

試劑：膠原酶Ⅴ、DTZ（雙硫腙）、Histopaque-1077、Hanks、臺盼藍均購自于Sigma公司；胎牛血清、RPMI-1640購于Gibco公司；ELISA檢測試劑盒購于RD公司。主要儀器設(shè)備：實體顯微鏡（OLYMPUS）、臥式圓形壓力蒸汽滅菌器（TOMY KOGYO）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo MCO-18AIC）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電子天平，離心機，超級潔凈工作臺等。

1.3 方法

1.3.1 豬胰腺的取材

1日齡、50日齡豬的胰腺于實驗室采用外科手術(shù)方法獲得，而100日齡、150日齡豬的胰腺取自龍井市屠宰場。取材時，保證熱缺血小于10 min和冷缺血時間小于30 min。取材后，立即剝離胰腺組織，用含雙抗Hanks液清洗，并放入RPMI-1640緩沖液置于保溫箱中。剝離胰腺時注意無菌環(huán)境低溫條件操作，同時運用含雙抗生理鹽水或4 ℃的冷Hanks液清洗。

1.3.2 胰島細(xì)胞消化

找到胰腺組織的胰管注射膠原酶消化液結(jié)扎后，放入37 ℃水浴鍋中靜置消化，震蕩數(shù)次，組織變?yōu)榧?xì)沙狀后加入終止液，翻轉(zhuǎn)，濾網(wǎng)過濾，收集分離物，DTZ染色，觀察分離物形態(tài)學(xué)特征。

1.3.3 胰島細(xì)胞分離純化

胰島純化分離物懸液轉(zhuǎn)入離心管，離心棄上清液，加入終止液洗滌翻轉(zhuǎn)，反復(fù)操作兩次。將Histopaque-1077與沉淀物混勻，再緩慢傾斜加入等量DMEM培養(yǎng)液，使兩種液體出現(xiàn)分層，進行離心，離心后，離心管中液體分層明顯，兩層間存在懸浮物為豬胰島細(xì)胞聚集團，吸取離心管中的全部胰島，加入培養(yǎng)液混勻，離心棄上清，反復(fù)操作兩次。收集胰島細(xì)胞，并且體外培養(yǎng)同時進行胰島體外胰島素釋放功能測定。

1.3.4 胰島計數(shù)和提純

運用特異性DTZ染色法，胰島染成猩紅色，非胰島細(xì)胞不著色，染色后對胰島在顯微鏡下觀察計數(shù)，統(tǒng)計出胰島個數(shù)、純度和胰島直徑大小。

1.3.5 體外培養(yǎng)胰島素釋放測定

對分離純化后的胰島進行臺盼藍染色，染色后統(tǒng)計胰島細(xì)胞存活率，被染成藍色細(xì)胞為死細(xì)胞，不著色為活細(xì)胞。

1.3.6 胰島體外功能測定

挑選純化后的胰島細(xì)胞，并適應(yīng)體外培養(yǎng)基，同時分組培養(yǎng)，在48孔培養(yǎng)板中加入RPMI-1640培養(yǎng)液，隨后將分好組的胰島細(xì)胞放入，收集上清液并用ELISA試劑盒進行胰島素含量測定。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)方法

通過SPSS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)差異顯著性進行單因素ANOVA、t檢驗，p＜0.05為有意義。

2 結(jié)果

2.1 不同日齡豬胰島的形態(tài)學(xué)特點

高清顯微鏡下可見胰島細(xì)胞呈不規(guī)則圓形或者橢圓形，大小不一，表面較為光滑，多數(shù)胰島細(xì)胞包膜完整，存在極少數(shù)破裂細(xì)胞碎片。分離后胰島DTZ染色，每年齡段隨機抽取20個胰島測量其直徑。結(jié)果見表1。

表1 不同日齡豬胰島DTZ染色直徑比較

2.2 不同日齡的豬胰島細(xì)胞獲得量、分離純度和存活率

在熱缺血時間少于10 min，冷缺血時間少于30 min，膠原酶配置濃度1.0 mg/mL或1.5 mg/mL，消化時間15 min為基準(zhǔn)，取相同部位胰腺分離純化，不同日齡組豬胰島獲得量、胰島細(xì)胞數(shù)量和分離純度上均有顯著差異（p＜0.05），不同組間數(shù)據(jù)也具有顯著性（p＜0.05）。

表2 不同日齡豬胰島團收獲量、純度及存活率

2.3 1日齡和150日齡豬胰島葡萄糖刺激胰島素釋放檢測結(jié)果

表3 豬胰島素釋放量

由表3可知，兩組間比較，差異顯著(p＜0.05)。

3 討論

目前有很多研究者研究豬胰島細(xì)胞的分離純化，在小鼠和大鼠中也應(yīng)用膽總管穿刺法等一系列方法。每種方法存在各種不同客觀影響因素，從而在胰島分離數(shù)量上有顯著差異。在豬胰島分離中，胰管注射法只有少量學(xué)者采用，原因在于豬胰管位置難以確定并且胰管開口細(xì)小難以分辨，所消耗藥品尤其是膠原蛋白酶量非常大，成本高效率低。由于1日齡豬胰腺腺體發(fā)育未完全，直接可以采用腺體注射，結(jié)扎并消化，這種辦法解決了對消化效果的影響并節(jié)省藥品。在純化方法上，現(xiàn)普遍應(yīng)用的是Ficoll密度梯度離心法，國內(nèi)只在大鼠和小鼠的胰島消化中使用Histopaque-1077純化方法，但在豬胰島純化中未見發(fā)表。該法對比Ficoll密度梯度離心法結(jié)果，操作過程相對簡易，但提純略低，Histopaque-1077純化方法對豬胰島純化效果有待于進一步的探討。

對于消化時間和膠原酶濃度的研究，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為完全消化程度體現(xiàn)在出現(xiàn)白色小顆粒物質(zhì)并呈現(xiàn)泥沙狀。在前期工作中，探討了膠原酶濃度、消化時間及對不同日齡豬胰島分離純化的影響，結(jié)果表明，出生1日齡和50日齡豬最佳膠原酶濃度為1 mg/mL、消化時間為15 min，能獲得較為完整的胰島細(xì)胞，消化時間在30～45 min之間時，雖然胰腺組織可以消化成泥沙狀，經(jīng)DTZ染色鏡下觀察看到胰島聚集組織出現(xiàn)過多碎片，100日齡與150日齡組中最佳膠原酶濃度為1.5 mg/mL、消化時間確定為15 min，這樣可以得到較多的胰島細(xì)胞，膠原酶濃度為2 mg/mL時容易使胰島出現(xiàn)破裂現(xiàn)象。因此，本試驗中1日齡和50日齡的豬胰腺消化試驗中，采用膠原酶濃度為1 mg/mL、消化時間為15 min，而100日齡及以上日齡豬采用的成年豬膠原酶濃度為1.5 mg/mL、消化時間為15 min，該結(jié)果與Jin SM 等學(xué)者發(fā)表過的膠原酶1.0 mg/mL、1.8 mg/mL濃度比較，消化時間長短，胰島數(shù)量上存在不顯著差異。

因此可以確定豬日齡增長的同時，體內(nèi)胰島數(shù)量亦在增加。不同的胰島細(xì)胞分泌不同的激素，因此胰島細(xì)胞在胚胎后發(fā)育中處于正常分化狀態(tài)，同時豬胰島B細(xì)胞同時分泌兩種不同的激素，說明豬胰島細(xì)胞有一定的分化增生能力。

參考文獻：略