王曉楠，徐 暉，張文博

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 大連 116011；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，哈爾濱 150081；3.南崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心，哈爾濱 150000

碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭氏陰性桿菌感染的最后手段。隨著碳青霉烯類藥物在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越多，碳青霉烯類抗菌藥物耐藥現(xiàn)象也日益增加。自2010年以來(lái)，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Crabapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的流行情況惡化，CRKP繼續(xù)在歐洲醫(yī)院蔓延，特別是在地中海地區(qū)。2012年中國(guó)的檢出率顯著高于美國(guó)［1］。肺炎克雷伯菌主要引起肺炎，肺外感染也并非少見，如尿路感染，膽道感染，菌敗血癥等，其中菌敗血癥病情兇險(xiǎn)，病死率高達(dá)37%～50%，故本實(shí)驗(yàn)選擇研究大連地區(qū)血流感染（Bloodstream Infection，BSI）耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥特征，為臨床抗生素的選擇提供依據(jù)，降低CRKP-BSI相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。同時(shí)在流行病學(xué)分析上也是有意義的。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年1月—2018年12月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者的血流感染肺炎克雷伯菌206株。這些患者的病歷特點(diǎn)是臨床上驟發(fā)寒戰(zhàn)，有高熱表現(xiàn)，進(jìn)行血培養(yǎng)檢測(cè)，血培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果顯示肺炎克雷伯菌感染呈陽(yáng)性。納入標(biāo)準(zhǔn)：血液培養(yǎng)分離的致病菌為肺炎克雷伯菌，半年內(nèi)同一患者有多次（2次及以上）肺炎克雷伯菌的血流感染，取首次感染菌株；并且達(dá)到血流感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照2016年美國(guó)CDC［2］；年齡大于等于18周歲患者。將感染碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌作為實(shí)驗(yàn)研究組（CRKP組），共55例；感染對(duì)碳青霉烯類藥物敏感的肺炎克雷伯菌（Carbapenem susceptible Klebsiella pneumoniae，CSKP）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（CSKP組），共151例。查閱病歷資料包括患者性別、年齡等基礎(chǔ)信息，所患主要疾病以及住院過(guò)程中全部診療記錄，同時(shí)進(jìn)行上述一般資料各參數(shù)間的統(tǒng)計(jì)分析，證實(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

鑒于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院是大連市規(guī)模最大的綜合性醫(yī)院，患者主要來(lái)自大連市不同縣區(qū)，206例患者中，1例來(lái)自長(zhǎng)?？h，9例來(lái)自莊河，28例來(lái)自普蘭店，17例來(lái)自瓦房店，151例來(lái)自大連市內(nèi)四區(qū)。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以代表大連地區(qū)的流行情況。

1.2 質(zhì)控菌株

大腸埃希菌 ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，銅綠假單胞菌ATCC27853，以上菌株均由衛(wèi)生部臨檢中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

HF safe-1200型生物安全柜（力康發(fā)展有限公司，中國(guó)）、BACTEC FX-200/9240型全自動(dòng)血培養(yǎng)儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）、Microscan Walk-Away 96plus全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀及配套試劑（德國(guó)Siemens公司）、舒普森（頭孢哌酮/舒巴坦）藥敏紙片（英國(guó)Oxoid公司）等。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)方法

菌株鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)采用MicroScan Walkaway 96 plus全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)完成，參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI 2017版）的標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。頭孢哌酮/舒巴坦采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定，方法如下：（1）制備菌懸液：將培養(yǎng)后的純菌落用無(wú)菌棉簽蘸取適量，溶解于2 ml無(wú)菌生理鹽水中，混勻后用比濁儀校準(zhǔn)濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?。?）無(wú)菌棉簽蘸取適量上述0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，于MH瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂布接種，每次接種涂布時(shí)，將平板旋轉(zhuǎn)60°，連續(xù)涂布接種3次，最后沿著平板邊緣再涂抹2周。（3）貼藥敏紙片：將接種好的MH培養(yǎng)基在室溫下放置3～5 min，按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，用無(wú)菌鑷子取藥敏紙片，將其貼于瓊脂表面。操作時(shí)注意紙片不能過(guò)于貼近平板邊緣，其中心需距離平板邊緣大于等于15 mm。（4）孵育：將接種好的培養(yǎng)基于15 min內(nèi)放置恒溫培養(yǎng)箱孵育，孵育時(shí)間16～24 h。（5）結(jié)果判讀：用游標(biāo)卡尺（精確度為1 mm）測(cè)量抑菌環(huán)直徑，以肉眼不能明顯見到菌落生長(zhǎng)區(qū)域?yàn)橐志h(huán)邊緣，根據(jù)測(cè)得的抑菌環(huán)直徑大小來(lái)判斷該菌株對(duì)相應(yīng)抗生素的敏感性，結(jié)果根據(jù)美國(guó)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI2017版所提供的肺炎克雷伯菌的抑菌環(huán)直徑解釋判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將收集的數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel表格進(jìn)行整理，計(jì)算構(gòu)成百分比。然后采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算χ2值及P值，進(jìn)行差異性分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯類抗生素耐藥與敏感菌株耐藥性

圖1、表1顯示血流感染CRKP的分離率為26.70%（55/206），CSKP分離率為73.30%（151/206）。碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對(duì)以下21種抗生素的耐藥率均大于敏感株，有顯著性差異（P＜0.05）。相比之下，CRKP對(duì)氨基糖苷類抗生素阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素耐藥率較低，分別為52.73%、67.27%、70.91%。

圖1 CRKP和CSKP對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率柱狀圖示

表1 2017-2018年血液分離CRKP和CSKP對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性 例%

2.2 耐藥性分析

從圖2可以看出除頭孢曲松外，血流感染肺炎克雷伯菌對(duì)其它20種抗生素耐藥率2018年比2017年均有所降低。

圖2 2017、2018年血液分離肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率（%）柱狀圖示

表2、圖2中的206株肺炎克雷伯菌藥敏分析結(jié)果顯示：2017年、2018年該菌對(duì)哌拉西林的耐藥率最高，2017年為66.98%、2018年為61%；對(duì)氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率表現(xiàn)為最低，2017年為18.87%、2018年為13.00%；在對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的敏感性方面，該菌對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的敏感度要優(yōu)于氨芐西林/舒巴坦和替卡西林/棒酸。2017年頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為32.08%，哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率為34.90%，氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為42.45%，替卡西林/棒酸的耐藥率為44.34%，2018年頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均為29.00%，氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為40.00%，替卡西林/棒酸的耐藥率為39.00%。對(duì)比2017年和2018年，該菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢西丁和妥布霉素、慶大霉素的耐藥率有顯著性差異，此五種抗生素的耐藥率2018年較2017年有所降低，對(duì)其余16種抗生素的耐藥率均無(wú)顯著性差異。

2.3 血流感染肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素耐藥與敏感的生存分析

206株血流感染肺炎克雷伯菌28天的總死亡率為20.39%（42例），碳青霉烯類耐藥組的死亡率為50.90%（28例），而碳青霉烯類抗生素敏感組的死亡率為9.27%（14例），統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示血流感染肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素耐藥組患者28天死亡率明顯高于碳青霉烯類抗生素敏感組患者，P＜0.05，有顯著性差異，見圖3。

圖3 感染CRKP和CSKP患者的生存曲線分析

3 討論

鑒于肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林天然耐藥，以及替加環(huán)素的使用說(shuō)明，替加環(huán)素主要是用于呼吸系統(tǒng)的感染，不適于血流感染，故本研究未做氨芐西林和替加環(huán)素的藥敏實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢西丁的耐藥率較其他頭孢菌素類抗生素耐藥率低，2017年為36.79%，2018年為28%。對(duì)碳青霉烯類抗生素、氨基糖苷類抗生素阿米卡星保持較低的耐藥率。這與文獻(xiàn)報(bào)道的國(guó)內(nèi)其他地區(qū)檢測(cè)的肺炎克雷伯菌的耐藥性結(jié)果基本一致［3-7］。在對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的敏感性方面，該菌對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的敏感度要優(yōu)于氨芐西林/舒巴坦和替卡西林/棒酸。從圖2柱狀圖可以直觀看出該菌株對(duì)上述20種抗生素的耐藥率2018年較2017年均有所降低，分析原因，醫(yī)院的檢驗(yàn)科對(duì)患者的耐藥情況進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，并及時(shí)與院感科和臨床進(jìn)行反饋溝通。院感科嚴(yán)格進(jìn)行院內(nèi)感染的監(jiān)測(cè)，控制感染，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)臨床醫(yī)生抗生素合理使用的培訓(xùn)。臨床醫(yī)生在治療過(guò)程中對(duì)抗生素使用更加慎重，摒棄了以往濫用的行為，取而代之的是積極治療患者原發(fā)疾病，盡可能減少侵襲性操作，在必要的侵襲性操作過(guò)程中，盡量降低感染風(fēng)險(xiǎn)?；颊咴卺t(yī)生的宣教下，通過(guò)飲食、鍛煉、合理規(guī)律的作息來(lái)不斷提高自身免疫力，同時(shí)積極配合醫(yī)生的治療，陪護(hù)人員也能注意手衛(wèi)生。本研究?jī)H選擇了近兩年符合條件的樣本，后期將繼續(xù)跟蹤，加大樣本量進(jìn)行耐藥特征相關(guān)性試驗(yàn)，探索耐藥率降低的具體原因，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說(shuō)明本地區(qū)血流感染肺炎克雷伯菌的耐藥情況得到了有效的控制。

表2 2017-2018年血液分離肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性分析 例%

本實(shí)驗(yàn)從大連地區(qū)206例血流感染肺炎克雷伯菌中分離出耐碳青霉烯類抗生素菌株共55株，百分率為26.70%（55/206），這與國(guó)內(nèi)研究結(jié)果基本一致［8］。研究結(jié)果表明，CRKP對(duì)氨基糖苷類抗生素阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素耐藥率相對(duì)較低，分別為52.73%、67.27%、70.91%，臨床上對(duì)于CRKP建議采取聯(lián)合用藥，增強(qiáng)藥物間潛在的協(xié)同作用，減緩耐藥性，降低不良反應(yīng)。

CRKP對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpC酶或ESBLs、外膜蛋白的缺失、高表達(dá)的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)，其中產(chǎn)生碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類藥物的主要耐藥機(jī)制，故以后的研究將補(bǔ)充耐藥基因?qū)嶒?yàn)。本實(shí)驗(yàn)僅選取了2017年和2018年兩年的研究數(shù)據(jù)，日后會(huì)持續(xù)研究，擴(kuò)大樣本量，全面了解本地區(qū)耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐藥趨勢(shì)與特征，完善實(shí)驗(yàn)結(jié)果。