袁明,高夢蝶,王璞,劉長青,陶兆林

氟尿嘧啶—大豆素拼合物的設計、合成及抗腫瘤活性研究

袁明,高夢蝶,王璞,劉長青,陶兆林

(蚌埠醫(yī)學院 公共基礎學院,安徽 蚌埠, 233030)

設計合成氟尿嘧啶—大豆素拼合物, 并考察其對HepG2細胞增殖抑制活性。以氟尿嘧啶為先導物, 與氯乙酸反應制得5-氟脲嘧啶-1-基乙酸, 再與大豆素成酯反應制備氟尿嘧啶—大豆素拼合物, 采用MTT法測定氟尿嘧啶—大豆素拼合物HepG2細胞增殖抑制活性。結(jié)果表明: 氟尿嘧啶—大豆素拼合物抑制HepG2細胞增殖的IC50值為0.331 mM。氟尿嘧啶—大豆素拼合物在體外能明顯抑制HepG2細胞增殖。

氟尿嘧啶; 大豆素; 拼合物; 細胞增殖; 抑制活性

我國中藥資源豐富, 中藥活性小分子也具有較好的抗腫瘤活性, 目前已經(jīng)獲得臨床認可的有紫杉醇、長春堿以及長春新堿等小分子。已有文獻報道, 中藥活性小分子異黃酮類化合物具有顯著的抗腫瘤活性[1–3]。中藥小分子大豆素(Daidzein, 如圖1)屬異黃酮類化合物, 與具有抗腫瘤活性的染料木素同樣主要來自于豆科植物, 如大豆、綠豆以及中藥材葛根中。腫瘤壞死因子已被證實參與到腫瘤細胞的遷移和侵襲過程, 研究發(fā)現(xiàn)人乳腺癌細胞侵襲是由于基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)中兩個亞型MMP-2、MMP-9活性增強, 而腫瘤壞死因子α通過Hh/Gli1 信號通路誘導MMP-9過表達和活性增強, 大豆素可顯著抑制MMP-9過表達, 從而抑制腫瘤細胞的侵襲[4]。另有研究顯示大豆苷元可誘導腫瘤細胞凋亡, 有研究發(fā)現(xiàn)3'-大豆苷元磺酸鈉對人乳腺癌細胞MCF-7有促凋亡作用; Choi等研究得出大豆苷元促進人類乳腺癌細胞凋亡可能與ERα/C-erbB-2表達有關(guān), 本研究發(fā)現(xiàn)大豆苷元可通過調(diào)節(jié)大鼠乳腺癌細胞因子的表達水平, 從而抑制乳腺腫瘤的細胞增值[5–7]。

圖1 大豆素(Daidzein)結(jié)構(gòu)

氟尿嘧啶(5-Fluorouracil, 如圖2)是第一代抗代謝藥, 于上世紀五十年代末問世。其對胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌等具有較好的療效, 在腫瘤治療中起著至關(guān)重要的作用。此藥臨床應用雖然廣泛, 但是存在較為嚴重的副作用, 如消化道反應、肝功能損害、骨髓抑制等[8–9]。近年來藥物化學家對其進行了結(jié)構(gòu)改造, 得到了替加氟[10](Ftorafur, 如圖2)、卡培他濱[11](Capecitabine, 如圖2)等氟尿嘧啶衍生物, 二者在治療效率方面明顯高于氟尿嘧啶, 且毒性明顯低于氟尿嘧啶。

圖2 氟尿嘧啶、替加氟和卡培他濱(5-Fluorouracil, Ftorafur, Capecitabine)結(jié)構(gòu)

基于氟尿嘧啶與中藥小分子異黃酮類化合物具有較強的抗腫瘤活性, 本文運用前藥原理將的中藥小分子大豆素與氟尿嘧啶衍生物進行成酯拼合(如圖3), 得到氟尿嘧啶大豆素拼合物(DDS-F), 以期改善二者生物利用度、提高活性以及降低不良反應。

圖3 氟尿嘧啶—大豆素拼合物(DDS-F)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian Unity INOVA-300 NMR譜儀用于測試1H和13C NMR, 其工作頻率分為300 MHz和75 MHz((DMSO-為溶劑, TMS為內(nèi)標); 細胞培養(yǎng)箱, 型號3111, Thermo Electron Corporation; 超凈臺, 型號SW-CJ-IF, 蘇州凈化設備有限公司; 酶標儀, 型號Varioskan Flash, Thermo Scientific。

大豆素(國藥集團化學試劑有限公司, 純度>98% ); 5-氟脲嘧啶(阿拉丁試劑上海有限公司, 純度>99%, 合成原料); 氯乙酸(天津市光復精細化工研究所, 純度>99.5%); 二氯亞砜(DMAP, 國藥集團化學試劑有限公司, 純度>99%); DMEM培養(yǎng)基, 批號: 1913063, Gibco公司; 胎牛血清, 批號: 18040302, 杭州四季青生物科技有限公司; 胰蛋白酶, 批號: 1C221C22, Sunshine公司; MTT, 批號: 331097/1594, Fluka公司; 5-氟尿嘧啶(5-fu, 用于活性測試), 批號: HR1170629, 上海思域化工科技有限公司。

1.2 合成部分

5-氟脲嘧啶-1-基乙酸(1)的合成分別取3 g(53.5 mmol)氫氧化鉀, 30 mL水于100 mL 3口燒瓶中, 溶解后加入5.0 g (38.4 mmol)5-氟脲嘧啶, 100 ℃攪拌反應3 h后, 緩慢加入15 mL氯乙酸(3.6 g, 38 mmol) 水溶液, 60 ℃攪拌反應8 h。用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應液pH約為2, 冰浴保持4 h, 過濾得粗品, 將粗品溶于飽和碳酸氫鈉溶液, 再用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH約為2, 過濾干燥得到白色晶體(1)3.05 g, 產(chǎn)率42.3%[12]。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 13.23(s, 1 H), 11.92(s, 1 H) , 8.08(s, 1 H), 4.36(s, 2 H);13C-NMR(75 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 169.75, 158.08, 150.11, 141.27, 131.21, 49.08。

氟尿嘧啶-大豆素拼合物(DDS-F)的合成取化合物(1)2.0 g(10.6 mmol)溶解在新蒸的二氯亞砜(15 mL)中, 氮氣氛圍下70 ℃反應12 h后, 將過量二氯亞砜減壓旋蒸除去, 殘余物溶解在干燥的四氫呋喃(15 mL)中, 在冰浴條件下, 向溶解有1.3 g (5.3 mmol)大豆素、1 mL三乙胺的四氫呋喃溶液里緩慢滴加, 滴加完畢室溫反應10 h, 將反應液蒸干, 將反應液用硅藻土過濾, 濾液旋干得到的粗品用石油醚/二氯甲烷重結(jié)晶, 得到白色固體(DDS-F)0.7 g, 收率22.3%[13]。1H-NMR( 400 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 12.01(s, 2 H), 8.62(s, 1 H) , 8.24(m, 3 H), 7.68(m, 3 H), 7.37(d,= 4Hz, 1 H), 7.26(d,= 8Hz, 2 H), 4.85(s, 2 H), 4.80(s, 2 H);13C-NMR(75 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 174.94, 167.40, 166.93, 163.23, 157.78, 156.57, 155.62, 154.29, 150.19, 130.87, 130.77, 130.71, 130.53, 127.87, 123.72, 122.47, 121.74, 121.62, 120.29, 111.71, 49.3。

1.3 體外抗HepG2細胞增殖活性研究

1.3.1 方法

生長良好的HepG2細胞, 無菌條件下移入細胞培養(yǎng)瓶中, 加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)基置于通有5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HepG2細胞, 消化成單細胞懸液, 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸, 接種于96孔板中(5×103cells/well)。細胞貼壁后, 分為正常組, 藥物組(200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 μM), 培養(yǎng)48 h后, 棄上清, 每孔加入0.5 g/L MTT溶液200 μL共培養(yǎng)4 h后, 加入150 μL DMSO, 震蕩10 min, 使結(jié)晶物充分溶解, 用酶標儀于490 nm處測定吸光度, 每次3復孔, 實驗重復3次。

細胞存活率(%)=藥物組(OD490)/正常組(OD490)′100%; 藥物抑制率(%)=100%-細胞存活率(%)。

1.3.2 統(tǒng)計學處理

表1 5-fu對HepG2細胞活力的影響

注: *P < 0.05, **P < 0.01vs正常組。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗結(jié)果

本文通過兩步法合成DDS-F, 并通過1H-NMR、13C-NMR對其結(jié)構(gòu)進行表征; 同時應用MTT法測試DDS-F對HepG2 細胞增殖的抑制作用, 結(jié)果見表1和表2。

2.2 討論

5-氟脲嘧啶-1-基乙酸合成, 待氟尿嘧啶完全溶解于后再加入氯乙酸, 加入后待反應液澄清后, 繼續(xù)維持反應8 h, 確保反應收率最大。后處理時, 加濃鹽酸須緩慢滴加, 以防產(chǎn)品損失在水溶液中。制備DDS-F, 注意5-氟尿嘧啶-1-基乙酰氯制備須在氮氣氛圍中進行。

表2 DDS-F對HepG2細胞活力的影響

注: *P < 0.05, **P < 0.01vs正常組。

3 結(jié)論

本文以氟尿嘧啶為先導物, 運用藥物化學中拼合原理, 將具有抗腫瘤活性中藥小分子大豆素與氟尿嘧啶進行拼接, 獲得化合物DDS-F, 結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR、13C-NMR表征。MTT實驗以氟尿嘧啶為陽性對照, 測得化合物DDS-F抑制HepG2細胞增殖的IC50值為0.331 mM, 數(shù)據(jù)顯示其在體外能明顯抑制HepG2細胞增殖。

有文獻報道, 大豆素對乳腺癌和結(jié)腸癌細胞細胞增殖有明顯抑制作用, 后續(xù)將對這兩種細胞系的抑制作用做研究。以及考察大豆素結(jié)構(gòu)中不同位置羥基成酯后的體外增殖抑制活性研究。

[1] Kohen F, Gayer B, Kulik T, et al. Synthesis and evaluation of the antiproliferative activities of derivatives of carboxyalkyl isoflavones linked to N-t-Boc-hexylenediamine [J]. J. Med. Chem. 2007, 50, 6 405–6 410.

[2] Yang YY, Tsai TH. Enterohepatic circulation and pharmacokinetics of genistin and genistein in rats [J]. ACS Omega,2019, 4(19): 18 428–18 433.

[3] Guo JM, Yan G, Zhang MM, et al. Anti-inflammatory and antiproliferative prenylated isoflavone derivatives from the fruits of ficus carica [J]. J. Agric. Food Chem.,2019, 67(17): 4 817–4 823.

[4] Bao C, Namgung H, Lee J, et al. Daidzein suppresses tumor necrosis factor-α induced migration and invasion by inhibiting Hedgehog/Gli1 signaling in human breast cancer cells [J]. J. Agric. Food Chem., 2014, 62(17): 3 759–3 767.

[5] 康欣梅, 王慧, 王麗, 等. 大豆苷元對乳腺癌生長和血管生成的影響[J]. 癌變·畸變·突變, 2015, 27(1): 16–20.

[6] Jiang Q, Payton-Stewart F, Elliott S, et al. Effects of 7-O substitutions on estrogenic and anti-estrogenic activities of daidzein analogues in MCF-7 breast cancer cells [J]. J. Med. Chem., 2010, 53, 6 153–6 163.

[7] Leclercqa G, Jacquot Y. Interactions of isoflavones and other plant derived estrogens with estrogen receptors for prevention and treatment of breast cancer-Considerations concerning related efficacy and safety [J]. J. Steroid. Biochem. 2014, 139, 237–244.

[8] Kline CLB, Schiccitano A, Zhu JJ, et al. Personalized dosing via pharmacokinetic monitoring of 5-fluorouracil might reduce toxicity in early- or late-stage colorectal cancer patients treated with infusional 5–fluorouracil-based chemotherapy regimens [J]. Clin Color Cancer, 2013, 13(2): 119–126.

[9] 王衛(wèi)東. 5-氟尿嘧啶類抗癌藥物的分子修飾研究進展[J]. 藥學進展, 2008, 32(12): 536–542.

[10] 李勇, 陳思現(xiàn), 黃瑞文, 等. 草酸鉑及亞葉酸鈣分別聯(lián)合替加氟或氟尿嘧啶治療晚期胃癌療效比較[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志, 2006, 8(11): 50–52.

[11] 姜振宇, 荊蕾, 許穎, 等. 奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶或卡培他濱治療老年晚期結(jié)腸癌的效果評價[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版), 2009, 35(6): 1 151–1 153.

[12] Sauraj, Kumar SU, Gopinath P, et al. Synthesis and bio-evaluation of xylan-5-fluorouracil-1-acetic acid conjugates as prodrugs for colon cancer treatment [J]. Carbohydr. Polym. 2017, 157, 1 442–1 450.

[13] Giret S, Thron C, Gallud A, et al. A designed 5-fluorouracil-based bridged silsesquioxane as an autonomous acid-triggered drug-delivery system [J]. Chem. Eur. J., 2013, 19, 12 806–12 814.

Design, synthesis and antitumor activity of Fluorouracil-Daidzein conjugates

Yuan Ming, Gao Mengdie, Wang Pu, Liu Changqing, Tao Zhaolin

(School of Fundamental Sciences, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China)

5-Fluorouracil-Daidzein conjugates is designed and synthesized, and its inhibitory activity on HepG2 cell proliferation is investigated. 5-fluorouracil-1-glycolic acid is prepared by reaction of fluorouracil, which is a lead compound, with chloroacetic acid, and then the 5-Fluorouracil-Daidzein conjugate is synthesized by ester reaction with daidzein. The proliferation inhibition activity of 5-Fluorouracil-Daidzein conjugates on HepG2 cells is determined by MTT method. 5-Fluorouracil-Daidzein conjugates inhibits HepG2 cell proliferation with an IC50of 0.331 mM.5-Fluorouracil-Daidzein conjugates can significantly inhibit HepG2 cell proliferation in vitro.

5-fluorouracil; daidzein; conjugates; cell proliferation; inhibitory activity

10.3969/j.issn.1672–6146.2021.01.012

R 914.2

A

1672–6146(2021)01–0058–03

陶兆林, 1158374617@qq.com。

2020–4–28

安徽省教育廳重點項目(KJ2018A0222); 蚌埠醫(yī)學院自然科學基金項目(BYKY1751)。

(責任編校: 郭冬生)