桂 崢, 于晶峰, 木 蘭

（1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

立克次體（Rickettsia sp）是專性胞內(nèi)革蘭陰性菌，根據(jù)立克次體的系統(tǒng)發(fā)育，將所有的立克次體劃分為4 個(gè)群： 貝氏立克次體群（Rickettsia burnetii）、 加 拿 大 立 克 次 體 群 （Rickettsia canadensis）、斑點(diǎn)熱群（spotted fever group）和斑疹傷寒群（typhus group），其中斑點(diǎn)熱群立克次體（spotted fever grouprickettsia，SFGR）是由蜱維持和傳播的［1-2］，而草原革蜱（Dermacentor nuttalli）是攜帶SFGR 的主要媒介［3］。草原革蜱在中國北方、俄羅斯和蒙古國等國家和地區(qū)分布廣泛［4］，SFGR 感染可發(fā)生在世界各地，可能會(huì)給人類帶來嚴(yán)重疾病，中國已報(bào)道SFGR 包括黑龍江立克次體（Rickettsia heilongjiang）、勞氏立克次體（Rickettsia raoultii）、斯洛瓦卡立克次體（Rickettsia slova）、艾氏立克次體（Rickettsia ehrlich）、西伯利亞立克次體 （Rickettsia sibirica） 和 馬 西 里 立 克 次 體（Rickettsia massiliae）［5］。2015 年在蒙古國的草原革 蜱 中 檢 測(cè) 出1 種SFGR （勞 氏 立 克 次 體）［6］，2018 年在新疆地區(qū)從草原革蜱中分離出3 種SFGR（西伯利亞立克次體、勞氏立克次體和斯洛瓦卡立克次體）［7］，而2016 年在內(nèi)蒙古西部的草原革蜱中只分離出勞氏立克次體［8］。對(duì)SFGR 的基因型分布情況目前鮮有報(bào)道。本研究采用PCR 法對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)部分地區(qū)草原革蜱進(jìn)行SFGR DNA 檢測(cè)，并對(duì)gltA 和ompA 基因進(jìn)行立克次體同源性分析，以期闡明內(nèi)蒙古自治區(qū)部分地區(qū)草原革蜱攜帶SFGR 的基因型分布特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集于2019 年4 月中旬在內(nèi)蒙古自治區(qū)西部的鄂爾多斯市鄂托克旗前旗成川鎮(zhèn)、中部的呼和浩特市四子王旗牧場(chǎng)和東部的赤峰市阿魯科爾沁旗天山鎮(zhèn)巴彥溫都蘇木地區(qū)，通過普查從708 只綿羊體表采集蜱264 只，使用鑷子和橡膠手套從綿羊體表采集蜱，每只放在一個(gè)收集瓶中，收集回來的蜱進(jìn)行蜱種的鑒定并將捕獲蜱保存在－80℃冰箱中。

1.2 主要試劑和儀器血液組織DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit，天根生化有限公司），Invitrogen 瓊脂糖（美國Thermo Fisher Scientific 公司），2×San TaqPCRMix （Dye）［生工生物工程（上海） 股份有限公司］，DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa 公司），GoldViewⅠ型核酸染色劑（北京Solarbio 科技有限公司）。Gene Company Limited PCR 擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司），凝膠成像系統(tǒng)ChampGel5000（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

1.3 提取蜱蟲DNA將采集的蜱標(biāo)本浸泡在75%的酒精溶液中，5 min 后將浸泡標(biāo)本放在無菌濾紙上，吸干后用生理鹽水清洗3 遍，再用無菌濾紙充分吸干，將放至無菌的EP 管內(nèi)，取EP 管內(nèi)單只蜱蟲于研缽中，倒入適量液氮以冷凍蜱蟲，1～2 min 后將蜱蟲用杵頭碾碎成粉末狀，之后參考血液組織DNA 提取說明書從每個(gè)粉碎的蜱粉中提取DNA，－20℃保存，以備后續(xù)檢測(cè)。

1.4 PCR 擴(kuò)增為了檢測(cè)立克次體的存在，首先，PCR 擴(kuò)增立克次體16s RNA 作為初篩試實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)一步檢測(cè)部分陽性樣本的gltA 基因和ompA 基因，3 個(gè)目的基因的引物均由Primer5 軟件設(shè)計(jì)并在生工生物工程（上海） 股份有限公司合成（表1），PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后在瓊脂糖凝膠儀紫外燈照射下觀察結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)均以無菌蒸餾水為陰性對(duì)照，以避免樣本污染而造成假陽性。

表1 PCR 引物序列和擴(kuò)增條件Tab.1 Sequences of PCR primers and amplification conditions

1.5 序列測(cè)定和分析將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司北京銷售分公司進(jìn)行單向測(cè)序和測(cè)通，采用Seqman 軟件將所得序列進(jìn)行拼接，登錄美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 網(wǎng)站，利用BLAST 工具將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中注冊(cè)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)［9］；使用DNAman 7.0軟件程序進(jìn)行多序列比對(duì)和序列相似性計(jì)算；利用MEGA7 軟件鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過1 000 個(gè)Bootstrap 重復(fù)來評(píng)估樹的穩(wěn)定性［10］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3 個(gè)采樣地區(qū)所檢出的SFGR 陽性率以百分率（%） 表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蜱種的形態(tài)學(xué)鑒定鄧國藩在《中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志》中描述的蜱標(biāo)準(zhǔn)分類特征：草原革蜱假頭短，背部琺瑯彩明顯，基突短，盾板大，氣門板橢圓形，背突短（圖1）?；谏鲜鎏攸c(diǎn)對(duì)所有成蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果顯示全部為草原革蜱。

2.2 SFGR 的檢測(cè)結(jié)果在264 只蜱中，經(jīng)過16sRNA 初篩共檢出SFGR 陽性蜱218 只，陽性率為82.57%（218/264），其中鄂爾多斯地區(qū)15 只蜱中SFGR 陽性11 只，陽性率為73.33% （11/15）；四子王旗地區(qū)30 只蜱中SFGR 陽性22 只，陽性率為73.33% （22/30）；赤峰地區(qū)219 只蜱中SFGR陽性185 只，陽性率為84.47%（185/219）。3 個(gè)地區(qū)蜱SFGR 陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.221，P=0.20）。從每個(gè)地區(qū)陽性樣本中隨機(jī)選取10 個(gè)，共30 個(gè)陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增出7 個(gè)SFGR gltA 基因陽性樣本和14 個(gè)SFGR ompA 基因陽性樣本。見圖2。

圖1 草原革蜱形態(tài)學(xué)鑒定圖Fig.1 Morphological identification picture of Dermacentor nuttalli

2.3 序列分析對(duì)SFGR 陽性樣本進(jìn)行測(cè)序，成功測(cè)序14 個(gè)SFGR ompA 陽性樣本，7 個(gè)SFGR gltA 陽性樣本，gltA 和ompA 在GenBank 注冊(cè)的序列號(hào)均已顯示在進(jìn)化樹上（圖3 和4），本研究中檢測(cè)到的物種序列由幾何形狀表示，然后再對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行剪切、拼接和校對(duì)處理。以DNAman 7.0 軟件對(duì)處理后的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的立克次體序列相似性較高，gltA 基因和ompA 基因的相似度分別為100.00% 及99.86%；所得序列與GenBank 中注冊(cè)的勞氏立克次體相似度最高，同源性均為100%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示：所檢出的序列與勞氏立克次體在一個(gè)分支上。gltA 的進(jìn)化樹結(jié)果顯示內(nèi)蒙古地區(qū)的立克次體與烏拉爾立克次體（Candidatus Rickettsia uralica）、帕克立克次體（Rickettsia parkeri）和西伯利亞立克次體（Rickettsia sibirica） 同屬一支，親緣較近，同 源 性 分 別 為 99.59%、 99.54% 和 99.54%（圖3）。ompA 的進(jìn)化樹結(jié)果顯示：內(nèi)蒙古地區(qū)的立克次體與馬賽立克次體和扇頭蜱立克次體（Rickettsia rhipicephali）同屬一支，親緣接近，同源性分別為97.73%和98.15%（圖4）。

圖2 部分蜱樣本PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR amplification products of some tick samples

圖3 立克次體gltA 測(cè)序結(jié)果構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on sequencing results of Rickettsia gltA

3 討 論

圖4 立克次體ompA 測(cè)序結(jié)果構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on sequencing results of Rickettsia ompA

分子生物學(xué)方法為物種基因型的鑒定提供了極大的幫助，特別是在細(xì)菌分類中的應(yīng)用，對(duì)于SFGR 來說，16sRNA 由于存在幾乎所有原核生物都相同的保守區(qū)，可以準(zhǔn)確鑒定斑點(diǎn)熱群立克次體的存在，但很難區(qū)分SFGR 的種屬。gltA 和ompA基 因 可 以 用 于SFGR 的 種 屬 鑒 定［11］：gltA 基 因 編碼檸檬酸合酶，檸檬酸合酶的序列具有種屬特異性，進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的立克次體之間有明顯差異［12］；ompA 是外膜蛋白基因，由于5′ 端具有高度特異性，因此可作為SFGR 的種屬鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”［11］。本研究結(jié)果顯示：gltA 基因序列與中國分離出的西伯利亞立克次體親緣關(guān)系較近，同源性為99.5%；ompA 基因序列與西伯利亞立克次體親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，同源性為95.17%。馮立等［13］基于ompA 基因序列比較，結(jié)果與勞氏立克次體同屬一支，而gltA 基因序列結(jié)果顯示其與勞氏立克次體親緣關(guān)系接近但并非同一只。說明2 種基因?qū)α⒖舜误w亞種進(jìn)行鑒定的結(jié)果存在差異，原因可能是地理?xiàng)l件和宿主生物行為的差異，還有可能是gltA和ompA 基因的進(jìn)化速度不同所致，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此為了能準(zhǔn)確對(duì)亞種進(jìn)行分類，不能單獨(dú)依靠某一種基因，而是利用多種基因?qū)ξ锓N進(jìn)行鑒定和分類。

內(nèi)蒙古地區(qū)地域遼闊，與周邊的8 個(gè)省區(qū)有地緣連通，北與蒙古國和俄羅斯接壤，因此有利于蜱種的遷移和蜱傳疾病的擴(kuò)散［14］。通過對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)草原革蜱攜帶SFGR 的情況來看，感染率高達(dá)82.57%，說明該地區(qū)存在蜱傳立克次體的自然疫源地。同源性比較和序列分析結(jié)果表明：gltA 基因序列與勞氏立克次體（KY474576.1） 同源性達(dá)100%，ompA 基因序列與勞氏立克次體（AH015610.2）同源性達(dá)100%，兩者均與蒙納克立克次體（Rickettsia monacensis）差異較大。勞氏立克次體（KY474576.1）是從北京地區(qū)病例中檢測(cè)出來的基因型，而另一種勞氏立克次體（AH015610.2）是從俄羅斯的森林革蜱中檢測(cè)出的基因型，上述2 個(gè)地區(qū)與內(nèi)蒙古地區(qū)均屬于中國北部，有著相似的地理環(huán)境和種群分布特點(diǎn)，可以推測(cè)內(nèi)蒙古地區(qū)的立克次體與勞氏立克次體（KY474576.1） 和勞氏立克次體（AH015610.2）屬于同一個(gè)基因型。內(nèi)蒙古東部（赤峰地區(qū)）、西部（鄂爾多斯地區(qū)）和中部（四子王旗地區(qū)）地區(qū)的草原革蜱攜帶SFGR 的基因型分布情況結(jié)果表明：內(nèi)蒙古草原革蜱中分離的SFGR 只有一種，即勞氏立克次體，該種類的立克次體廣泛分布于國內(nèi)外很多地區(qū)，如俄羅斯［15］、哈薩克斯坦［16］及中國的江蘇、江西［17］、云南［4］和黑龍江［18］等。近年來有關(guān)勞氏立克次體感染的報(bào)道也越來越多［19］，2014 年在內(nèi)蒙古奇乾地區(qū)的森林革蜱中檢出勞氏立克次體的陽性率為50.00%，在全溝硬蜱中檢測(cè)勞氏立克次體的陽性率為2.05%［20］，提示革蜱中勞氏立克次體的攜帶率高于其他蜱。本次調(diào)查未檢測(cè)出西伯利亞立克次體，與FAN 等［21］報(bào)道不一致，可能與采集地區(qū)、媒介蜱種類、樣本量以及立克次體在蜱體內(nèi)的遺傳變異情況等有關(guān)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大調(diào)查地區(qū)和增加媒介蜱的種類來完善蜱傳立克次體的研究。本次研究結(jié)果豐富了內(nèi)蒙古地區(qū)的草原革蜱攜帶SFGR 的數(shù)據(jù)，同時(shí)也完善了研究者對(duì)蜱攜帶SFGR 基因型的認(rèn)識(shí)。