趙鴻遠(yuǎn) 王朝 成溫玉 馬寧寧 李曼 魏小麗

（1.安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，安康 725000；2.安康市畜牧獸醫(yī)中心，安康 725000）

豬是人類(lèi)攝取高質(zhì)量蛋白質(zhì)和肉品最為重要的來(lái)源。由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的非洲豬瘟是一種急性、熱性、廣泛出血性的高度接觸傳染性疾病，對(duì)家豬和歐洲野豬的致死率可達(dá)100%［1］，嚴(yán)重危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給多國(guó)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的影響。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將ASF列為必須上報(bào)的動(dòng)物疾病，我國(guó)將其歸為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。自20世紀(jì)初期于肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)ASF以來(lái)，經(jīng)由非洲傳播至歐洲地區(qū)，隨后在歐洲等國(guó)采取一系列強(qiáng)硬措施后根除了該病。然而在2007年格魯吉亞暴發(fā)ASF后并再次迅速殃及俄羅斯、烏克蘭、波蘭、立陶宛等多個(gè)歐洲國(guó)家。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅2014-2017年俄羅斯和東歐等國(guó)因ASFV感染就撲殺了80多萬(wàn)頭豬，造成多達(dá)數(shù)億歐元的經(jīng)濟(jì)損失［1］。2018年8月沈陽(yáng)一豬場(chǎng)爆發(fā)我國(guó)首例ASF疫情，隨后便席卷全國(guó)多個(gè)省、市、自治區(qū)，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了重創(chuàng)。

ASFV是一種蜱傳性的雙鏈DNA病毒，曾先后被劃分為虹彩病毒科和痘病毒科，最終因其結(jié)構(gòu)和基因序列的差異被國(guó)際病毒學(xué)分類(lèi)委員會(huì)列為非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）［2］。盡管ASFV被發(fā)現(xiàn)已有近百年的歷史，但目前尚無(wú)商品化的疫苗和經(jīng)濟(jì)有效的抗病毒藥物，豬群一旦感染只能依靠快速撲殺進(jìn)行防控。作為我國(guó)當(dāng)前豬群中最重要的烈性傳染病，ASF的防控主要以“早、快、嚴(yán)、小”為特征的處置方式進(jìn)行，也是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)對(duì)ASF疫情行之有效的措施。本文對(duì)抗非洲豬瘟病毒制劑的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，以便為抗非洲豬瘟藥物的創(chuàng)制和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)及重要參考。

1 ASFV簡(jiǎn)介

ASFV是具有囊膜的雙鏈DNA病毒，包含170-193 Kb的線性基因組，共編碼150-200個(gè)蛋白，屬于核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒。ASFV病毒粒子從內(nèi)至外由基因組、核心殼、內(nèi)膜、衣殼和囊膜等構(gòu)成了正二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，直徑大小約為200 nm。該病毒具備嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，主要在單核-巨噬細(xì)胞中完成復(fù)制［2］。因此，早期在分離培養(yǎng)病毒時(shí)只能依靠來(lái)源于外周血的單核-巨噬細(xì)胞原代細(xì)胞進(jìn)行，后來(lái)通過(guò)不斷馴化，個(gè)別毒株能夠在非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero、COS-7和CV-1）上進(jìn)行增殖［3］。然而這些細(xì)胞系不能反映靶動(dòng)物對(duì)ASFV的應(yīng)答機(jī)制，因此學(xué)者建立了豬肺泡巨噬細(xì)胞源的永生化豬肺泡巨噬細(xì)胞（immortalized porcine alveolar macrophages，IPAM）和野豬肺細(xì)胞（wild swine lung cells，WSL），并被廣泛用于ASFV的研究中［4］。此外，2020年，Portugal等［5］建立了一株源于豬胎兒肺臟的細(xì)胞系ZMAC-4（Zuckermann macrophage-4），可促進(jìn)多個(gè)ASFV分離株進(jìn)行體外增殖。

ASFV在侵入靶細(xì)胞的（單核-巨噬細(xì)胞）過(guò)程中通過(guò)受體依賴(lài)的調(diào)節(jié)模式和非受體依賴(lài)的兩大類(lèi)模式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［6］。在以受體依賴(lài)的調(diào)節(jié)模式侵入細(xì)胞時(shí)，病毒粒子可與宿主細(xì)胞表面多個(gè)受體（如CD163、CD45、MHC II和Fc等）結(jié)合，通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被包裹到內(nèi)體中并進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)［6］。內(nèi)體中的酸性環(huán)境使得病毒粒子發(fā)生構(gòu)象變化，促使病毒粒子脫殼丟失衣殼和囊膜結(jié)構(gòu)。脫殼后的病毒粒子進(jìn)一步將其內(nèi)膜結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)體膜進(jìn)行融合，釋放出核心殼至細(xì)胞質(zhì)中。在借助宿主蛋白合成系統(tǒng)的情況下，ASFV迅速在宿主細(xì)胞核附近建立“病毒工廠”并進(jìn)一步合成病毒組裝所需蛋白和基因組，同時(shí)合成的一些非結(jié)構(gòu)蛋白調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答。待“病毒工廠”中的病毒粒子裝配成熟后經(jīng)由病毒衣殼蛋白pE120R和驅(qū)動(dòng)蛋白依賴(lài)的微管調(diào)節(jié)機(jī)制，將病毒粒子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面完成出芽過(guò)程［6-7］。ASFV除了上述內(nèi)化入胞機(jī)制外，被發(fā)現(xiàn)其在Vero細(xì)胞中還可通過(guò)非受體依賴(lài)的巨胞飲（macropinocytosis）和直接吞噬的方式進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)［6-7］。另外，ASFV在感染宿主細(xì)胞的晚期會(huì)引發(fā)細(xì)胞裂解，這也成為其出芽的一種方式［6-7］。因此，ASFV具有復(fù)雜的增殖過(guò)程，目前對(duì)于其在宿主細(xì)胞中的復(fù)制過(guò)程認(rèn)識(shí)不全，尚需要進(jìn)行深入研究才能全面了解該病毒的增殖機(jī)制。

2 抗病毒制劑

2.1 干擾素

干擾素（interferon，IFN）是機(jī)體重要的細(xì)胞因子，具有廣泛的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)能力，能夠有效抑制病原微生物的復(fù)制。所有哺乳動(dòng)物都能表達(dá)IFNs，且根據(jù)其序列、結(jié)構(gòu)和功能的差異被劃分為 I型（IFN-α、β、ε、κ、τ、ω 和 σ）、II型（IFN-γ）和 III型（IFN-λ1、λ2 和 λ3）［8-9］。IFNs通過(guò)激活下游的JAK-STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量的抗病毒蛋白［8-9］。早前的感染研究表明，ASFV能誘導(dǎo)細(xì)胞和機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，該因子無(wú)論是對(duì)ASFV弱毒株還是強(qiáng)毒株都有顯著的抑制作用［10］。IFN-α也具有抗ASFV的活性，連續(xù)使用IFN-α處理ASFV感染的Vero細(xì)胞可以緩解病毒造成的細(xì)胞溶解以及降低病毒對(duì)細(xì)胞的持續(xù)感染。混合使用IFN-α和IFN-γ可以增強(qiáng)二者單獨(dú)使用時(shí)抗ASFV的能力，表明 IFN-α 和 IFN-γ具有協(xié)同抑制 ASFV 的功能［11］。Fan等［12］利用原核表達(dá)分別獲得豬源IFN-α和IFN-γ重組蛋白，在使用不同劑量蛋白處理ASFV感染的PAM細(xì)胞后，二者均表現(xiàn)出對(duì)ASFV復(fù)制過(guò)程的顯著抑制性，且也表現(xiàn)出協(xié)同作用。進(jìn)一步利用豬源IFN-α和IFN-γ混合蛋白處理ASFV感染的豬時(shí)，IFNs重組蛋白顯著降低了宿主體內(nèi)的病毒載量，且刺激機(jī)體產(chǎn)生了大量的ISGs。因此，重組的豬源IFN-α和IFN-γ具有緊急治療臨床上ASFV感染豬的潛能［12］。除了豬源IFNs具有抗ASFV感染的作用之外，人源IFNs也具備抑制ASFV在Vero和PAM細(xì)胞中復(fù)制的能力，表明IFNs具有廣譜的抗病毒效應(yīng)［10-11］。目前，尚無(wú)關(guān)于 IFN-β和IFN-λ等 IFNs對(duì)ASFV作用的研究，但這些IFNs對(duì)其他多種病毒的抑制作用暗示其也具有抗ASFV功能。

ISGs作為IFNs抗病毒的主要執(zhí)行分子，在IFNs刺激的PAM和豬體內(nèi)均顯著上調(diào)。黏液病毒抗性蛋白 A（myxovirus resistance protein A，MxA）是ISGs之一，屬于大分子GTP酶超家族的成員［9］。Netherton等［13］通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源MxA蛋白的Vero細(xì)胞證實(shí)，人源MxA顯著性地抑制ASFV的增殖，且與ASFV的小DNA結(jié)合蛋白pA104R相互作用共同定位于“病毒工廠”。同樣，豬的MxA同源性蛋白Mx1也表現(xiàn)出相似的結(jié)果，表明MxA具有廣譜的抗病毒活性［13］。除了Mx蛋白之外，干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白（interferon-inducing transmembrane proteins，IFITMs）也表現(xiàn)出對(duì) ASFV 的抑制能力［14］。穩(wěn)定表達(dá)人源IFITM1、IFITM2和IFITM3的Vero細(xì)胞明顯降低了ASFV的傳染性，其中IFITM2和IFITM3主要限制了病毒的侵入或者脫殼，其很可能與IFITM破壞了ASFV侵入時(shí)依賴(lài)的內(nèi)吞機(jī)制并造成膽固醇流失有關(guān)［14］。另外，膽固醇-25-羥化酶（cholesterol-25-hydroxylase，CH25H）也 屬 于 ISGs家族的成員，其催化形成的產(chǎn)物25-羥基膽固醇（25-hydroxycholesterol，25-HC）也具有廣泛的抗病毒能力。25-HC被證實(shí)具有抗ASFV的活性，其與氧化甾醇結(jié)合蛋白（oxysterol-binding protein，OSBP）具備高親和結(jié)合能力［15］。而OSBP是病毒構(gòu)建“病毒工廠”時(shí)脂質(zhì)交換的重要蛋白，25-HC與OSBP的結(jié)合阻礙了“病毒工廠”的形成，從而抑制了病毒的增殖［15］。除了上述ISGs之外，OASL、ISG15、PKR、GBP1、Viperin、BST2、IFR1和 CXCL10等ISGs在IFNs誘導(dǎo)的PAM中出現(xiàn)了顯著上調(diào)，同時(shí)在ASFV弱毒豬感染細(xì)胞中ISG15、PKR和BST2的表達(dá)也出現(xiàn)了明顯上調(diào)，意味著這些ISGs也可能參與了抗ASFV的應(yīng)答［12］，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

盡管上述IFNs和ISGs在抗ASFV感染中起到重要作用，然而病毒在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了一系列逃逸宿主免疫應(yīng)答以及拮抗IFNs抗病毒應(yīng)答的策略［16］。因此我們必須從宿主和病毒兩方面全面探究二者之間的相互作用，才能開(kāi)發(fā)出高效的抗病毒藥物。

2.2 抗生素

抗生素是一類(lèi)主要抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的次生代謝產(chǎn)物，而一部分抗生素也具有抗病毒的活性。利福平是一種廣譜的抗菌藥，同時(shí)也能靶向作用于痘苗病毒和巨細(xì)胞病毒的DNA依賴(lài)的RNA聚合酶阻礙病毒轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗病毒的功能［17］。同樣，利福平也能抑制ASFV的增殖，在不同處理劑量下能夠顯著降低感染ASFV細(xì)胞中的病毒滴度［10］。利福平抑制ASFV增殖的靶點(diǎn)也是病毒的DNA依賴(lài)的RNA聚合酶。一些利福平的衍生物也以同樣的方式發(fā)揮抗ASFV的功能［10］。II型拓?fù)洚悩?gòu)酶是ASFV復(fù)制的關(guān)鍵性蛋白，香豆霉素（coumermycin）A1作為細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的專(zhuān)型抑制劑，也能夠靶向抑制ASFV II型拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，從而阻礙病毒增殖［18-19］。此外，阿霉素（doxorubicin）、安吖啶（amsacrine）和氟喹諾酮類(lèi)藥物也可以靶向作用于ASFV的II型拓?fù)洚悩?gòu)酶，表現(xiàn)出對(duì)酶活較高的抑制性［18-19］。目前已經(jīng)篩選到30種氟喹諾酮類(lèi)藥物具有抗ASFV的活性，其中6種藥物能夠顯著降低ASFV感染Vero細(xì)胞引起的細(xì)胞病變，連續(xù)使用藥物可以清除Vero細(xì)胞中的病毒［20］。淺藍(lán)菌素（cerulenin）是由真菌藍(lán)色頭孢霉（Cephalosporium ceruleans）產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，屬于脂肪酸合酶的抑制劑。de León等［21］研究證實(shí)淺藍(lán)菌素在ASFV感染的早期具有抑制作用，其可能在病毒與細(xì)胞粘附過(guò)程中阻礙了膜之間融合發(fā)揮抗ASFV的功能。ASFV入侵細(xì)胞依賴(lài)宿主細(xì)胞中的膽固醇，而膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至病毒入侵位點(diǎn)則需要多種蛋白質(zhì)（如OSBP、ORP4）的參與。伊曲康唑（itraconazole）是一種抗霉菌的抗生素，能夠靶向破壞霉菌胞內(nèi)的細(xì)胞色素p450酶發(fā)揮殺菌功能，同時(shí)它也是OSBP的抑制劑［15］。利用伊曲康唑處理ASFV感染的Vero細(xì)胞后，顯著抑制了病毒的增殖，同時(shí)細(xì)胞中“病毒工廠”的數(shù)量也明顯減少，表明伊曲康唑?qū)SFV“病毒工廠”的形成起到阻礙作用［15］。

2.3 核苷類(lèi)似物

核苷酸作為生物個(gè)體遺傳信息復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的重要載體，被廣泛用于化療和抗病原感染治療的靶點(diǎn)。核苷類(lèi)似物具有天然核苷酸相似的結(jié)構(gòu)，能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到生物體的DNA或者RNA大分子中，從而干擾生物體遺傳信息的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，引起核苷酸鏈復(fù)制終止或突變位點(diǎn)的產(chǎn)生。碘苷（iododeoxyuridine）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有抗ASFV活性的核苷類(lèi)似物，在100 μg/mL的工作濃度下顯著抑制了ASFV在Vero細(xì)胞中的增殖，并且連續(xù)使用碘苷處理ASFV感染的Vero細(xì)胞可以達(dá)到清除病原的目的，但該化合物對(duì)細(xì)胞有一定的毒性［22］。9-［（S）-3-羥基 -2-（膦酰甲氧基）丙基］腺嘌呤（9-［（S）-（3-hydroxy-2-phosphonylmethoxypropyl）］adenine，（S）-HPMPA）是一種廣譜的抗病毒化合物，能夠抵抗多種DNA病毒。利用斑點(diǎn)分子雜交技術(shù)證實(shí)（S）-HPMPA及其衍生物通過(guò)干擾病毒DNA的合成發(fā)揮抗ASFV的功能，其中（S）-HPMPA的效果最顯著［23］。ASFV在mRNA合成過(guò)程中需要對(duì)其5′端進(jìn)行加帽修飾，此過(guò)程需要S-腺苷高半胱氨酸水解酶參與轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)［24］。部分腺苷酸類(lèi)似物具有抑制S-腺苷高半胱氨酸水解酶活性的作用，因此這些腺苷酸類(lèi)似物即可阻礙ASFV mRNA的加帽反應(yīng)起到抑制病毒增殖的目的［25］。剛性?xún)捎H融合抑制劑（rigid amphipathic fusion inhibitors，RAFIs）是具有大芳環(huán)尿嘧啶的小分子化合物，屬于尿嘧啶類(lèi)似物。鑒于病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)存在膜融合反應(yīng)，RAFIs被證實(shí)能夠靶向作用于病毒包膜中的脂質(zhì)抑制其與宿主細(xì)胞膜的融合，從而抵抗包膜病毒的感染［26］。ASFV也含有包膜結(jié)構(gòu)，Hakobyan等［27］證實(shí)aUY11和 cm1UY11兩種RAFIs在ASFV內(nèi)化階段發(fā)揮重要的抗病毒活性，二者無(wú)論是在Vero還是在PAM細(xì)胞中都對(duì)ASFV展現(xiàn)出劑量依賴(lài)性的抑制活性。盡管上述核苷類(lèi)似物在細(xì)胞層面展現(xiàn)出良好的抗ASFV活性，但這些藥物制劑并未在活體動(dòng)物上進(jìn)行驗(yàn)證，化合物的安全性、實(shí)用性、生產(chǎn)工藝尚需全面探究。

2.4 植物天然產(chǎn)物

植物天然產(chǎn)物種類(lèi)繁多，具有豐富的生物活性，其中多種成分具有抗病原微生物的作用，被廣泛用于藥物研發(fā)和感染治療中。黃酮類(lèi)成分作為植物次生代謝產(chǎn)物的一大類(lèi)天然產(chǎn)物，廣泛存在于蔬菜、水果、藥用植物、種子、堅(jiān)果以及紅酒和茶中。來(lái)源于植物中的黃酮類(lèi)天然產(chǎn)物具有廣泛的抗病毒活性，Hakobyan等［28］從5種黃酮化合物（芹黃素、兒茶素、金雀異黃素、毛地黃黃酮和槲皮素）篩選到芹黃素（apigenin）具有較強(qiáng)的抗非洲豬瘟病毒的能力。芹黃素通過(guò)抑制ASFV特異性蛋白的合成以及“病毒工廠”的形成，于感染早期表現(xiàn)出對(duì)病毒的抑制能力，且能夠顯著抑制ASFV感染的細(xì)胞病變形成［28］。因此芹黃素可作為抗非洲豬瘟病毒藥物開(kāi)發(fā)的候選。然而，芹黃素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，多以糖苷的形式存在于植物中，純的芹黃素只能在-20℃以下的環(huán)境中儲(chǔ)存，而且在極性溶液（如水、生理鹽水）中幾乎不能溶解，僅可溶于KOH溶液和二甲基亞砜（DMSO）以及微溶于熱酒精中，因此在實(shí)踐應(yīng)用中具有較大的難度。Hakobyan等［29］進(jìn)一步從糖基化和甲基化的芹黃素衍生物中篩選到芫花黃素（genkwanin）具有顯著的抗ASFV 的活性。芫花黃素屬于芹黃素的甲基化衍生物，易溶于極性溶液。研究證實(shí)，芫花黃素能夠在ASFV病毒感染細(xì)胞的吸附和內(nèi)化階段發(fā)揮阻礙作用，同時(shí)也能抑制病毒出宿主細(xì)胞中釋放［29］。除了芹黃素和芫花黃素之外，ASFV對(duì)大豆中的黃酮化合物金雀異黃素也很敏感。Arabyan等［30］通過(guò)細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，金雀異黃素（genistein）通過(guò)阻礙ASFV晚期蛋白的合成使得病毒的生命周期停滯在侵入細(xì)胞的后期。ASFV能夠編碼II型拓?fù)洚悩?gòu)酶，主要參與病毒DNA的復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄。金雀異黃素被發(fā)現(xiàn)能夠與ASFV II型拓?fù)洚悩?gòu)酶上4個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸特異性作用，發(fā)揮病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶毒性劑的功能［30］。楊梅酮（myricetin）和楊梅苷（myricitrin）被發(fā)現(xiàn)也具有抗病毒的活性。Jo等［31］利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)ASFV蛋白酶在65種黃酮類(lèi)化合物的文庫(kù)中進(jìn)行抑制劑的篩選發(fā)現(xiàn)，楊梅酮和楊梅苷對(duì)ASFV蛋白酶表現(xiàn)出明顯的抑制性，暗示二者對(duì)ASFV也具有抗性作用。鉤枝藤（Ancistrocladus uncinatus）是南非地區(qū)常見(jiàn)的一種藤蔓植物，民間用于飼喂豬，可降低豬的發(fā)病率和死亡情況。Fasina等［32］從鉤枝藤的提取物檢測(cè)到35種化合物，證實(shí)這些提取物具有較好的抗ASFV活性。白藜蘆醇因其廣泛的藥理學(xué)作用被用于治療癌癥、心臟疾病、神經(jīng)退行性疾病以及炎癥性疾病。同時(shí)該化合也具有清除氧自由基、抗氧化和抗病毒的功能。Galindo等［33］從細(xì)胞水平對(duì)比了白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇對(duì)ASFV的抑制活性，結(jié)果顯示二者都對(duì)ASFV具有抑制能力，可減少感染細(xì)胞中98%-100%病毒滴度。白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇主要通過(guò)阻礙DNA復(fù)制、抑制病毒蛋白合成以及“病毒工廠”的形成發(fā)揮抗ASFV的作用［33］。此外，從海洋微藻中提取的硫酸多糖以及從大戟屬植物（Euphorbia segetalis）分離的三萜類(lèi)化合物也表現(xiàn)出對(duì)ASFV的劑量依賴(lài)性抑制活性［34-35］。盡管上述植物天然化合物都對(duì)ASFV具有很好抑制效果，但缺乏活體動(dòng)物的驗(yàn)證試驗(yàn)，無(wú)法保證其安全性。另外植物化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，提取工藝繁瑣，其分離后的活性也有所變化。因此，不僅需要加強(qiáng)對(duì)植物化合物的活體試驗(yàn)研究外，還需要對(duì)其提取工藝和安全性進(jìn)行全面探究。

2.5 RNA干擾和CRISPR/Cas9

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是由雙鏈RNA誘導(dǎo)，引起靶基因轉(zhuǎn)錄后特異性沉默的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，被廣泛應(yīng)用到抗病毒和基因沉默的研究中。人醫(yī)臨床上也有針對(duì)RNAi技術(shù)的上市的藥物，具有較廣的應(yīng)用前景。Keita等［36］針對(duì)ASFV的關(guān)鍵基因A151R和B646 L分別設(shè)計(jì)了多條siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ASFV感染的細(xì)胞后，部分單一的siRNA顯著降低了細(xì)胞中病毒滴度，而對(duì)兩個(gè)基因的多條siRNA混合作用時(shí)，對(duì)ASFV的抑制作用并不明顯。與此類(lèi)似，F(xiàn)rouco等［37］在探究ASFV基因pA104R的功能時(shí)，設(shè)計(jì)的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠降低82%病毒滴度，同時(shí)也影響了病毒晚期蛋白的表達(dá)，由此看見(jiàn)pA104R蛋白在ASFV的增殖中起到重要作用。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌抵抗噬菌體感染的一種防御機(jī)制，經(jīng)過(guò)人為不斷改造已廣泛應(yīng)用基因的敲除、敲入和沉默等技術(shù)。近年來(lái)，CRISPR/Cas系統(tǒng)在抗病毒的應(yīng)用研究中備受關(guān)注。Hübner等［38］構(gòu)建了針對(duì)ASFV磷蛋白p30基因（CP204L）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，破壞了p30在病毒感染過(guò)程中的表達(dá)，幾乎完全抑制了病毒在感染細(xì)胞中的增殖。同時(shí)該研究也充分說(shuō)明p30基因在ASFV增殖過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用。CRISPR/Cas系統(tǒng)除了用于抗病毒研究之外，研究者多用該技術(shù)對(duì)ASFV基因組進(jìn)行編輯，通過(guò)靶向敲除或插入等手段探究某個(gè)基因的功能或改造形成ASFV突變毒株用于疫苗開(kāi)發(fā)研究。

2.6 其他抗病毒化合物

組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）是宿主修飾染色體結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因表達(dá)的一類(lèi)重要蛋白酶，多種病毒被發(fā)現(xiàn)能夠與HDACs相互作用破壞宿主基因表達(dá)和蛋白修飾。苯基丁酸鈉和丙戊酸是HDAC的抑制劑，二者明顯抑制ASFV的增殖，其中苯基丁酸鈉可完全破壞Vero細(xì)胞中病毒的增殖，丙戊酸也可降低74%病毒滴度［39］。通過(guò)檢測(cè)病毒晚期蛋白的表達(dá)和宿主組蛋白的乙?；剑砻鞅交∷徕c阻礙了病毒晚期蛋白的表達(dá)以及破壞了病毒對(duì)宿主蛋白的修飾作用［39］。同時(shí)，苯基丁酸鈉與ASFV的 II型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑——恩諾沙星具有協(xié)同作用，二者共同作用極大地增強(qiáng)了單一使用時(shí)對(duì)ASFV的抑制能力，這也暗示宿主的乙?；鞍着cASFV的拓?fù)洚悩?gòu)酶對(duì)病毒的增殖具有相互促進(jìn)作用［39］。Ziem等［40］以石墨烯為支架合成了聚合甘油硫酸鹽功能性石墨烯二維多價(jià)大分子，該分子能夠結(jié)合ASFV阻止其黏附細(xì)胞，發(fā)揮很強(qiáng)的抑制效應(yīng)。此外，飼料添加劑中的中鏈脂肪酸和甲醛衍生物也具有抗ASFV的能力，無(wú)論是在細(xì)胞培養(yǎng)物還是在跨海航運(yùn)的成品飼料中，二者都能使 ASFV 失活［41］。

計(jì)算機(jī)虛擬篩選是藥物開(kāi)發(fā)的重要新手段之一，借助于計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的計(jì)算能力在已知受體生物大分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)分子對(duì)接的方式尋找具有高親和力的小分子配體，從而篩選具有苗頭的抑制劑或者藥物。王卓亞等［42］以ASFV DNA聚合酶的X AsfvPolX的DNA結(jié)合區(qū)為靶點(diǎn)，分別在天然藥物庫(kù)和海洋化合物庫(kù)中進(jìn)行分子對(duì)接篩選，發(fā)現(xiàn)75種潛在的具抑制ASFV效果的天然產(chǎn)物，其中15種分布在中國(guó)。類(lèi)似地，Kinyanyi等［43］以ASFV DNA的AT富集區(qū)為靶點(diǎn)，用紡錘菌素、剛果素2和3以及三羥甲基氨基苯并咪唑等4種化合物進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示剛果素和三羥甲基氨基苯并咪唑具有潛在的抑制ASFV功能。上述通過(guò)虛擬篩選的藥物或抑制劑尚未經(jīng)過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)藥物的安全性也未知，因此從龐大的分子庫(kù)中獲得高效實(shí)用的抗ASFV藥物還需要大量的工作。

3 總結(jié)與展望

ASF的防控是世界養(yǎng)豬業(yè)急需要解決的重要難題，當(dāng)前，以落實(shí)生物安全防控措施、消滅傳染源和做好飼養(yǎng)管理的措施是防控ASF的關(guān)鍵。盡管?chē)?guó)內(nèi)外的研究人員針對(duì)ASFV疫苗的研發(fā)進(jìn)行開(kāi)展了較多工作，也取得了一定的成果，但目前仍未研制出具有高免疫原性和完全保護(hù)效果的疫苗。除了疫苗研發(fā)，抗ASF藥物制劑的開(kāi)發(fā)也是應(yīng)對(duì)ASF疫情的一個(gè)重要措施?；谒幬锛盎衔镏苿┑淖饔脵C(jī)制，針對(duì)抗ASFV藥物制劑的研發(fā)主要集中在兩方面：（1）藥物制劑直接作用于AFSV編碼的蛋白影響其復(fù)制；（2）抑制劑作用于病毒復(fù)制時(shí)所需的宿主蛋白因子從而間接發(fā)揮抗ASFV的作用。本文中闡述了多種藥物及化合物制劑都是通過(guò)上述兩種方式發(fā)揮抗ASFV活性，但這些藥物及抑制劑缺乏在活體動(dòng)物上的效果驗(yàn)證。來(lái)自人類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)的成功案例表明，一些化合物制劑具有良好的抗病毒作用乃至完全能夠清除患者體內(nèi)感染的病原。然而這些藥物往往需要花費(fèi)高昂的研發(fā)成本和生產(chǎn)成本，遠(yuǎn)比動(dòng)物的養(yǎng)殖成本高。因此，植物天然產(chǎn)物是開(kāi)發(fā)抗ASFV藥物良好的途徑，具有來(lái)源廣、結(jié)構(gòu)獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，而且我國(guó)天然產(chǎn)物資源豐富，具有悠久的中草藥歷史。利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選，結(jié)合分子對(duì)接可以高效地從數(shù)量龐大的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到苗頭化合物，進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證可提高藥物研發(fā)的進(jìn)程。值得注意的是，ASF作為豬的烈性傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?jī)H允許全國(guó)8個(gè)動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室從事病毒分離、鑒定、活病毒培養(yǎng)、動(dòng)物接種（感染）試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，其生物安全操作必須遵守《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定。

盡管ASFV已被發(fā)現(xiàn)已有近百年的歷史，但我們對(duì)該病毒認(rèn)識(shí)還很少，尤其是病毒編碼的蛋白數(shù)量龐大，其功能還不清楚；病毒逃逸宿主的免疫機(jī)制、宿主對(duì)病毒應(yīng)答機(jī)制以及病毒的致病機(jī)制都不甚了解。這是制約當(dāng)前疫苗研發(fā)和藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵。因此，持續(xù)開(kāi)展ASFV與宿主間的相互作用研究，有助于疫苗開(kāi)發(fā)和抗病毒藥物的研制。