朱 煜，熊 磊，馬云淑，3，4*，陳慶飛，3，趙夢蕓，3(.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500；2.云南省第三人民醫(yī)院，昆明 6500；3.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)重點實驗室，昆明 650500；4.云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室，昆明 650500)

蒼艾揮發(fā)油組方是熊磊教授治療上呼吸道疾病的臨床經(jīng)驗方，主要是由蒼術(shù)、艾葉和丁香等7味中藥粗粉采用水蒸氣蒸餾法提取得到的復(fù)方揮發(fā)油，其氣味芳香，具有開竅、燥濕和化濁的功效。課題組前期研究表明，蒼艾揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌和乙型鏈球菌有一定的體外抑菌作用，且對治療上呼吸道感染有良好的作用[1]，同時能有效抑制肺氣虛證大鼠肺部和咽部黏膜的炎癥反應(yīng)，修復(fù)創(chuàng)傷黏膜組織[2]，并有望在抑郁癥的治療中發(fā)揮良好的效果[3]。陳柏君等[4]對蒼艾揮發(fā)油化學(xué)成分進行GC-MS分析，結(jié)果顯示,其中含量較多的2個成分為丁酚香和1，8-桉葉素，分別占42.43%，30.80%。揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定，易受光線、氧氣、溫度和濕度的影響，可能使其顏色變深，比重和黏度增大，從而降低藥效。

醇質(zhì)體作為新一代脂質(zhì)體，是由磷脂、高體積分?jǐn)?shù)乙醇(或丙二醇等)和水組成的具囊泡結(jié)構(gòu)的給藥載體。與普通脂質(zhì)體相比，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、包封率較高、粒徑較小，有更好的膜流動性，在皮膚真皮層藥物滯留量更多，易于攜帶。藥物可透過皮膚角質(zhì)層或黏膜細(xì)胞，是良好的皮膚與黏膜給藥載體[5-7]，在局部和全身治療方面具有很好的應(yīng)用前景。故本實驗應(yīng)用正交實驗設(shè)計優(yōu)化蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體的制備工藝，以提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性，保證制劑質(zhì)量，減少皮膚和黏膜刺激性，延長藥效，為中藥揮發(fā)油外用制劑的研制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 CP124C型電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；Brookhaven型激光粒度儀(美國布魯克海文儀器公司)；FS-300N型超聲波處理器(上海生析超聲儀器有限公司)；UV-2450型紫外掃描儀(日本島津公司)；UV-6000T型紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2試藥 蒼艾揮發(fā)油，實驗室自制；蒼術(shù)、艾葉、花椒、藿香、佩蘭、丁香和白豆蔻藥材(批號分別為181201，170343，182516，183121，171153，180789，181304)，均購自云南自然谷生物開發(fā)有限公司；大豆卵磷脂(批號613M023)，北京索萊寶科技有限公司；石油醚(批號20151103)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；丁香酚對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.6%，批號201716)，中國食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體的制備 采用注入-超聲法制備蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體。精密稱取處方量的蒼艾揮發(fā)油、大豆卵磷脂和無水乙醇，置于棕色西林瓶中，40 ℃環(huán)境下用磁力攪拌器以200 r·min-1攪拌0.5 h，然后向西林瓶中緩慢、勻速滴加40 ℃純凈水3.5 mL，攪拌至充分溶解并將其移至10 mL離心管中，冰水浴探頭超聲：45 W 2 min→75 W 2 min→105 W 2 min→135 W 2 min，最后用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體。

2.2蒼艾揮發(fā)油紫外測定波長的確定 取蒼艾揮發(fā)油，用適量甲醇稀釋，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，結(jié)果表明，蒼艾揮發(fā)油在280 nm波長附近有最大吸收峰，故確定280 nm為其測定波長。

2.3蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體包封率的測定 包封率是指醇質(zhì)體中被包載的藥物量在總投藥量中所占的比例，是衡量醇質(zhì)體質(zhì)量的重要指標(biāo)。本實驗采用石油醚萃取-紫外法[8]測定蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體的包封率，吸取適量2.1項下制備的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體，加甲醇破乳，定容，于280 nm波長處檢測其吸光度值A(chǔ)，記為A1；另取同體積蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體，加同體積石油醚萃取3次，取下層醇質(zhì)體層加甲醇破乳，定容，于280 nm波長處檢測其吸光度值A(chǔ)，記為A2，計算包封率：包封率=A2÷A1×100%。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1溶液的配制 精密稱取蒼艾揮發(fā)油0.01 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容、搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的蒼艾揮發(fā)油甲醇儲備液；取蒼艾揮發(fā)油甲醇儲備液0.2,0.4，0.6 mL，分別經(jīng)甲醇稀釋10倍，即得質(zhì)量濃度分別為20，40，60 μg·mL-1的蒼艾揮發(fā)油甲醇溶液。另取蒼艾揮發(fā)油0.01 g，置于10 mL量瓶中，以石油醚定容、搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的蒼艾揮發(fā)油石油醚儲備液。取2.1項下制備的質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體2，4，6 μL，分別用甲醇稀釋10倍，即得質(zhì)量濃度分別為20，40，60 μg·mL-1的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體甲醇溶液。同2.1項下方法，不加蒼艾揮發(fā)油，得空白醇質(zhì)體，再以適量甲醇稀釋，即得空白醇質(zhì)體甲醇溶液。取丁香酚對照品適量，以甲醇溶解，即得丁香酚對照品溶液。

2.4.2專屬性考察 分別取2.4.1項下制備的質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1的蒼艾揮發(fā)油甲醇溶液、40 μg·mL-1蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體甲醇溶液、空白醇質(zhì)體甲醇溶液以及丁香酚對照品溶液，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，結(jié)果見圖1。由圖1可知，空白醇質(zhì)體甲醇溶液在280 nm波長處無吸收峰，對蒼艾揮發(fā)油指標(biāo)性成分丁香酚的測定無干擾。

圖1 紫外掃描圖

2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別量取2.4.1項下制備的蒼艾揮發(fā)油甲醇儲備液和蒼艾揮發(fā)油石油醚儲備液各0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50 mL，分別置于16個10 mL量瓶中，分別加甲醇和石油醚定容，搖勻，于280 nm波長處檢測，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)(y)、溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進行線性回歸，得方程：y1=0.015 5x1-0.077 9(R12=0.999 7)，y2=0.014 5x2-0.010 3(R22=0.999 1)，2種溶液質(zhì)量濃度均在15.00～50.00 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4精密度實驗 分別取2.4.1項下制備的質(zhì)量濃度分別為20，40，60 μg·mL-1的蒼艾揮發(fā)油甲醇溶液和蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體甲醇溶液，各3份，分別于280 nm波長處連續(xù)測定其吸光度值A(chǔ)。結(jié)果3種質(zhì)量濃度的蒼艾揮發(fā)油甲醇溶液的RSD值分別為0.09%，0.08%，0.09%，3種質(zhì)量濃度的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體甲醇溶液的RSD值分別為0.30%，0.20%，0.09%，表明儀器精密度良好。

2.4.5穩(wěn)定性實驗 分別取2.4.1項下制備的質(zhì)量濃度均為40 μg·mL-1的蒼艾揮發(fā)油甲醇溶液和蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體甲醇溶液，于第0，2，4，6，8，10，12 h在280 nm波長處測定其吸光度值A(chǔ)，2種溶液的RSD值分別為0.80%，0.25%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6重復(fù)性實驗 取2.1項下同批次蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體6份，分別用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1，在280 nm波長處測定其吸光度值A(chǔ)，RSD值為0.36%，表明實驗重復(fù)性良好。

2.4.7蒼艾揮發(fā)油在石油醚中的回收率 精密量取2.4.1項下制備的不同體積的蒼艾揮發(fā)油石油醚儲備液150，300，450 μL，分別置于10 mL量瓶中，加石油醚定容，配制成低、中、高3個質(zhì)量濃度的蒼艾揮發(fā)油石油醚溶液，分別于280 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)；另取不同體積的蒼艾揮發(fā)油石油醚儲備液150，300，450 mL，分別加適量空白醇質(zhì)體，物理混合，用同體積石油醚萃取3次，取上層石油醚定容至10 mL量瓶中，分別于280 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果表明，3個質(zhì)量濃度的蒼艾揮發(fā)油石油醚溶液中的蒼艾揮發(fā)油的平均回收率在100.04%～100.10%范圍內(nèi)，RSD值均小于1.53%，表明游離藥物與醇質(zhì)體可以較好地分離[8]。

2.4.8蒼艾揮發(fā)油在空白醇質(zhì)體中的回收率 精密量取2.4.1項下制備的不同質(zhì)量濃度的蒼艾揮發(fā)油甲醇儲備液，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成低、中、高3個質(zhì)量濃度的蒼艾揮發(fā)油甲醇溶液，分別于280 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)；另取不同體積的蒼艾揮發(fā)油甲醇儲備液，加適量空白醇質(zhì)體，混合，再加甲醇破乳，定容至10 mL，分別于280 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果表明，3個質(zhì)量濃度的蒼艾揮發(fā)油甲醇溶液中的蒼艾揮發(fā)油的平均回收率在99.50%～100.60%范圍內(nèi)，RSD值均小于0.65%，表明空白醇質(zhì)體對蒼艾揮發(fā)油的吸光度值A(chǔ)無明顯影響[8]。

2.5正交實驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素考察和大量預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選擇對蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體包封率影響較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、大豆卵磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)和乳化溫度(C)為考察因素，空白因素(D)作為誤差項，各因素選取3個水平，以包封率為評價指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交實驗，因素與水平見表1，實驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交實驗因素與水平

表2 正交實驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2和表3可知，3個因素對蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體包封率的影響順序為A>C>B，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和乳化溫度(C)對醇質(zhì)體的包封率有顯著影響，故選擇最優(yōu)方案A2C3，出于經(jīng)濟性考慮，選擇大豆卵磷脂質(zhì)量濃度(B)為B1方案，因此確定制備蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體的優(yōu)選工藝為A2B1C3，即固定蒼艾揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，大豆卵磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%，乳化溫度為40 ℃。

2.6優(yōu)選工藝驗證 按照2.5項下優(yōu)選工藝制備3批蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體，按照2.3項下方法測定包封率，3批蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體的平均粒徑為(78.64±1.05) nm，平均包封率為82.23%±1.16%，該制備工藝穩(wěn)定，重復(fù)性較好。

2.7蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體的質(zhì)量評價

2.7.1表觀形態(tài) 取2.1項下制備的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體，日光下觀察呈乳白色半透明溶液。另取適量蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體稀釋數(shù)倍，滴于銅網(wǎng)上，用磷鎢酸負(fù)染，晾干，透射電鏡下觀察其形態(tài)并拍照，可見蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體呈類圓形囊泡，表面光滑，大小分布均勻，見圖2。

圖2 透射電鏡圖

2.7.2粒徑及Zeta電位 取2.1項下制備的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體，在常溫第0和15天分別用0.5 mL純凈水稀釋25倍，用激光粒度儀在20 ℃下測定其粒徑及Zeta電位，結(jié)果見表4。由表4可知，優(yōu)選工藝制得的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體在常溫下放置15 d后，粒徑和Zeta電位無明顯改變。

表4 粒徑及Zata電位

3 討論

醇質(zhì)體常用的制備方法有薄膜分散法[9-10]、注入法[11-12]和注入-超聲法[13-14]等。本實驗所用的注入-超聲法是在注入法的基礎(chǔ)上，將脂溶性的蒼艾揮發(fā)油和大豆卵磷脂先溶于乙醇中，注入純水，并將所得的溶液用冰水浴探頭超聲后，再用微孔濾膜過濾，使制得的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體勻質(zhì)化，體系較穩(wěn)定。本實驗所制得的蒼艾揮發(fā)油醇質(zhì)體在常溫中保存15 d后，外觀形態(tài)仍為乳白色半透明液體，無沉淀、無油水分離現(xiàn)象，粒徑和Zeta電位無明顯變化。此制備工藝操作簡單可行，條件易控制，適用于大量醇質(zhì)體的制備，有利于投入工業(yè)化生產(chǎn)，但在制備過程中應(yīng)謹(jǐn)慎處理每一個步驟，如乙醇、純水注入的速度一定要緩慢且勻速，滴入速度不超過20滴·min-1。

醇質(zhì)體包封率的測定方法常采用凝膠柱色譜法[15-16]、透析法[17-18]、超速離心法[19-20]和萃取法[8]等。其中，凝膠柱色譜法常用的凝膠為水溶性凝膠，透析法常用的透析介質(zhì)為水溶液。考慮到蒼艾揮發(fā)油脂溶性強，故不適宜采用凝膠柱色譜法和透析法，故選用石油醚萃取法。本實驗還分別考察了蒼艾揮發(fā)油在石油醚和空白醇質(zhì)體中的回收率，結(jié)果表明，石油醚萃取分離游離藥物的方法可行，實驗成本較低，方法重復(fù)性較好。研究表明，乙醇對皮膚和黏膜有輕微毒性，還應(yīng)對該制劑的皮膚刺激性和纖毛毒性進行研究。

醇質(zhì)體作為一種高效的經(jīng)皮和經(jīng)鼻腔給藥載體，隨著醇質(zhì)體促滲機制研究的不斷深入，在中藥復(fù)方現(xiàn)代制劑中的應(yīng)用將更加廣泛。