肖 燃 宋長(zhǎng)普 朱 陽(yáng) 黃 偉 鄭利兵 遲長(zhǎng)鳳① 樓 寶

(1. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國(guó)家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室舟山 316022; 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究所 杭州 310021)

神經(jīng)肽 FF(Neuropeptide FF, FLFQPQRFa-NH2,NPFF)是一種類(lèi)酰胺化神經(jīng)肽, 屬于 RF 氨基肽家族(Fukusumi et al, 2006)。神經(jīng)肽FF 與促性腺激素抑制激素(GnIH)同源, 具有豐富的生理活性, 在調(diào)節(jié)應(yīng)激對(duì)生殖的影響(Ubuka et al, 2018)、性成熟(Shahjahan et al, 2015)、調(diào)節(jié)血壓(Allard et al, 1995)、體液平衡(Majane et al, 1991; Kalliom?ki et al, 2004)、體溫(Moulédous et al, 2010)、消化道運(yùn)動(dòng)(Decker et al,1997)、抗炎(Yang et al, 2003)、心血管功能(Laguzzi et al, 1996)、脂肪細(xì)胞分化(Lefrère et al, 2002)和內(nèi)分泌(Jhamandas et al, 2013)等方面發(fā)揮著重要作用。

小黃魚(yú)(Larimichthys polyactis)又名小黃花, 屬于石首魚(yú)科(Sciaenidae)黃魚(yú)屬(Larimichthys), 與帶魚(yú)(Trichiurus lepturus) 、 曼 氏 無(wú) 針 烏 賊 (Sepiella japonica)、大黃魚(yú)(Larimichthys crocea)同被譽(yù)為東海“四大海產(chǎn)”之一(Park et al, 2019)。目前各國(guó)學(xué)者研究主要集中在小黃魚(yú)的資源分布等方面, 但對(duì)小黃魚(yú)生殖調(diào)控的研究還相對(duì)較少(蒙子寧等, 2003; Wang et al, 2009)。由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染、氣候環(huán)境變化等原因, 小黃魚(yú)捕撈量急劇下降, 捕獲的小黃魚(yú)表現(xiàn)出日趨小型化、性成熟等現(xiàn)象, 種質(zhì)資源退化嚴(yán)重,已經(jīng)無(wú)法滿(mǎn)足人們的消費(fèi)需求(Chen et al, 1997; 嚴(yán)利平等, 2014)。目前已有學(xué)者對(duì)小黃魚(yú)生殖周期、精液特性和精子結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了研究(Lim et al, 2010; Le et al, 2011)。Wang 進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KIF3A 可能在精子發(fā)生過(guò)程中參與核重塑和尾巴形成(Wang et al,2019), 但關(guān)于小黃魚(yú)在生殖方面的研究十分有限。研究表明促性腺激素能與腦垂體生長(zhǎng)激素受體相互作用, 說(shuō)明神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)能影響?hù)~(yú)類(lèi)生長(zhǎng)及性腺的發(fā)育(林浩然, 2000), 而神經(jīng)肽FF 能同時(shí)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和性腺發(fā)育。因此, 本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展神經(jīng)肽 FF 在小黃魚(yú)性腺發(fā)育過(guò)程中的潛在功能研究, 分析神經(jīng)肽FF 基因在性腺發(fā)育早期的表達(dá)與定位, 為開(kāi)展神經(jīng)肽FF 的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小黃魚(yú)樣品采自浙江省寧波市象山港水產(chǎn)育種有限公司。選取健康有活力的第Ⅱ期小黃魚(yú)[體長(zhǎng)為(11±2) cm, 體重為(16±2) g], 取出腦、頭腎、心、鰓、皮膚、性腺、脾臟、肝臟、胃、肌肉、腸道等組織(n=3), 立即在室溫下 RNA 保存液浸泡1 h, 液氮中保存24 h, 然后轉(zhuǎn)移至-80°C 冰箱中, 直至提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 備用。腦、性腺(卵巢)放在預(yù)冷的4%多聚甲醛中固定, 用冰袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室, 4°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RNA 保存液、RNAiso Plus、Ex Taq Mix、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 均購(gòu)于TaKaRa 公司、Riboprobe?Combination System-試劑盒購(gòu)于 Promega科技有限公司、DIG RNA Labeling Mix、Anti-Digoxigenin-AP conjugate、BCIP/NBT 顯色試劑盒均購(gòu)于 Roche 科技有限公司、Anti-FMRFamide 購(gòu)于ImmuoStar 公司、SABC 試劑盒購(gòu)于上海生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小黃魚(yú)神經(jīng)肽FF 基因組織表達(dá)特異性分析采用M-MLVRTase cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一條鏈, -20°C 冰箱備用。選取小黃魚(yú) β-actin、18S 基因作為內(nèi)參, 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 分析小黃魚(yú)神經(jīng)肽 FF 基因在不同組織中表達(dá)的差異性。根據(jù)所得神經(jīng)肽FF 基因cDNA全長(zhǎng), 設(shè)計(jì)其 qRT-PCR 特異性引物, 引物序列見(jiàn)表1。選擇第Ⅱ期性未成熟的小黃魚(yú)三只做3 次生物學(xué)重復(fù), 每次反應(yīng)做3 次機(jī)械重復(fù)。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)操作參考SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。qRT-PCR 結(jié)果以2-ΔΔCT方法換算成相對(duì)表達(dá)量, 單因素方差分析分析(One-way ANOVA)運(yùn)用軟件 SPSS 17.0 來(lái)實(shí)現(xiàn), 顯著性差異分析則通過(guò)SPSS17.0 的 Duncan 法得出, P＜0.05 為顯著差異; 利用Origin 8.1 軟件進(jìn)行柱狀圖繪圖。

表1 小黃魚(yú)神經(jīng)肽FF 基因熒光定量引物Tab.1 Primers of LpNPFF used in real-time PCR

1.2.2 小黃魚(yú)神經(jīng)肽FF 基因在腦和卵巢中的定位分析 在小黃魚(yú)神經(jīng)肽FF 基因的ORF 區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)原位雜交探針的引物, 反義探針(用A 表示)需在下游引物前加上T7 啟動(dòng)子序列, 正義探針(用S 表示)需在上游引物前加上T7 啟動(dòng)子序列, 引物序列參見(jiàn)表2。探針根 據(jù) Riboprobe?CombinationSystem-SP6/T7 RNA Polymerase 試劑盒以及DIG RNA Labeling Mix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在雜交前對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、通透處理, 并且在預(yù)雜交液中孵育 1 h (42°C); 暗盒中 50°C 雜交過(guò)夜; 滴加二抗(抗地高辛-AP 抗體, 稀釋1∶2000), 室溫暗盒中靜置3 h; BCIP/NBT 染色封片后顯微觀察。

表2 LpNPFF 基因原位雜交引物Tab.2 Primers used in LpNPFF in situ hybridization

1.2.3 FaRPs 成熟肽在小黃魚(yú)腦和卵巢中的定位分析 通過(guò)間接免疫過(guò)氧化物酶方法處理切片:將組織去石蠟、復(fù)水, 然后在pH 7.4 的0.1 mol/L PBS 中洗滌; 切片用0.3% H2O2處理以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。與胎牛血清孵育 20 min 后, 切片在 4°C 下與兔FMRFamide 多克隆抗體(1∶2000 稀釋)在濕盒中孵育過(guò)夜(陰性對(duì)照以PBS 代替一抗); 將切片在PBS 中沖洗數(shù)次, 并在室溫下與二抗(生物素標(biāo)記羊抗兔 IgG)在PBS 中按1∶1000 稀釋孵育30 min。在PBS 中漂洗兩次后, 將抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶-偶聯(lián)物溶液加入到載玻片中, 并在37°C 下孵育30 min。最后, 通過(guò)使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)可視化反應(yīng)產(chǎn)物, 并用蘇木精染色細(xì)胞核。然后將切片洗滌、脫水、透明, 使用中性樹(shù)脂封片, 顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黃魚(yú)神經(jīng)肽FF 基因組織表達(dá)特異性分析

以第Ⅱ期的小黃魚(yú)各個(gè)組織為模板進(jìn)行qRT-PCR 熒光定量分析LpNPFF 組織差異性情況。如圖 1 所示, LpNPFF 在所有測(cè)試的組織中均有表達(dá),包括腦、腎、性腺、頭腎、心臟、肝臟、胃、脾臟、鰓、腸和肌肉。其中, LpNPFF 基因在腦組織中高表達(dá), 并且與其他組織比較具有顯著性差異。性腺、肌肉和脾臟LpNPFF 表達(dá)略高于其他外周組織, 在胃、鰓、腸道中LpNPFF 的表達(dá)相對(duì)較少。

圖1 LpNPFF 基因在小黃魚(yú)不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 Relative expression levels of the LpNPFF genes in different tissues of L. polyactis

2.2 LpNPFF在小黃魚(yú)腦和卵巢中mRNA的定位分析

基于LpNPFF 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá), 我們選取小黃魚(yú)腦 (端腦、中腦、小腦及延腦)和性腺進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在小黃魚(yú)端腦(圖2b, 2c,2d, 2e, 2f)、中腦(圖3b, 3c, 3d), 小腦及延腦(圖4b, 4c,4d)組織中能夠清晰觀察到LpNPFF 基因mRNA 的陽(yáng)性雜交信號(hào), 用正義探針進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)雜交則不能觀察到信號(hào)(端腦, 圖 2a; 中腦, 圖 3a; 小腦及延腦,圖4a)。小黃魚(yú)LpNPFF 的mRNA 主要分布于小黃魚(yú)的中腦(視葉)以及延腦, 端腦和小腦部分的表達(dá)較少。在中腦的視頂蓋(OTec)、圓環(huán)體(TL)、結(jié)節(jié)前核(NAT)、外側(cè)結(jié)節(jié)核(NLT)、下丘腦彌散核(NDLI)以及延腦(MO)中檢測(cè)到大量表達(dá)LpNPFF mRNA 的細(xì)胞,這可能暗指LpNPFF 調(diào)控著不同的生理學(xué)功能。并且在小黃魚(yú)未成熟的性腺組織中也能觀察到明顯的陽(yáng)性信號(hào)(圖5b)。經(jīng)小黃魚(yú)性腺組織解剖學(xué)分析, 此時(shí)期性腺為卵巢, 以不規(guī)則多角形的稚齡時(shí)相的卵母細(xì)胞為主要組成部分, 它們之間彼此緊密相連, 核很大, 呈圓形, 核仁可見(jiàn)分布在核的周?chē)?。因此在?xì)胞質(zhì)與核仁部分能觀察到明顯的 LpNPFF 基因 mRNA的陽(yáng)性雜交信號(hào)。

2.3 FaRPs 成熟肽在小黃魚(yú)腦和卵巢中的定位分析

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 小黃魚(yú)腦組織中的FaRPs 的免疫活性的區(qū)域?yàn)樽厣?圖6b, 6c, 6d), 與不具 FaRPs 免疫活性的細(xì)胞核區(qū)域形成鮮明的對(duì)比(圖6a), 我們?cè)谥心X的表層發(fā)現(xiàn)了明顯密集的 FaRPs 免疫信號(hào), 而在內(nèi)部則相對(duì)較少。在小黃魚(yú)性腺組織中,FaRPs 的免疫活性的區(qū)域?yàn)樽厣?圖7b, 7c, 7d), 與不具 FaRPs 免疫活性的細(xì)胞核區(qū)域形成鮮明的對(duì)比(圖7a), 并且 RFamide 主要存在于細(xì)胞壁壁或結(jié)締組織周?chē)?。我們預(yù)測(cè) LpNPFF 肽作用于性腺壁表層細(xì)胞,可能參與調(diào)控性腺發(fā)育等。

3 討論

小黃魚(yú)是我國(guó)浙江舟山沿海地區(qū)的一種主要的經(jīng)濟(jì)性物種, 由于其肉質(zhì)鮮美, 深受人們的喜愛(ài)。LpNPFF 是 RFamide 相關(guān)肽家族中的一員, 在許多生物學(xué)過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。實(shí)時(shí)熒光定量分析顯示, 小黃魚(yú)神經(jīng)肽 FF mRNA 在所有被測(cè)組織中均廣泛表達(dá), 其中以腦、性腺、腎臟及周?chē)M織肌肉中表達(dá)量最高。在花鱸(Lateolabrax maculatus)(Li et al,2019)和星點(diǎn)東方鲀(Takifugu niphobles)(Shahjahan et al, 2015)中, NPFF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)和性腺中的表達(dá)量最高, 提示LpNPFF 可能在腦和性腺中發(fā)揮重要作用, 這與我們得到的結(jié)果一致。在大鼠(Mus musculus)中, NPFF mRNA 的最高水平出現(xiàn)在脊髓、垂體和下丘腦(Kivipelto et al, 1991; Majane et al, 1993); 而在人類(lèi)中, NPFF mRNA 的最高水平出現(xiàn)在髓質(zhì)和脊髓(Nystedt et al, 2002), 這有可能說(shuō)明不同的表達(dá)模式表明不同物種大腦功能的差異性。

圖2 LpNPFF 基因mRNA 端腦原位雜交圖Fig.2 Localization of LpNPFF mRNA in telencephalon of L. polyactis

圖3 LpNPFF 基因mRNA 中腦原位雜交圖Fig.3 Localization of LpNPFF mRNA in midbrain of L. polyactis

圖4 LpNPFF 基因mRNA 小腦及延腦原位雜交圖Fig.4 Localization of LpNPFF mRNA in cerebellum and medulla oblongata (MO) of L. polyactis

圖5 LpNPFF 基因mRNA 性腺原位雜交圖Fig.5 Localization of LpNPFF mRNA in gonad of L. polyactis

圖6 小黃魚(yú)腦組織中的FaRPs 分布圖Fig.6 Distribution of FaRPs in brain tissue of L. polyactis

圖7 小黃性腺組織中的FaRPs 分布圖Fig.7 Distribution of FaRPs in the gonad tissue of L. polyactis

NPFF 在人(Homo sapiens)和大鼠的細(xì)胞定位在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多區(qū)域被檢測(cè)到。人類(lèi)NPFF 基因mRNA 定位于大腦和脊髓(Vilim et al, 1999)。在大鼠中 NPFF 基因 mRNA 高表達(dá)于下丘腦室旁核(PVN),這是一個(gè)對(duì)神經(jīng)激素分泌和交感神經(jīng)流出調(diào)節(jié)至關(guān)重要的自主核(Jhamandas et al, 2006)。與人類(lèi)和大鼠不同, 在成熟斑馬魚(yú)(Danio rerio)和胚胎中確定了表達(dá) NPFF 基因 mRNA 的細(xì)胞的定位。在端腦的嗅球和嗅視神經(jīng)核中發(fā)現(xiàn)了ZfPQRF 神經(jīng)元表達(dá), 而在下丘腦、腦干和脊髓中則沒(méi)有 ZfPQRF 神經(jīng)元表達(dá)(Oehlmann et al, 2002)。這些基因在哺乳動(dòng)物和硬骨魚(yú)之間的差異定位顯示了不同的基因功能。然而, 在我們的研究中, 小黃魚(yú)NPFF 基因mRNA 在端腦及小腦部分表達(dá)量有限, 但在中腦部分區(qū)域和延腦(MO)區(qū)域有大量表達(dá), 這可能表示LpNPFF 通過(guò)不同的途徑向不同組織傳遞信號(hào)并且行使著不同的生理學(xué)功能, 其中包括與生殖相關(guān)的 NDLI(Kitahashi et al,2009), 與攝食調(diào)節(jié)相關(guān)的NAT、NLT (Cerdá-Reverter et al, 2000, 2003; Shiraishi et al, 2000)。LpNPFF 基因mRNA 在中腦的分布主要在組織的邊緣, 并且較為集中且呈長(zhǎng)條狀分布, 如 OTec 和 NLT 等。NPFF 很可能作為傳遞信號(hào)的途徑, 通過(guò)不同的途徑向不同組織傳遞信號(hào)。根據(jù)最近的研究, 在花鱸中發(fā)現(xiàn)NPFF 及其受體均位于下丘腦, 說(shuō)明 NPFF 對(duì)下丘腦神經(jīng)元有直接的調(diào)節(jié)進(jìn)食作用(Bechtold et al, 2007;Li et al, 2019)。小黃魚(yú)神經(jīng)肽FaRPs 的免疫陽(yáng)性信號(hào)主要集中于腦部細(xì)胞表層和卵巢壁細(xì)胞表層, 這與原位雜交結(jié)果中 LpNPFF mRNA 的分布較為集中不同。鑒于原位雜交技術(shù)定位的是LpNPFF 的 mRNA,基本可以判定有信號(hào)區(qū)域是可能分泌 FaRPs 蛋白的細(xì)胞。在胚胎斑馬魚(yú)中(Pinelli et al, 2000)和鱒魚(yú)(Salmo trutta fario)(Castro et al, 2001)的早期發(fā)育階段也發(fā)現(xiàn)了FMRFamide 類(lèi)免疫反應(yīng)神經(jīng)元。我們提出一個(gè)假設(shè): 腦部組織是小黃魚(yú) RFamide 神經(jīng)肽的來(lái)源, 由腦部組織細(xì)胞分泌的RFa 神經(jīng)肽通過(guò)神經(jīng)纖維向下游傳遞。我們的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí), 小黃魚(yú)腦部細(xì)胞分泌的 RFamide 可能通過(guò)內(nèi)外細(xì)胞顆粒層和結(jié)締組織向下游傳遞。這說(shuō)明小黃魚(yú)腦組織中的NPFF 是由特定的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯, 但在翻譯成熟之后, NPFF 蛋白將轉(zhuǎn)運(yùn)至不同的區(qū)域發(fā)揮作用或進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。而在小黃魚(yú)卵巢中, 我們發(fā)現(xiàn) FaRPs蛋白的分布較為緊密, 與腦組織中的彌散分布有一定的差異。同時(shí)卵巢組織中FaRPs 蛋白主要存在于結(jié)締組織中, 這說(shuō)明LpNPFF 可能將信號(hào)傳遞給性腺組織,但 LpNPFF 蛋白并沒(méi)有進(jìn)入到細(xì)胞里面, 僅僅是充當(dāng)一種信號(hào)傳遞的中間媒介。因此, 這些神經(jīng)元群可能表達(dá)其他的 RFamide, 與已知的 FMRF 抗體的廣泛反應(yīng)性一致(Pinelli et al, 2000)。不同組織中NPFF 的不同分布情況預(yù)示著該蛋白具有不同的生物學(xué)功能,NPFF 除生殖調(diào)控之外, 可能作為一個(gè)神經(jīng)調(diào)質(zhì)調(diào)解小黃魚(yú)的更高級(jí)的生理活動(dòng), 例如攝食、免疫等。

4 結(jié)論

組織特異性分析結(jié)果顯示小黃魚(yú)神經(jīng)肽FF 基因在腦和性腺中表達(dá)含量較高, 肌肉和脾臟次之。原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, LpNPFF mRNA 主要分布于小黃魚(yú)的中腦(視葉)以及延腦, 端腦和小腦部分的表達(dá)較少。在中腦的視頂蓋(OTec)、圓環(huán)體(TL)、結(jié)節(jié)前核(NAT)、外側(cè)結(jié)節(jié)核(NLT)、下丘腦彌散核(NDLI)以及延腦(MO)中檢測(cè)到大量表達(dá)LpNPFF mRNA 的細(xì)胞,這可能與LpNPFF 調(diào)控著不同的生理學(xué)功能有關(guān)。并且在第Ⅱ期的卵巢細(xì)胞中也能觀察到明顯的陽(yáng)性信號(hào)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示, 小黃魚(yú)神經(jīng)肽FaRPs 的免疫陽(yáng)性信號(hào)主要集中于腦部細(xì)胞表層和卵巢壁細(xì)胞表層, 這與原位雜交的結(jié)果中LpNPFF 基因mRNA的分布形成呼應(yīng)。