＊李 麗

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院鎮(zhèn)江分院 鎮(zhèn)江高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 江蘇 212000）

引言

矢車菊素-3-葡萄糖苷（鹽酸鹽分子式C21H21O11Cl，CAS：7084-24-4，圖1）和矢車菊素-3-蕓香糖苷（鹽酸鹽分子式C27H31O15Cl，CAS：18719-76-1，圖2）屬于黃酮類物質(zhì)，在黑加侖、桑椹等植物產(chǎn)品中廣泛存在[1]。

圖1 矢車菊素-3-葡萄糖苷鹽酸鹽

圖2 矢車菊素-3-蕓香糖苷鹽酸鹽

對于桑椹紅作為食品著色劑的使用，GB1886.345-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 桑椹紅》[2]給出了兩種分子結(jié)構(gòu)式：矢車菊素-3-葡萄糖苷，[C21H21O11]+X-；矢車菊素-3-蕓香糖苷，[C27H31O15]+X-，其中X-為平衡離子。雖然C3G、C3R具有良好的健康功效[3]，但是在GB2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[4]的A.2表中，未將其列入可在各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用的食品添加劑范疇。A.1表只規(guī)定了果糕類、糖果等六類食品中允許添加桑椹紅色素。日常食用的風(fēng)味發(fā)酵乳并沒有在允許使用的品種之列。

目前，C3G和C3R的檢測有高效液相色譜法（HPLC）[5-7]和LC-MS/MS法。HPLC法屬于常規(guī)的定量方法，關(guān)注的是草莓、黑加侖等產(chǎn)品中這兩種化合物的含量，C3G和C3R的濃度相對較高易于測定。但HPLC測定C3G和C3R存在以下的缺陷：（1）參考國際通行的做法，對于禁用物質(zhì)的檢測，液相色譜的測定結(jié)果不易作為最終的判定依據(jù)，需要配合質(zhì)譜、紅外、拉曼、核磁等技術(shù)手段對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性或者更換不同的色譜柱予以確認(rèn)。（2）樣品前處理的方法或者色譜分離條件不適用于質(zhì)譜的分析。在上述HPLC方法中，樣品待測液中含有高濃度的無機(jī)酸（如磷酸）或者流動相中使用了鹽酸，無機(jī)酸的存在會嚴(yán)重污染或者損害質(zhì)譜檢測器。Janine M Cooney[8]等采用直接過SPE柱的方式，用LCMS/MS測定了尿液中C3G和C3R的含量，樣品基質(zhì)相對簡單，易于處理；Chunxia Yang等用LC-MS/MS測定了血清中C3G的含量，在樣品前處理過程中待測組分的損失較大，需要用槲皮素-3-葡萄糖苷作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，該方法能否適用風(fēng)味發(fā)酵乳的測定尚待評估。

針對風(fēng)味發(fā)酵乳中含有蛋白、糖、甜味劑、增稠劑、乳化劑等物質(zhì)的特點(diǎn)，本研究擬采用乙腈、甲醇、乙酸鉛、三氯乙酸等不同的溶液提取待測組分，并對其提取效率和凈化方法進(jìn)行評估和確認(rèn)，為風(fēng)味發(fā)酵乳中C3G和C3R的定性定量測定提供了技術(shù)方面的參考。

1.材料與方法

(1)儀器及試劑

Thermo TSQ Quantan Access液相色譜-串接質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源（ESI）和自動進(jìn)樣器，美國Finnigen公司）；XPE205電子天平（瑞士梅特勒公司）；3K15高速離心機(jī)（德國Sigma公司）。

甲醇、乙醇、正己烷（色譜純，德國Merck公司）；甲酸、氨水、乙酸鉛、三氯乙酸（分析純，上海國藥集團(tuán)）；實(shí)驗(yàn)用水采用高純水（美國Millipore公司）；水相膜（0.22μm，上海安譜公司）；Poly-Sery MCX固相萃取柱（500mg 6mL，上海安譜公司）；C3G標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 7084-24-4）、C3R標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 18719-76-1）（純度均大于≥98.0%，成都草源康生物科技有限公司）。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

①標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

稱取C3G和C3R標(biāo)準(zhǔn)品各5.0mg（±0.1mg）于15mL棕色玻璃瓶中，加入10.0mL水（含0.4%甲酸）溶解振蕩，配制成濃度為500mg/L的標(biāo)儲。冷凍（-18℃）密閉暗室保存。根據(jù)后續(xù)需要加0.2%甲酸水稀釋。

②制樣

取同一批次的風(fēng)味發(fā)酵乳4盒，用組織搗碎機(jī)混勻，待用。

③樣品前處理過程

A.提取待測組分。稱樣2.00g（±1.0mg）于15mL具塞離心管中，加10mL 10%三氯乙酸溶液渦旋10s，超聲處理8min。冷凍離心25min（8000r/min，R=8cm，-4℃），取上清液加3ml正己烷渦旋1min，離心3min，棄去正己烷層，水相待凈化。

B.凈化。Poly-Sery MCX柱先后用5mL甲醇、5mL 0.2%甲酸水清洗，保持柱床的濕潤。加入5mL提取液過柱。用5mL甲醇和5mL 0.2%甲酸水溶液清洗柱床。用洗耳球?qū)⒅泊蹈?，加?mL 15%氨水-甲醇洗脫，收集全部濾液氮吹至200μL左右，補(bǔ)加0.4%甲酸水至2.0mL，采用渦旋的方法再次溶解，過水相膜待測定。

(3)液相色譜-串接質(zhì)譜檢測條件

①液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18柱（150mm×2.1mm，3.5μm）；流動相C：乙醇（含0.05%甲酸），流動相D：水（含0.2%甲酸），流動相A：甲醇，梯度洗脫見表1。流速0.25mL/min；進(jìn)樣量20μL；室溫。

表1 色譜梯度洗脫條件

②質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)控（MRM）；噴霧電壓3800V；傳輸毛細(xì)管溫度400℃；輔助氣流量2.5mL/min；殼氣流量10mL/min。

2.結(jié)果與分析

(1)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

續(xù)表

將標(biāo)準(zhǔn)溶液配成10.0mg/L的濃度，在正離子模式下進(jìn)行母離子、子離子的優(yōu)化。C3G、C3R的監(jiān)測量離子對、能量、保留時間見表2。標(biāo)液的總離子流圖和質(zhì)譜見（圖3、圖4）。

圖3 C3G的總離子流圖和質(zhì)譜圖（濃度3.125μg/L）

表2 待測組分的質(zhì)譜參數(shù)、保留時間

圖4 C3R的總離子流圖和質(zhì)譜圖（濃度3.125μg/L）

(2)樣品提取和凈化條件的選擇

①在空白樣品中加入相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液情況下（50μg/kg），考察了0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸乙腈+甲醇（乙腈:甲醇=2:1，v/v）、20%乙酸鉛、三氯乙酸作為常用的蛋白沉淀劑的沉淀效果以及提取效率。用0.1%乙腈提取待測組分，沉淀效果好、上清液澄清，但是C3G、C3R的回收率分別只有63.1%和60.2%；用0.1%乙腈+甲醇提取待測組分，C3G、C3R的回收率分別為44.1%和25.2%；20%乙酸鉛的提取效率相對較差，C3G、C3R的回收率分別只有3.58%和4.52%，可能跟高濃度的乙酸鉛中的離子占據(jù)了MCX的吸附點(diǎn)位有關(guān)。低濃度的三氯乙酸沉淀效果不佳，會產(chǎn)生比較大基質(zhì)干擾，回收率偏高。經(jīng)綜合測試，采用10%的三氯乙酸處理樣品可以取得良好的效果。同等濃度的C3G加標(biāo)測定值的峰面積大小順序依次為：10%的三氯乙酸＞乙腈＞0.1%甲酸乙腈+甲醇＞20%乙酸鉛（圖5）；C3R的測定結(jié)果與C3G一致（圖6）。

圖5 四種溶劑處理加標(biāo)樣品后，C3G的總離子流圖

圖6 四種溶劑處理加標(biāo)樣品后，C3R的總離子流圖

②在色譜的分離階段，選擇了甲醇、0.05%甲酸甲醇、乙醇、0.05%甲酸乙醇作為洗脫溶液。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用甲醇洗脫C3G和C3R，會產(chǎn)生少量的柱殘留。采用0.05%甲酸乙醇洗脫待測組分，不僅可以消除柱殘留現(xiàn)象，也有利于待測組分響應(yīng)值的提高。

(3)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限和定量限

吸取100μL標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（1000μg/L）于900μL 0.2%甲酸水溶液中，渦旋混勻。再將混合溶液用0.2%甲酸水倍比稀釋至6個濃度：3.12μg/L、6.25μg/L、12.5μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L。以定量離子的峰面積為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。所得工作曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R2大于0.995（圖7、圖8）。

圖7 C3G標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（濃度3.12μg/L-100μg/L）

圖8 C3R標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（濃度3.12μg/L-100μg/L）

參照Eurachem的方法[8]，計算出這兩種化合物檢測方法的檢出限和定量限均為2.50μg/kg、5.00μg/kg。

(4)回收率及精密度

空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收檢測，添加水平：5.00μg/kg（LOQ）、10.0μg/kg（2×LOQ）、50.0μg/kg（10×LOQ），每個平行測定6次。C3G的加標(biāo)回收率為103%～115%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為4.17%～5.88%；C3R的加標(biāo)回收率為105%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差5.32%～6.07%。空白樣品、加標(biāo)樣品總離子流見（圖9、圖10）。

圖9 空白樣品的總離子流圖

圖10 發(fā)酵乳加標(biāo)樣品的總離子流圖（加標(biāo)濃度50.0μg/kg）

(5)樣品的篩查

原味、紅棗味等8份從隨機(jī)采購的發(fā)酵中都沒有檢出。

3.結(jié)論

風(fēng)味發(fā)酵乳經(jīng)三氯乙酸沉淀蛋白并提取純化，把色譜洗脫條件及儀器參數(shù)進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化后，建立了液-質(zhì)連用檢測C3G、C3R的檢測方案，應(yīng)用于市面上常見的發(fā)酵乳的檢測。所測的8份隨機(jī)購買的發(fā)酵乳，都沒有檢測出上述兩種物質(zhì)。該方法的建立為將來更加合理、科學(xué)地制定C3G、C3R的使用標(biāo)準(zhǔn)，防止該類色素的不規(guī)范使用，提供了技術(shù)支撐。