楊傳孝，龔未彬，唐 璠，孫向英

華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建 廈門 361021

引 言

多聚磷酸根、偏磷酸根、正磷酸根及核苷酸等均含磷酸根陰離子，其中核苷酸是生命體組成的重要成分并參與生命過程，多聚磷酸根、偏磷酸根、正磷酸根等是重要的化工原料，六偏磷酸鈉是常用的食品添加劑。因此，含磷酸根陰離子的檢測具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[1-2]。食品級六偏磷酸鈉(sodium hexametaphosphate,SHMP)是一種多聚磷酸鹽，是一種具有環(huán)狀和鏈狀結(jié)構(gòu)的混合物，對二價(jià)金屬離子 (如Ca2+) 具有較好的結(jié)合能力，其鏈狀結(jié)構(gòu)能保持其pH在一個(gè)穩(wěn)定的范圍。在食品、乳品、飲料及牙膏產(chǎn)品中加入SHMP，可以提高產(chǎn)品的持水性、結(jié)著性、防止脂肪氧化，提高果汁飲料的出汁率和黏度，抑制維生素C的分解、穩(wěn)定食品中的天然色素及色澤、保護(hù)牙齒免遭酸性飲料的侵蝕等[3-4]；在納米材料的制備過程中加入多聚磷酸鹽可以提高納米粒子的穩(wěn)定性及發(fā)光性能[5-6]。然而即使是食品級的SHMP，其中也含有微量的重金屬及氟化物，過量添加會破壞營養(yǎng)元素，嚴(yán)重危害人體的健康,我國對各類食品中六偏磷酸鈉的允許用量做了明確的規(guī)定[7](茶飲料中SHMP的最大使用量為0.5 g·kg-1)，因此建立一種快速檢測食品、飲料中SHMP含量的方法具有重要意義。目前,測定食品中磷酸鹽添加劑的方法有重量法、原子吸收光度法、離子色譜法及分光光度法等。其中重量法、原子吸收光度法、離子色譜法存在使用試劑種類多、操作繁瑣費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。而熒光[8-9]檢測六偏磷酸鈉具有較高靈敏度和選擇性。

聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)是一種水溶性陽離子聚合物，具有線狀和支鏈狀兩種結(jié)構(gòu)形式。其結(jié)構(gòu)中富含大量胺基，可通過氫鍵、配位、靜電作用等與其他物質(zhì)結(jié)合。Wen[10]等研究表明PEI能與曙紅(eosin Y,EY)通過靜電作用結(jié)合，導(dǎo)致EY的熒光顯著猝滅，當(dāng)十二烷基硫酸鈉存在時(shí)EY的熒光又得到恢復(fù)。在微波輔助條件下甲醛與PEI快速作用，生成物在紫外光照射下發(fā)藍(lán)色熒光。本研究表明該甲醛功能化的聚乙烯亞胺(formaldehyde functionalized polyethyleneimine,FPEI)保留了PEI的一些性質(zhì)，其表面殘留的胺基仍能與EY通過靜電作用結(jié)合形成基態(tài)復(fù)合物，導(dǎo)致EY的熒光顯著猝滅。在酸性介質(zhì)中，SHMP可以阻礙EY與 FPEI的結(jié)合，從而抑制EY熒光強(qiáng)度的降低，而FPEI本身的熒光強(qiáng)度變化不大，可以作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。由此構(gòu)筑比率熒光體系(圖1)，構(gòu)建EY/FPEI比率熒光探針，并成功用于飲料中 SHMP 的檢測。該方法選擇性好、操作簡單、快速，測定結(jié)果令人滿意。

圖1 FPEI/EY與SHMP作用示意圖Fig.1 Scheme of the reaction between FPEI/EY and SHMP

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary Edipse型熒光分光光度計(jì)，安捷倫科技(中國)有限公司；Nicolet Magna IR560型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司)，H-7650型透射電鏡(日本Hitachi公司)，UV-2800H紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)，Milli-Q超純水(美國Millipore公司)，WX-4000微波消解儀(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司)，WFH手提式紫外分析儀(杭州齊威儀器有限公司)。

聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine,PEI,分子量為10 000)，阿拉丁試劑有限公司；甲醛溶液(37.0%～40.0%,西隴化工股份有限公司)；曙紅(Eosin Y,EY)，西隴化工股份有限公司，溶液濃度為1.0×10-4mol·L-1；六偏磷酸鈉(sodium hexametaphoshate,SHMP)，廣東光華化學(xué)廠有限公司，溶液濃度為1.0×10-5mol·L-1。試劑均為AR級，實(shí)驗(yàn)使用超純水,電阻為18.2 MΩ。

1.2 方法

準(zhǔn)確移取聚乙烯亞胺溶液 (8.539×10-3g·mL-1)10 mL，甲醛溶液1.0 mL，乙酸溶液0.4 mL加去離子水至15 mL。在溫度120 ℃，壓力10 atm，功率600 W的條件下，微波消解30 s獲得FPEI備用。

將FPEI原液稀釋200倍制備操作溶液。在10 mL比色試管中依次加入0.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 3.93)，1.0 mL FPEI操作溶液，適量的SHMP標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，0.2 mL濃度為 1.0×10-4mol·L-1的EY，用超純水定容至5.0 mL。于Cary Edipse熒光分光光度計(jì)上，340 nm光激發(fā)，掃描360～650 nm 波長范圍的熒光發(fā)射光譜,并記錄位于470和540 nm處的熒光強(qiáng)度。直接把樣品置于365 nm紫外燈下，用數(shù)碼相機(jī)拍攝熒光成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 FPEI/EY與六偏磷酸鈉作用的光譜特征

如圖2所示，在微波輔助條件下，甲醛功能化的PEI在350 nm處出現(xiàn)新的紫外吸收峰，其電鏡圖表明FPEI具有明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2，插圖)。激發(fā)波長在320～420 nm范圍內(nèi)，隨著激發(fā)波長的增加FPEI熒光發(fā)射峰的峰位逐漸紅移，在激發(fā)波長為340 nm時(shí)，F(xiàn)PEI的熒光激發(fā)峰位于470 nm處，紫外燈下發(fā)藍(lán)色熒光，在FPEI相同激發(fā)條件下，EY的熒光發(fā)射峰位于540 nm處[圖3(a，線2)]。與FPEI和EY的熒光發(fā)射光譜相比，F(xiàn)PEI/EY比率熒光發(fā)射光譜[圖3(a，線3)]中540 nm處EY的熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著降低，而470 nm處FPEI的熒光強(qiáng)度卻變化不大，此時(shí)熒光顏色以FPEI為主。

圖2 FPEI的紫外-可見吸收光譜和在不同激光波長下的熒光發(fā)射光譜Fig.2 UV-Vis absorption and Fluorescence emission spectra of FPEI under different excitation wavelengths

如圖3(b)所示，隨著SHMP的量增加，F(xiàn)PEI/EY比率熒光體系在540 nm處熒光強(qiáng)度逐漸增加，而470 nm處的熒光強(qiáng)度卻基本不變，540和470 nm處熒光強(qiáng)度的比值(F540/F470)與SHMP的濃度呈較好的線性關(guān)系[圖3(b，內(nèi)插圖)]。在紫外燈照射下，可以明顯看出，隨著SHMP的量增加體系熒光由藍(lán)色逐漸變?yōu)榫G色。

圖3 PFEI/EY光譜(a)與SHMP作用(b)的熒光光譜濃度:EY：4.0 μmol·L-1;FPEI,1.0 mL;pH 3.93;λex=340 nmFig.3 Fluorescence spectra of the reaction between FPEI/EY (a) and SHMP (b)Concentration:EY：4.0 μmol·L-1;FPEI,1.0 mL;pH 3.93;λex=340 nm

2.2 FPEI/EY與六偏磷酸鈉的作用機(jī)理

曙紅 Y(H2L)在水溶液中的離解常數(shù)為pKa1=2.6和pKa2=3.6，可以預(yù)測當(dāng)pH>3.6時(shí)EY主要存在形式是L2-。而FPEI的紅外吸收光譜[圖4(a)]保留了N—H的伸縮振動(dòng)(波數(shù)為3 349和3 278 cm-1)、N—H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)(波數(shù)為1 580 cm-1)、—CH2—的伸縮振動(dòng)(波數(shù)為2 933和2 813 cm-1)、C—N的伸縮振動(dòng)(波數(shù)為1 042和1 105 cm-1)等PEI的紅外特征峰，同時(shí)在1 662 cm-1產(chǎn)生了新峰，表明甲醛的羰基基團(tuán)與—NH2之間發(fā)生了Schiff堿反應(yīng)，進(jìn)而形成具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的化合物。在酸性條件下，F(xiàn)PEI表面殘留的—NH2基和—NH基質(zhì)子化，通過靜電引力與EY的生色團(tuán)和熒光團(tuán)上帶負(fù)電荷的羥基氧原子作用，形成了FPEI/EY基態(tài)復(fù)合物導(dǎo)致EY熒光猝滅，遵從靜態(tài)猝滅機(jī)理。加入SHMP前后EY吸收光譜的變化可以證明FPEI/EY基態(tài)復(fù)合物的形成，如圖4(b)所示。另一方面，甲醛與PEI交聯(lián)生成的FPEI具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且具有熒光特性，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)可以有效減少EY 的稠環(huán)芳烴和 FPEI分子內(nèi)烷基鏈的疏水作用，使得EY只存在于FPEI分子的表面，因此FPEI/EY基態(tài)復(fù)合物的形成對FPEI的熒光發(fā)射影響較小。當(dāng)有SHMP存在時(shí)，由于SHMP與FPEI表面質(zhì)子化氨基的靜電作用強(qiáng)于EY，因而SHMP可以阻止FPEI/EY基態(tài)復(fù)合物的形成，致使EY吸光度[圖4(b)]及熒光[圖3(b)]逐漸恢復(fù)。

圖4 FPEI的紅外吸收光譜(a)及FPEI/EY與SHMP作用的吸收光譜(b)Fig.4 FTIR spectra of FPEI (a) and absorption spectra of the reaction between FPEI/EY and SHMP (b)

2.3 條件優(yōu)化

2.3.1 激發(fā)波長的選擇

如圖5所示，F(xiàn)PEI和EY的熒光發(fā)射強(qiáng)度與激發(fā)光波長有關(guān)，F(xiàn)PEI的最大激發(fā)峰位于350 nm處。在激發(fā)波長位于320～340 nm時(shí)，540 nm處EY的熒光強(qiáng)度基本不變。當(dāng)激發(fā)波長大于340 nm時(shí)，540 nm處EY的熒光強(qiáng)度迅速降低。考慮到FPEI/EY比率熒光體系熒光比色的需要，本研究選擇激發(fā)光波長為340 nm。

圖5 激發(fā)光波長對熒光強(qiáng)度的影響FPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1;pH 3.93Fig.5 Effect of excitation wavelength on the fluorescence intensityFPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1;pH 3.93

2.3.2 溶液pH的影響

pH值對FPEI/EY復(fù)合物470 nm處的熒光強(qiáng)度基本沒有影響，但對于540 nm處的熒光強(qiáng)度影響較大，隨著pH值的不斷增加，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，當(dāng)pH值大于5.5后趨于穩(wěn)定。如圖6所示，加入SHMP前后，pH對于FPEI/EY復(fù)合物540和470 nm處的熒光強(qiáng)度的比值(F540/F470)的影響基本一致，均隨pH的增加逐漸增加。但是，加入SHMP前后F540/F470增加的程度(ΔF540/F470)卻隨pH的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，pH在3.9左右時(shí)體系F540/470增強(qiáng)的程度達(dá)到最大，因此本研究用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液控制體系的pH為3.90左右。

圖6 pH對FPEI/EY與SHMP作用的影響FPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1; SHMP：4 μmol·L-1;λex=340 nmFig.6 Effect of pH on the reaction between FPEI/EY and SHMPFPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1; SHMP：4 μmol·L-1;λex=340 nm

2.3.3 甲醛加入量的影響

FPEI表面殘留的氨基對FPEI/EY基態(tài)復(fù)合物的形成有較大的影響，如圖7所示。隨著甲醛(37.0%～40.0%)加入量的增加，F(xiàn)PEI/EY復(fù)合物位于540 nm處的熒光強(qiáng)度有逐漸增強(qiáng)的趨勢，當(dāng)甲醛加量大于2.0 mL時(shí)熒光強(qiáng)度又緩慢降低。研究表明540 nm處的熒光增強(qiáng)與SHMP間的線性范圍及靈敏度均隨著甲醛加入量的增加而增加，當(dāng)甲醛(37.0%～40.0%)加入量大于1.0 mL時(shí)其線性范圍及靈敏度又逐漸減少。這充分說明了甲醛越多FPEI的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越多、其表面的活性基團(tuán)減少，F(xiàn)PEI與EY間的疏水作用和靜電作用減弱，有利于FPEI/EY復(fù)合物與SHMP作用。但是甲醛加入量太多FPEI表面的質(zhì)子化氨基太少，又會導(dǎo)致FPEI表面結(jié)合的EY的量減少，因而線性范圍及靈敏度逐漸減少。本研究用1.0 mL甲醛(37.0%～40.0%)合成FPEI。

圖7 甲醛對SHMP增強(qiáng)EY熒光的影響FPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1; SHMP：2.4 μmol·L-1;pH 3.93Fig.7 Effect of formaldehyde on the fluorescence increasing of EY by SHMPFPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1; SHMP：2.4 μmol·L-1;pH 3.93

2.3.4 EY加入量的影響

考察了一定量的FPEI與不同濃度的EY形成的FPEI/EY復(fù)合物與SHMP作用，如圖8和表1所示。加SHMP前后FPEI/EY復(fù)合物F540/F470值隨著EY濃度的變化趨勢一致，即F540/F470值隨著EY濃度的增大而增加(圖8)。表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著EY濃度的增大FPEI/EY復(fù)合物的比率熒光與SHMP作用的線性范圍有逐漸增大的趨勢。當(dāng)EY濃度小于4.0 μmol·L-1時(shí)，隨著EY濃度的增大FPEI/EY比率熒光測定SHMP的靈敏度(線性擬合曲線的斜率)增加較快，而當(dāng)EY濃度大于4.0 μmol·L-1時(shí)FPEI/EY比率熒光測定SHMP的靈敏度增加變緩。因此，本研究選擇濃度為4.0 μmol·L-1的EY與FPEI作用形成FPEI/EY復(fù)合物。

圖8 EY對FPEI/EY與SHMP作用的影響FPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1;SHMP：2.4 μmol·L-1; λex=340 nm；pH 3.93Fig.8 Effect of EY on the reaction between FPEI/EY and SHMPFPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1;SHMP：2.4 μmol·L-1; λex=340 nm；pH 3.93

表1 EY加入量對分析測定參數(shù)的影響Table 1 Effect of EY on analytical parameters for determination

2.4 共存物質(zhì)的干擾

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品分析

在上述最優(yōu)條件下，考察了FPEI/EY復(fù)合物與不同濃度SHMP作用的線性關(guān)系，如圖9和表2所示。與540 nm處的熒光增強(qiáng)與SHMP濃度的線性關(guān)系相比較，可以看出比率熒光法(F540/F470)獲得的線性相關(guān)系數(shù)(R2)、線性范圍和檢出限均有明顯提高，這是因?yàn)楸嚷薀晒夥梢杂行П苊夤庠床环€(wěn)定等因素對熒光強(qiáng)度的影響，可有效提高測定的準(zhǔn)確度。將三種飲料(茉莉清茶、冰紅茶、冰綠茶)稀釋10倍后用本方法進(jìn)行測定，結(jié)果如表3所示。對樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在95.0%～108.3%之間，說明運(yùn)用比率熒光法測定飲料中六偏磷酸鈉的結(jié)果滿意。

圖9 540 nm熒光強(qiáng)度及F540/F470與不同濃度SHMP間的關(guān)系FPEI：1.0 mL;pH 3.93,λex=340 nmFig.9 Plots of fluorescence intensity at 540 nm and F540/F470 via the concentrations of SHMPFPEI：1.0 mL;pH 3.93,λex=340 nm

表2 分析測定參數(shù)Table 2 Analytical parameters for determination

表3 飲料中SHMP的測定結(jié)果Table 3 Results for the determination of SHMP in drink samples

3 結(jié) 論

在微波輔助條件下，成功合成了發(fā)藍(lán)色熒光的 FPEI，基于FPEI表面氨基與EY的生色基團(tuán)和熒光基團(tuán)作用形成FPEI/EY基態(tài)復(fù)合物，發(fā)展了一種FPEI/EY雙熒光體系比率熒光法測定SHMP的新方法，該法具有靈敏度高、反應(yīng)快、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)際飲料中 SHMP的分析檢測。