劉雪梅，王曉琳，仇增鳳，王亞東，張 斌，徐 超，尹洪宗

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018

引 言

廣義上定義小分子為分子量不大于500的分子[1]，但關(guān)于小分子一直都沒有比較科學(xué)和確定的定義，如在化學(xué)方面，即分子量很小的天然化合物；在生物方面，小分子是具有生物學(xué)意義的一類物質(zhì)。由以上定義可知，人體中存在著無數(shù)小分子，其對維持生命體健康有著重要的意義[2]。

在生物體中，小分子物質(zhì)具有非常小的分子量，某些小分子具有一定的生物活性，例如激素[3-4]。同時，伴隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，環(huán)境和食品安全都已經(jīng)成為社會嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。在環(huán)境檢測中，特殊小分子的檢測正成為環(huán)境及食品安全檢測的重要指標(biāo)[5]。目前檢測小分子的傳統(tǒng)技術(shù)有色譜法、光譜法等，傳統(tǒng)的技術(shù)方法通常存在以下缺點：樣品處理周期長﹑檢測儀器昂貴、不能實時快速檢測[6]。而部分光譜分析法，未能對分子間的相互作用及其作用動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行有效的采集。表面等離子體共振技術(shù)(SPR)具有靈敏度高、所需試樣少、能夠?qū)崟r檢測等優(yōu)點，可以實現(xiàn)小分子的準(zhǔn)確快速檢測，彌補傳統(tǒng)檢測方法的缺點。目前基于SPR技術(shù)的小分子檢測技術(shù)的研究報道比較少，本文系統(tǒng)的綜述了表面等離子體共振技術(shù)對小分子檢測的研究進(jìn)展，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 SPR傳感器檢測原理

由于SPR具有靈敏度高、所需試樣少、能夠?qū)崟r檢測等優(yōu)點，越來越引起分析學(xué)者的重視。目前SPR技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于生物學(xué)、化學(xué)等不同領(lǐng)域，并隨著技術(shù)的發(fā)展不斷改進(jìn)[7]。在實際應(yīng)用方面，SPR技術(shù)通常用于檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、抗原抗體之間、受體與配體之間的相互作用[8]，其檢測的原理如圖1(a)所示，當(dāng)入射光線從光密介質(zhì)照射到光疏介質(zhì)時會發(fā)生光的反射與折射，當(dāng)入射角達(dá)到一定角度時，折射角成90°，折射在界面會發(fā)生全反射現(xiàn)象，即所有能量轉(zhuǎn)移到反射光線上。因為入射光線是先移動半個波長才發(fā)生的反射進(jìn)入光密介質(zhì)，同時在光疏介質(zhì)產(chǎn)生的振幅隨著與界面距離的增加而呈指數(shù)形式衰減的消逝波[9][如圖1(b)所示]。因為消逝波的強度與滲透距離成反比，所以SPR的滲透距離一般約為幾百納米[8]。SPR用于分子相互作用檢測機理研究選用一對相互作用的分子，其中一種分子連接在芯片上，另一種分子流經(jīng)SPR芯片的表面，若兩種分子發(fā)生相互作用，則溶液中的分子會結(jié)合在芯片表面，使界面厚度發(fā)生改變，從而引起折射率的改變，進(jìn)而引起SPR譜線的變化[如圖1(c)所示]。因此利用SPR傳感技術(shù)可以很好地應(yīng)用于小分子的檢測以及分子與分子之間相互作用機理的研究。本文將從SPR免疫傳感器(直接檢測法、“三明治”法、競爭檢測法以及抑制檢測法)，分子印跡SPR傳感器以及其他基于SPR技術(shù)的傳感器三個框架入手，系統(tǒng)的綜述SPR技術(shù)應(yīng)用于小分子檢測的研究進(jìn)展。

圖1 (a) FT-SPR生物傳感器原理示意圖;(b) 反射光譜的共振位移示意圖；(c) SPR信號隨時間變化示意圖Fig.1 (a) Schematic diagram of FT-SPR biosensor;(b) Schematic diagram of resonance displacement of reflection spectrum; (c) Schematic diagram of SPR signal changing with time

2 SPR檢測小分子的研究方法

2.1 SPR免疫傳感器

SPR免疫傳感器主要包含四種方法，分別為直接檢測法、“三明治”法、抑制型以及競爭型[10]，SPR免疫傳感器主要利用了抗原抗體的結(jié)合，通過信號的變化來檢測待測物濃度。檢測原理如圖2(a,b,c,d)所示。

圖2 (a) 直接檢測法原理圖，(b) “三明治”法原理圖，(c) 免疫抑制法原理圖，(d) 免疫競爭法原理圖Fig.2 (a) Direct detection method image,(b) Sandwich method image,(c) immunosuppression image,(d) competitive immunoassay image

2.1.1 直接檢測法

直接檢測法是直接檢測目標(biāo)抗原與抗體的結(jié)合能力，通過信號變化得出待測物濃度，這種方法簡單快捷[11]，直接檢測法一般用于大分子的檢測。由于檢測小分子時SPR響應(yīng)信號弱，限制了SPR儀器的靈敏度，甚至部分小分子檢測時未能達(dá)到儀器檢測限[12]，最近幾年，研究人員通過方法的改進(jìn)實現(xiàn)了直接檢測小分子。

Wang等[12]利用典型的四環(huán)素小分子，制備出抗四環(huán)素適配體(具有更好的親和力)，從而提高了靈敏度，達(dá)到了直接檢測的目的；Abdullah S等[13]利用金納米顆粒(AuNPs)修飾的SPR生物傳感芯片上接生物聚合物卡拉膠(κCarr)，AuNPs-κCarr能夠提供檢測Pb(II)離子的活性位點，實現(xiàn)對Pb(Ⅱ)離子的檢測，且有較高的靈敏度(1.3535×10-6nm)，線性響應(yīng)為R2=0.972 2；Dong等[14]將對磺化亞硝基芳烴(PSC4)作為百草枯(PQ)的識別分子，由于PQ可以誘導(dǎo)PSC4-AuNPs的聚集，在SPR芯片上形成分析物誘導(dǎo)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顯著提高了檢測的靈敏度，檢出限為2.2 pmol·L-1；Yao等[15]利用適配體技術(shù)設(shè)計了一種無酶SPR傳感系統(tǒng)，并在表面修飾了金納米顆粒以增強其靈敏度，用來特異性的檢測腺苷，其檢出限低；Shim等[16]利用SPR傳感技術(shù)用直接檢測法測定了幾種小分子環(huán)肽與人血清蛋白(HSA)的結(jié)合常數(shù)，通過對不同肽段檢測的實驗分析將結(jié)構(gòu)變化與結(jié)合常數(shù)聯(lián)系起來；Laia等[17]通過SPR傳感器手段檢測河豚毒素，最低檢測量0.43 mg·kg-1，低于規(guī)定要求的最高含量2 mg·kg-1；Urusov等[18]使用BSA與赭曲霉素A合成的抗原作為固定相通過生物偶聯(lián)法固定在納米金表面，然后合成凝膠金納米顆粒，使用膠體金納米顆粒結(jié)合抗體增敏的SPR傳感器檢測限為0.06 ng·mL-1；Liu等[22]利用SPR直接檢測法定量檢測小分子核酸，通過共振角度的改變可以準(zhǔn)確的檢測到表面結(jié)合位點被覆蓋的情況。

綜上所述，雖然小分子直接檢測所引起的SPR信號較弱，但隨著技術(shù)的改進(jìn)，利用直接檢測法檢測小分子越來越普遍，例如利用傳感器增敏的方式來提高SPR信號。該方法多利用制備適配體來提高親和力，從而增強其靈敏度，運用制備的納米金顆粒等增強靈敏度[20]。此類方法通常利用金納米材料具有良好的表面等離子體共振效應(yīng)來實現(xiàn)檢測信號的放大，最終通過信號的增敏實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的檢測[21]。

2.1.2 “三明治”法

“三明治”法是通過連接兩種抗原最終實現(xiàn)抗體的檢測。此方法檢出限及特異性都得到了有效的提高，通常用來檢測不只一種抗原結(jié)合位點的物質(zhì)[22]。傳統(tǒng)的“三明治”法一般用于大分子的檢測[23]。但隨著技術(shù)的發(fā)展，人們通過技術(shù)的改進(jìn)及增敏材料的引入同樣實現(xiàn)了小分子的檢測，且獲得了很好的效果。

Melaine等[24]從大量的DNA和RNA中提取出與目標(biāo)物有親和力的短寡核苷酸，通過篩選并設(shè)計出對目標(biāo)物具有親和性能的適配體并將其切成兩部分，利用“三明治”法對目標(biāo)物進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與原始的單鏈相比，這種方法在沒有損失親和力的情況下實現(xiàn)了目標(biāo)物的檢測；Li等[25]設(shè)計了一種基于兩層氧化石墨烯金納米顆粒復(fù)合材料的多功能增敏SPR生物傳感器，用于檢測小分子腺苷和RNA，實現(xiàn)了雙放大策略，獲得檢測限為0.1 fmol·L-1短寡核苷酸；Zeidan等[26]通過納米材料對SPR傳感器增敏，利用夾心法對磷酸緩沖溶液中孕酮的含量進(jìn)行了測定，檢出限達(dá)到了5 nmol·L-1。Hu等[27]利用氧化石墨烯設(shè)計了雙重信號放大的傳感器，通過“三明治”法檢測聚多巴胺，檢出限低至500 pg·mL-1。

綜上所述，利用“三明治”法檢測小分子，通常適配體的親和性能以及通過結(jié)合納米材料的增敏作用達(dá)到增敏的效果。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，通過氧化石墨烯進(jìn)行增敏的效果尤為明顯，主要由于氧化石墨烯具有表面積大且富含有羥基、羧基、環(huán)氧基等官能團，使其具有良好的生物相容性。

2.1.3 抑制型檢測法

抑制型檢測首先已知抗體的濃度并與待測物混合，將混合溶液通過已經(jīng)修飾待測物的傳感器芯片，混合液中未結(jié)合的游離抗體會與芯片上的待測物結(jié)合，最終根據(jù)檢測機理建立檢測信號的變化值與待測物的濃度成反比關(guān)系，此方法可以用于小分子物質(zhì)的檢測[28]。抑制型檢測法用來檢測小分子具有靈敏度高的優(yōu)勢，通?？蓱?yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、食品檢測等領(lǐng)域[29]。

Cao等[30]利用SPR抑制免疫定量測定E2，使用BSA-E2為偶聯(lián)物，通過偶聯(lián)物的主氨基與琥珀酰亞胺基(NHS)在金表面形成硫醇-NHS單分子層而引入的反應(yīng)，固定化到SPR芯片上，自由E2分子與芯片表面的BSA-E2競爭單克隆抗E2抗體提供的結(jié)合位點，結(jié)果表明，抗體對BSA-E2偶聯(lián)物的結(jié)合親和力隨著BSA-E2偶聯(lián)物表面覆蓋度的降低而增加。Li等[31]通過利用金納米顆粒制備傳感器，通過抑制檢測法檢測缺血修飾白蛋白，檢出限小于5.0 ng·L-1，與其他方法相比具有檢出限低，操作簡便等優(yōu)點。

2.1.4 競爭型檢測法

競爭型檢測機理是通過競爭關(guān)系來實現(xiàn)目標(biāo)分析物的檢測方法。其實驗流程是將大分子的分子物通過生物偶聯(lián)的方法共價結(jié)合在傳感器芯片上，然后通入待測物質(zhì)，讓兩種物質(zhì)通過對抗體的競爭來實現(xiàn)的檢測方法。此方法得到的信號變化與待測物濃度成反比，通常可用小分子物質(zhì)的檢測[32]。但是將競爭法應(yīng)用于大分子目標(biāo)分析物檢測時會面臨信號變模糊的缺點。

Cao等[33]將一種用于識別的同質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)與具有競爭性的葉酸(FA)檢測的靶修飾金納米顆粒(Au NPs)相結(jié)合，通過與功能化Au NPs競爭表面結(jié)合位點，可以定量測定溶液中游離FA，而且證明，通過降低FA共軛Au NPs的濃度，可以將動態(tài)范圍從微摩爾降低到納摩爾，從而將檢測限降低到2.9 nmol·L-1；Moon J等[34]將半胱氨酸蛋白G、黃曲霉毒素B1 (AFB1)以及牛血清蛋白(BSA)修飾于SPR芯片，然后將樣品溶液與AFB1-BSA偶聯(lián)物按順序流到Au芯片上，利用競爭性免疫分析實現(xiàn)對AFB1的檢測，檢出限達(dá)到2.51 μg·L-1，這種方法也可用于食品中霉菌毒素的檢測；Luo等[35]用單鏈DNA適配體和未修飾的AuNPs來修飾傳感器，用小分子競爭性結(jié)合引起的AuNPs聚合及其相應(yīng)的適配體作為檢測指標(biāo)來檢測小分子物質(zhì)，靈敏度大幅度增加，并且還可以通過將不同的適配體與AuNPs結(jié)合，很容易地用于其他小分子的檢測，例如氨芐青霉素；Yockell-Lelievre等[36]利用金納米顆粒和競爭法，簡單地直接比較了SPR和LSPR傳感器對睪酮的檢測，發(fā)現(xiàn)SPR比較適合于寬范圍檢測，LSPR比較適合較低濃度下檢測；Hirofumi Kawazumi等[37]設(shè)計了一種多通道小型SPR傳感器并利用間接競爭法同時檢測了苯并[a]芘和2-羥基聯(lián)苯兩種物質(zhì)，檢測靈敏度達(dá)到μg·L-1的水平，與傳統(tǒng)的SPR檢測方法相當(dāng)；Noemídelos-Santosálvarez等利用SPR作為轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)通過競爭檢測法檢測新霉素B，得到了10 nmol·L-1～100 μmol·L-1的定量范圍，證明了用高靈敏度適配體檢測小分子的可行性[38]。

2.2 分子印跡法

分子印跡技術(shù)又稱為分子烙印技術(shù)，其檢測原理常被稱為“鑰匙”和“鎖”的關(guān)系[39]。傳感器檢測原理：首先利用模板分子制備分子印跡聚合物(MIP)，然后進(jìn)行洗脫，即在聚合物上留下特定的“空穴”，相當(dāng)于“鎖”。而目標(biāo)分子相當(dāng)于開這把“鎖”的鑰匙，能夠與MIP完全匹配，從而達(dá)到檢測的目的。此方法可以有效檢測小分子物質(zhì)，其檢測原理如圖3所示。

圖3 分子印跡法原理圖Fig.3 Image of molecular imprinting

由于分子印跡法具有良好的特異性，近幾年來利用此方法來實現(xiàn)小分子檢測的研究報道較多。Jun Matsui等[40]在芯片上制備了金納米顆粒的分子印跡聚合物凝膠，測定了對多巴胺響應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)SPR信號明顯增強；Mehmet Lütfi Yolaa等[41]構(gòu)建了以丁胺卡那霉素分子印跡聚合物為特異性識別元件的MIP-SPR傳感器，檢測人體血漿中抗生素丁胺卡那霉素的含量，傳感器對目標(biāo)物質(zhì)的檢測限為0.002 5 μg·mL-1(4.3×10-9mol·L-1)，在丁胺卡那霉素濃度為0.01～0.15 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；Zhang等[42]利用分子印跡法制備了SPR傳感器來檢測卡那霉素，卡那霉素印跡傳感器線性范圍為1.0×10-7～1.0×10-5mol·L-1(R2=0.994 1)，與非印跡傳感器相比，該傳感器對卡那霉素有更好的印跡效果和選擇性；有報道[43]將鐵納米顆粒引入到分子印跡聚合物的合成中，搭建了MIP-SPR傳感器用于尿酸的檢測，傳感器在尿酸濃度為0.5～40 μg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測限為0.247 μg·mL-1；Jiang等[44]使用旋涂法將引發(fā)劑包覆在45 nm的SPR金納米層表面，放置在混合溶液中，65 ℃條件下孵化16 h，干燥后分子印跡聚合物包覆在金片表面，制成分子印跡聚合物表面等離子體共振(MIP-SPR)傳感器，作為特異性識別元件來特異性檢測組胺，實驗對比了不同濃度比的分子印跡聚合物性能，發(fā)現(xiàn)組胺∶甲基丙烯酸(MAA)∶乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDM)物質(zhì)量比為1∶2∶4時SPR信號響應(yīng)最大，并對比了分子印跡聚合物與非分子印記聚合物(NIP)，用來觀察特異性，發(fā)現(xiàn)MIP-SPR傳感器對組胺檢測的SPR信號響應(yīng)約為NIP-SPR對組胺的5倍，制備的MIP-SPR傳感器檢測限為25 ng·mL-1，在25～1 000 nm·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，成功完成了組胺的高靈敏度特異性檢測；有報道在光纖未包覆的芯上涂覆一層銀膜來制備探針，然后在光纖芯上進(jìn)一步涂覆以三聚氰胺為模板分子的分子印跡聚合物(MIP)，產(chǎn)生結(jié)合位點，檢測了濃度范圍為10-7～10-1mol·L-1的三聚氰胺，發(fā)現(xiàn)該傳感器具有響應(yīng)速度快和靈敏度高等特點；Tan等[45]在SPR芯片上修飾了對硫磷甲基(PM)印跡聚合膜檢測PM，發(fā)現(xiàn)其具有較高的靈敏度，檢出限為10-13mol·L-1。

2.3 其他檢測方法

除了以上所述的免疫傳感法和分子印跡法之外，人們還用了很多其他的方法來檢測小分子物質(zhì)，例如Stefan Schmieder等[46]利用一次性、注塑成型的傳感器芯片/微流體混合和橫向成像光學(xué)系統(tǒng)，并行分析三個一維斑點陣列，利用改進(jìn)后的緊湊型SPR生物傳感器平臺，成功地開發(fā)一種利用固定在SP芯片上的LNA探針檢測miRNA-93的方法，并對其進(jìn)行了增敏，使檢出限達(dá)到了1 fmol·L-1；Kyaw等[47]設(shè)計出一種電場輔助SPR系統(tǒng)，通過監(jiān)測信號位移的時間動態(tài)，獲得了較高的系統(tǒng)靈敏度。該方法利用基于離子在水中遷移率的理論模型，討論了離子沉積動力學(xué)，在施加適當(dāng)?shù)牧r，目標(biāo)離子根據(jù)目標(biāo)溶液的離子濃度、離子質(zhì)量和流速堆積到傳感器表面，此方法可以檢測到水中目標(biāo)鎘離子(Cd2+)且檢測范圍很廣，從mg·L-1到μg·L-1；Patil等[48]利用SPR技術(shù)和分子對接技術(shù)的聯(lián)合，對人體的酪氨酸酶小分子進(jìn)行了篩選和檢測，研究發(fā)現(xiàn)這種方法可用于快速篩選和優(yōu)化各種先導(dǎo)化合物作為人酪氨酸酶活性的結(jié)合劑、抑制劑和調(diào)節(jié)劑等；Wang等[49]利用SPR光譜和電化學(xué)結(jié)合的方法，通過在SPR金膜上催化金屬離子沉積來檢測生物小分子，并以抗壞血酸介導(dǎo)的銀在金膜上沉積為例進(jìn)行了檢測，通過SPR的信號變化反映出金膜上沉積的銀原子的量，而銀原子的量又可以反映抗壞血酸的濃度，抗壞血酸的檢測濃度為2×10-5～1×10-3mol·L-1。

表1 不同檢測方法的檢測性能Table 1 Performance of different detection methods

3 結(jié) 論

小分子檢測對于人類的身體健康、食品安全及生存環(huán)境安全都有重要的意義。目前常規(guī)的小分子檢測技術(shù)如色譜技術(shù)、光譜法等，都存在自身的缺點。如色譜技術(shù)的樣品前處理復(fù)雜而且需要根據(jù)不同的目標(biāo)分析物選擇不同檢測器類型。而傳統(tǒng)的光譜法無法實現(xiàn)對分子之間的相互作用及結(jié)合動力學(xué)參數(shù)的測定。作為SPR生物傳感器在檢測小分子時，由于小分子的分子量較小，通過SPR生物傳感器直接進(jìn)行檢測引起的信號變化非常小，因此很難通過此方法實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的檢測。

針對上述問題，系統(tǒng)地綜述了幾種檢測小分子的SPR生物傳感的器構(gòu)建、檢測原理及在實際檢測中的應(yīng)用。通過綜述相關(guān)文獻(xiàn)，對比其他檢測方法，SPR生物傳感器具有操作簡便，不需要提前處理樣品、檢出限低、無需標(biāo)記、能夠?qū)崿F(xiàn)實時監(jiān)測等優(yōu)點，但該技術(shù)仍然存在需要改進(jìn)的地方，例如增強傳感器穩(wěn)定性﹑進(jìn)一步提高靈敏度﹑實現(xiàn)多通道法檢測等。在儀器性能改進(jìn)方面，通過對傳感器的儀器硬件及增敏材料的研發(fā)，增強傳感器的檢測限及儀器靈敏度。在研究生物小分子代謝方面，建立血液及代謝分子的快速檢測方法。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，分子水平上研究小分子間的相互作用對于研究分子在生命體中的機理具有重要的意義，而SPR生物傳感器的優(yōu)點恰好彌補了其他檢測技術(shù)的短板，相信隨著芯片制備技術(shù)和檢測技術(shù)進(jìn)一步的提升，SPR生物傳感技術(shù)在分子檢測及生命分析中會有更顯著的進(jìn)展。