陳 蓓，馬 榮，陳能斌，周德潤，王湛鈞

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830011

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所，上海 200437

3.上海市中醫(yī)藥研究院，中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所，上海 200437

4.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237

銀翹散出自清代吳塘所著的《溫病條辨》，為辛涼解表的代表方劑，其主要功用為辛涼透表、清熱解毒，是臨床上治療流行性感冒的常用中醫(yī)藥方劑。銀翹散原方由連翹（30 g）、金銀花（30 g）、桔梗（18 g）、薄荷（18 g）、淡竹葉（12 g）、荊芥穗（12 g）、淡豆豉（15 g）、牛蒡子（18 g）、生甘草（15 g）為散，以鮮蘆葦根煎湯服用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，銀翹散能夠降低流感病毒感染小鼠死亡率及肺部病毒載量、延長小鼠生存周期[1-2]。在胸腺缺陷小鼠 [T 細(xì)胞缺陷，自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞正常] 模型中，NK 細(xì)胞活性在流感病毒感染后第1 天顯著升高，第3、5、7 天明顯降低；銀翹散各劑量組NK 細(xì)胞活性在流感病毒感染后第3、5、7 天較模型組有明顯提高[3]。本課題前期研究表明，在SCID 小鼠（T 和B 淋巴細(xì)胞缺陷，NK細(xì)胞活性較正常小鼠高）模型中，NK 細(xì)胞活性在流感病毒感染第3 天開始降低；經(jīng)銀翹散治療后，NK 細(xì)胞活性有所提高，并且各劑量組間體現(xiàn)出一定的量效關(guān)系[4]，同時(shí)銀翹散還能夠增強(qiáng)抗病毒免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞及因子水平[5-6]。

對(duì)于不同的免疫狀態(tài)，流感病毒均能使NK 細(xì)胞活性呈現(xiàn)降低趨勢，而銀翹散能夠翻轉(zhuǎn)這種免疫狀態(tài)，增強(qiáng)NK 細(xì)胞的免疫功能。為此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將流感病毒感染的NK 細(xì)胞作為研究模型，通過君、臣、佐、使的拆方研究，明確銀翹散發(fā)揮抗病毒及免疫增強(qiáng)作用的主要藥物，為銀翹散在臨床中的精簡應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中藥抗流感病毒方劑的現(xiàn)代化研究提供研究思路。

1 材料

1.1 藥品與試劑

金銀花（批號(hào) 1410001W）、連翹（批號(hào)1409002W）、薄荷（批號(hào)1408001S）、牛蒡子（批號(hào)1411002W）、淡豆豉（批號(hào)1410001W）、荊芥穗（批號(hào)1408001S）、桔梗（批號(hào)1410002S）、蘆葦根（批號(hào)1407001W）、淡竹葉（批號(hào)14109001S）和生甘草（批號(hào)1411003S），均為配方顆粒，購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司。本實(shí)驗(yàn)中使用的藥物劑量均參照方劑中的臨床劑量，將生藥劑量折算為顆粒劑的用量，并將臨床劑量按照體表面積等效劑量轉(zhuǎn)換法，換算為小鼠劑量，并按照臨床配伍比例配伍使用。故本研究中各藥物的小鼠劑量為金銀花0.44 g/kg、連翹0.22 g/kg、薄荷0.22 g/kg、牛蒡子0.132 g/kg、淡豆豉0.11 g/kg、荊芥穗0.088 g/kg、桔梗0.264 g/kg、蘆葦根0.11 g/kg、淡竹葉0.088 g/kg、生甘草0.367 g/kg。各拆方組中藥味的劑量與其在全方中的劑量相同。銀翹散和各拆方分別按照方劑配伍比例將各藥物配方顆粒混合后，均以高純水溶解，用于小鼠ig 給藥。將銀翹散和臣藥中使用的配方顆粒分別按照方劑配伍比例混合后，溶于高純水，0.22 μm 微孔濾膜濾過后作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用儲(chǔ)備液。利巴韋林顆粒（批號(hào)140920），購自四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司。FITC-Ly-49D、PE-Ly-49H、FITC-CD3e、PE-CD49b 和Alexa Fluor 647-NKp46抗體，均購自BD Pharmingen 公司。紅細(xì)胞裂解液和4%多聚甲醛溶液，購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4 周齡SPF 級(jí)ICR 和C57BL/6J 小鼠，雌性，體質(zhì)量13～15 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)為IACUC-20140214009。小鼠飼養(yǎng)于生物安全實(shí)驗(yàn)室（ABSL-2）動(dòng)物室，室內(nèi)溫度26 ℃，濕度（60±5）%，且12 h 明暗交替，正常飲食、飲水。小鼠給藥體積為0.2 mL/10 g。

1.3 病毒

小鼠流感病毒A/Puerto Rico/8/1934（PR8，H1N1 型），由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生物安全實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)雞胚傳代使用。將雞胚中獲得的病毒原液用生理鹽水稀釋600 倍，作為工作液，用于小鼠感染實(shí)驗(yàn)。

人流感病毒A/Hong Kong/8/68（HK8，H3N2型）購自美國ATCC（VR-1679?），經(jīng)犬上皮細(xì)胞MDCK 傳代后保存為病毒原液。

1.4 細(xì)胞株

人自然殺傷細(xì)胞NK-92MI，購自美國ATCC（CRL-2408TM）。細(xì)胞以α-MEM（無核糖核苷和脫氧核糖核苷）培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加0.2 mmol/L肌醇、0.1 mmol/L β-巰基乙醇和0.02 mmol/L 葉酸，含12.5%馬血清和12.5%胎牛血清。細(xì)胞置于37 ℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)。銀翹散和臣藥對(duì)該細(xì)胞的劑量分別為銀翹散50 μg/mL，臣藥100 μg/mL。劑量經(jīng)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)（CCK-8 法）檢測獲得，為藥物在NK-92MI 細(xì)胞中的最高無毒劑量。

1.5 儀器

FACS Calibur 流式細(xì)胞儀，美國Beckman-Coulter 公司。EG1160 包埋機(jī)，德國Leica 公司；H93/RM2126 切片機(jī)，德國Leica 公司；ECLIPSE LV100POL/50IPOL 光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組、小鼠肺炎模型的制備及給藥

將ICR 和C57BL/6J 小鼠分別隨機(jī)分為對(duì)照組、模型（PR8 病毒感染）組、銀翹散組（3.09 g/kg）、君藥（金銀花、連翹）組（1.00 g/kg）、臣藥（薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荊芥穗）組（0.83 g/kg）、佐藥（桔梗、蘆葦根、淡竹葉）組（0.70 g/kg）和使藥（生甘草）組（0.56 g/kg）、陽性藥物（利巴韋林）組（82.5 mg/kg）。ICR 小鼠每組10 只，C57BL/6J 小鼠每組3 只。將小鼠乙醚淺麻醉后，用PR8 病毒工作液滴鼻感染小鼠，30 μL/只，對(duì)照組小鼠滴鼻感染等體積的生理鹽水。PR8 病毒感染后1 h 按照組別分別ig 給藥。

2.2 小鼠肺質(zhì)量抑制率的檢測

各組ICR 小鼠給藥后第5 天，稱體質(zhì)量，ip 氯胺酮（100 mg/kg）麻醉后45 min，脫頸椎處死，摘取肺臟并稱質(zhì)量。計(jì)算肺指數(shù)（肺質(zhì)量/體質(zhì)量）和肺質(zhì)量抑制率。

肺質(zhì)量抑制率＝(對(duì)照組小鼠肺質(zhì)量－各藥物組小鼠肺質(zhì)量)/(對(duì)照組小鼠肺質(zhì)量－模型組小鼠肺質(zhì)量)

2.3 肺臟病理檢測（HE 染色）

將各組ICR 小鼠肺臟固定于4%多聚甲醛溶液中24 h。組織浸于液體石蠟，然后進(jìn)行包埋、切片和貼片。切片置于60 ℃環(huán)境中烘烤1 h，經(jīng)脫蠟處理后，依次進(jìn)行蘇木素染色和伊紅染色。切片于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 肺臟NK 細(xì)胞Ly-49D 和Ly-49H 受體含量的檢測

各組C57BL/6J 小鼠給藥后第5 天，ip 氯胺酮（100 mg/kg）麻醉后45 min，脫頸椎處死，摘取肺臟，制備單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后，每只小鼠取1×107個(gè)細(xì)胞，以FITC-Ly-49D 抗體（1.5 μL/500 μL體系）和PE-Ly-49H 抗體（2.5 μL/500 μL 體系）4 ℃共同孵育30 min，400×g離心10 min。取沉淀，用2 mL PBS 洗一遍，400×g離心10 min。將細(xì)胞沉淀用400 μL 2%多聚甲醛固定。采用流式細(xì)胞儀檢測NK 細(xì)胞表面激活性受體Ly-49D、Ly-49H 的含量。同時(shí)設(shè)置Ly-49D、Ly-49H 抗體的同型對(duì)照組。

2.5 肺臟NK 細(xì)胞NKp46 受體的檢測

各組C57BL/6J 小鼠給藥后第5 天，ip 氯胺酮（100 mg/kg）麻醉后45 min，脫頸椎處死，摘取肺臟，制備單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后，每只小鼠取1×107個(gè)細(xì)胞，以FITC-CD3e（1.5 μL/500 μL 體系）、PE-CD49b（2.0 μL/500 μL 體系）和Alexa Fluor 647-NKp46（2.0 μL/500 μL 體系）抗體4 ℃共同孵育30 min，400×g離心10 min。取沉淀，用2 mL PBS洗一遍，400×g離心10 min。將細(xì)胞沉淀用400 μL 2%多聚甲醛固定。采用流式細(xì)胞儀檢測NK 細(xì)胞毒性受體NKp46 的含量。同時(shí)設(shè)置NKp46 抗體的同型對(duì)照組。

2.6 H3N2 流感病毒感染NK-92MI 細(xì)胞模型的制備及藥物干預(yù)

將NK-92MI 細(xì)胞接種于6 孔板。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型（H3N2 感染）組、銀翹散組和臣藥組，每組3 個(gè)復(fù)孔。將H3N2 病毒原液以無血清培養(yǎng)基稀釋82.5 倍，作為病毒工作液。以病毒工作液培養(yǎng)NK-92MI 細(xì)胞6 h，1.5 mL/孔；對(duì)照組以等體積不含病毒的培養(yǎng)基培養(yǎng)。補(bǔ)加完全培養(yǎng)基1.5 mL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)16 h。銀翹散組和臣藥組分別加入銀翹散和臣藥儲(chǔ)備液，使質(zhì)量濃度分別為50、100 μg/mL；對(duì)照組加入等體積的高純水。藥物作用10 h。

2.7 NK-92MI 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

收集“2.6”項(xiàng)中的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，分離并純化mRNA，構(gòu)建cDNA 文庫，然后采用Illumina 測序平臺(tái)（Illumina HiSeqTM2500）對(duì)文庫進(jìn)行測序（上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）。對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0 軟件中單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)流感病毒感染小鼠肺炎的抑制作用

流感病毒PR8 的感染使得小鼠體質(zhì)量下降、肺臟質(zhì)量增加，進(jìn)而肺臟指數(shù)顯著高于正常小鼠（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥物利巴韋林、銀翹散、君藥（金銀花、連翹）、臣藥（薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荊芥穗）、佐藥（桔梗、蘆葦根、淡竹葉）和使藥（甘草）均能夠降低由流感病毒引起的肺指數(shù)增加；其中利巴韋林、銀翹散和臣藥能夠顯著抑制肺指數(shù)的增加（P＜0.05、0.01）；且臣藥組對(duì)肺炎的抑制作用略優(yōu)于銀翹散組。結(jié)果見表1。

表1 銀翹散及其拆方對(duì)流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響(±s,n=10)Table 1 Effect of YQS and its recipes on lung index of mice infected with PR8 virus (±s,n=10)

表1 銀翹散及其拆方對(duì)流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響(±s,n=10)Table 1 Effect of YQS and its recipes on lung index of mice infected with PR8 virus (±s,n=10)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) 肺指數(shù) 肺質(zhì)量抑制率/%對(duì)照 － 0.74±0.05 －模型 － 1.51±0.15## －利巴韋林 0.082 5 1.01±0.16** 65.05銀翹散 3.09 1.33±0.11* 23.86君藥 1.00 1.37±0.17 17.91臣藥 0.83 1.25±0.16* 33.41佐藥 0.70 1.45±0.17 8.24使藥 0.56 1.37±0.15 18.17

通過以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利巴韋林和銀翹散臣藥的藥效優(yōu)于銀翹散全方，故針對(duì)對(duì)照組、模型組、利巴韋林組和臣藥組小鼠的肺臟進(jìn)行了病理分析。肺臟病理檢測（HE 染色）顯示，對(duì)照組小鼠肺臟可見清晰肺泡；肺泡、支氣管內(nèi)無任何細(xì)胞浸潤，支氣管壁絨毛排列整齊。模型組小鼠（PR8 流感病毒感染）肺泡腔縮小，甚至塌陷，支氣管中可見白細(xì)胞聚集，支氣管壁絨毛細(xì)胞排列雜亂。經(jīng)利巴韋林和臣藥治療的小鼠肺臟仍可見大量完好的肺泡，支氣管壁絨毛排列整齊，白細(xì)胞浸潤減少；利巴韋林組肺泡內(nèi)仍可見因紅細(xì)胞從血管漏出引起的水腫。見圖1。

3.2 對(duì)流感病毒感染小鼠肺臟NK 細(xì)胞激活性受體Ly-49D、Ly-49H 含量的影響

與正常C57BL/6J 小鼠相比，PR8 流感病毒感染小鼠后使NK 細(xì)胞激活性受體Ly-49D、Ly-49H在肺臟的含量顯著降低（P＜0.01）。經(jīng)利巴韋林、銀翹散、君藥、臣藥、佐藥和使藥治療后，各組小鼠肺臟2 種受體含量均明顯增加，除佐藥組外，與模型組相比，其余各組差異顯著（P＜0.05、0.01），見表2。結(jié)果顯示，各藥物誘導(dǎo)2 種受體表達(dá)的作用由強(qiáng)到弱依次為臣藥＞使藥＞銀翹散＞君藥＞佐藥。各組小鼠肺臟NK 細(xì)胞激活性受體Ly-49D和Ly-49H 流式圖見圖2。

圖1 臣藥對(duì)流感病毒PR8 感染小鼠肺臟病理的影響 (HE 染色，×200)Fig.1 Effect of Ministerial drug on pulmonary pathology in mice infected with influenza virus PR8 (HE staining,× 200)

表2 銀翹散及其拆方對(duì)流感病毒感染小鼠肺臟NK 細(xì)胞激活性受體Ly-49D、Ly-49H 含量的影響 (±s,n=3)Table 2 Effects of YQS and its recipes on content of Ly-49D and Ly-49H in lungs of mice infected with PR8 virus(±s,n=3)

表2 銀翹散及其拆方對(duì)流感病毒感染小鼠肺臟NK 細(xì)胞激活性受體Ly-49D、Ly-49H 含量的影響 (±s,n=3)Table 2 Effects of YQS and its recipes on content of Ly-49D and Ly-49H in lungs of mice infected with PR8 virus(±s,n=3)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) Ly-49D+/% Ly-49H+/% Ly-49D+Ly-49H+/%對(duì)照 － 5.07±0.10 4.82±0.89 2.71±0.54模型 － 0.74±0.35## 1.27±0.17## 0.43±0.21##利巴韋林 0.082 5 4.57±0.51** 4.40±0.83** 2.67±0.34**銀翹散 3.09 3.17±0.23** 2.59±0.84 1.55±0.51*君藥 1.00 2.47±0.24** 2.23±0.48* 1.30±0.38*臣藥 0.83 3.39±0.46** 3.07±0.09** 1.71±0.12**佐藥 0.70 2.57±1.20 2.43±1.01 1.36±0.61使藥 0.56 2.97±0.52** 3.05±0.46** 1.70±0.29**

圖2 各組小鼠肺臟NK 細(xì)胞激活性受體Ly-49D 和Ly-49H 流式圖Fig.2 Flow diagram of NK cell activating receptors Ly-49D and Ly-49H in mouse lung of each group

3.3 對(duì)流感病毒感染小鼠肺臟NK 細(xì)胞毒性受體NKp46 含量的影響

實(shí)驗(yàn)中首先分選出CD3e 陰性（CD3e-）細(xì)胞，即排除T 淋巴細(xì)胞。在CD3e-細(xì)胞群中，CD49b陽性（CD49b+）的細(xì)胞即為NK 細(xì)胞。NKp46 是NK 細(xì)胞表面的1 個(gè)激活性受體，主要介導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)。正常C57BL/6J 小鼠肺臟表達(dá)一定量的NKp46 受體。當(dāng)PR8 流感病毒感染C57BL/6J 小鼠后，小鼠肺臟NK 細(xì)胞表面NKp46 受體的含量出現(xiàn)減少的現(xiàn)象。通過小鼠肺臟NK 細(xì)胞激活性受體L49D/H 的檢測對(duì)各藥物活性進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)臣藥的藥效最好，因此選擇臣藥和銀翹散進(jìn)一步進(jìn)行小鼠肺臟NK 細(xì)胞毒性受體NKp46 含量的檢測。經(jīng)銀翹散和臣藥治療的PR8 病毒感染小鼠，NKp46 受體含量均高于模型組，且臣藥組效果優(yōu)于銀翹散組?？共《娟栃运幬锢晚f林不能改善因病毒感染引起的肺臟NK 細(xì)胞NKp46 受體含量減少的現(xiàn)象（圖3）。

圖3 銀翹散及其拆方對(duì)流感病毒PR8 感染小鼠肺臟NK 細(xì)胞細(xì)胞毒性受體NKp46 含量的影響 (±s,n=3)Fig.3 Effect of YQS and its recipes on expression of cytotoxic receptor NKp46 in pulmonary NK cells of mice infected with influenza virus PR8 (±s,n=3)

3.4 對(duì)流感病毒感染自然殺傷細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

3.4.1 主成分分析和聚類分析 主成分分析能有效展示基因表達(dá)差異對(duì)樣本的影響；基因表達(dá)相似的樣本距離近，說明樣本相似。聚類分析通過計(jì)算樣本之間的距離，考察樣本之間的相似性。如圖4 所示，對(duì)照組、模型組、臣藥組和銀翹散組，同一組別的樣本距離相近，不同組之間在距離上能夠區(qū)分開來；不同處理方法引起NK-92MI 細(xì)胞mRNA 表達(dá)不同。

3.4.2 差異基因GO 富集分析 在得到差異基因后，從分子和細(xì)胞水平，根據(jù)基因的功能，將功能相似的基因富集為一類。目前GO 分析有3 個(gè)亞類，包括生物過程（如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）、分子功能（如酶活性）和細(xì)胞成分（如核糖體）。每個(gè)亞類根據(jù)功能不同劃分出不同條目。在GO 富集分析中，在差異最顯著的前30 條上調(diào)基因條目中，銀翹散組和臣藥組有16個(gè)條目相同；相同條目中，臣藥組上調(diào)基因不僅涵蓋了銀翹散組中表達(dá)上調(diào)的基因，而且上調(diào)基因種類比銀翹散組更廣泛。具體條目和基因名稱見表3和圖5。在相同上調(diào)基因中，DDIT3、JUN、FOS、EGR1、EGR2、ATF、AREG、TNFAIP3、PPP1R15A、ZFP36L110 個(gè)基因出現(xiàn)頻次較高，這些基因主要參與細(xì)胞生長和凋亡過程。不同上調(diào)基因條目見表4。

圖4 H3N2 流感病毒感染NK-92MI 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)主成分分析 (A) 及聚類分析 (B)Fig.4 Principal component analysis (A) and cluster analysis (B) of cell transcriptome data of NK-92MI infected with H3N2 influenza virus

表3 GO 富集分析中臣藥和銀翹散組相同上調(diào)的基因Table 3 Same up-regulated genes in Ministerial drug and YQS group based by GO enrichment analysis

圖5 銀翹散和臣藥組相同上調(diào)基因條目中基因維恩圖Fig.5 Venn diagram of genes in same up-regulated genes items of Ministerial drug and YQS groups

表4 GO 富集分析中銀翹散和臣藥組不同上調(diào)基因條目Table 4 Different up-regulated gene entries in Ministerial drug and YQS groups based on GO enrichment analysis

在GO 富集分析的下調(diào)基因條目中，臣藥組富集到30 個(gè)條目，銀翹散組僅富集到10 個(gè)條目，具體基因條目見表5。其中僅nucleus 條目與臣藥組相同，臣藥下調(diào)該條目中的51 個(gè)基因（FOXD4L1、EID3、SSH3、CCNE1、CENPBD1、SYCP3、PER3、CDKN2C、HSPA1B、PHF13、HEXIM1、FIGNL2、TREX2、ZNF296、ZBED1、UBC、H2AFX、CBX2、NFKBIE、RBM14、TUBB2A、HSPA5、TUBB4B、FEN1、FBXO43、FAM71F2、CABYR、EID2B、TEF、GADD45B、ATF5、BCL9L、CEMIP、MYLK2、ZCCHC5、PHF7、SERTAD3、FOXD2、FOXD4、TUBA1C、IMP3、TIGD1、TIGD3、TIGD4、TBR1、FOXJ1、DYRK3、ZFC3H1、UTP3、RARG、HIST1H2AG），銀翹散僅下調(diào)該條目中的5 個(gè)基因（FOXD4L1、EID3、SSH3、TRIM22、AKAP17A）。

3.4.3 差異基因KEGG 富集分析 利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行信號(hào)通路（pathway）分析，可以找到富集差異基因的pathway 條目，尋找不同樣本的差異基因可能與哪些通路的改變有關(guān)。在富集的差異最顯著的前20（Top 20）條信號(hào)通路中，銀翹散組和臣藥組有13 條通路重合，見表6。相同信號(hào)通路所涉及到的上調(diào)基因，臣藥組基本囊括了銀翹散組的上調(diào)基因，且臣藥組上調(diào)的基因數(shù)目比銀翹散組多（圖6）。臣藥和銀翹散組富集到的不同信號(hào)通路見表7。

在KEGG 富集到的Top 20 下調(diào)信號(hào)通路中，銀翹散組僅富集到17 條信號(hào)通路；其中，僅necroptosis信號(hào)通路同時(shí)被銀翹散和臣藥調(diào)節(jié)，見表8。

表5 GO 富集分析中銀翹散和臣藥組下調(diào)基因條目Table 5 Down-regulated gene entry in Ministerial drug and YQS groups based on GO enrichment analysis

表6 KEGG 富集分析中銀翹散和臣藥組相同上調(diào)信號(hào)通路及基因Table 6 KEGG enrichment analysis of same up-regulated signal pathways and genes in Ministerial drug and YQS groups

圖6 銀翹散和臣藥組相同上調(diào)信號(hào)通路中基因的維恩圖Fig.6 Venn diagram of genes in same up-regulated signal pathway of Ministerial drug and YQS groups

表7 KEGG 富集分析中銀翹散和臣藥組不同上調(diào)信號(hào)通路Table 7 Different up-regulated signal pathways in Ministerial drug and YQS groups based on KEGG enrichment analysis

表8 KEGG 富集分析中銀翹散和臣藥組下調(diào)信號(hào)通路（前20）Table 8 Down-regulated signal pathways (Top 20) in Ministerial drug and YQS groups based on KEGG enrichment analysis

4 討論

本研究顯示，銀翹散及其拆方治療病毒性肺炎藥效強(qiáng)度為臣藥＞銀翹散＞使藥＞君藥＞佐藥，藥效強(qiáng)度并非與君、臣、佐、使的中藥配伍理論完全一致。金銀花和連翹為君藥，疏散風(fēng)熱、清熱解毒、避穢化濁；臣藥薄荷和牛蒡子疏散風(fēng)熱、清利頭目、解毒利咽，荊芥穗和淡豆豉發(fā)散解表；佐藥淡竹葉、蘆葦根清熱生津，桔梗宣肺止咳；生甘草調(diào)和諸藥，又合桔梗利咽止咳，為佐使之用[7]。從銀翹散的方解可以看出，金銀花和連翹的功效相當(dāng)于現(xiàn)代藥理學(xué)中抗病毒、抗菌的作用，而解熱作用略微。薄荷、牛蒡子、荊芥穗和淡豆豉構(gòu)成的臣藥組，其功效涵蓋了現(xiàn)代藥理學(xué)的解熱、抗病毒、抗菌的作用。淡竹葉、蘆葦根和桔梗都有解熱作用，桔梗還具有鎮(zhèn)咳的作用[8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明生甘草的作用較為廣泛，包括免疫增強(qiáng)、抗病毒、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰等作用[9-10]。采用現(xiàn)代藥理學(xué)方法對(duì)中藥復(fù)方的配伍進(jìn)行探究，能夠明確各配伍組分對(duì)復(fù)方整體藥效的貢獻(xiàn)程度。

NK 細(xì)胞在清除流感病毒中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人類NK 細(xì)胞表面存在2 類受體：激活性受體（killer activating receptor，KAR）和抑制性受體（killer inhibiting receptor，KIR），它們分別介導(dǎo)NK 細(xì)胞的激活和抑制。與人類NK 細(xì)胞相似，小鼠NK 細(xì)胞表面也存在這2 類受體。研究證實(shí)[11]，小鼠感染流感病毒后，Ly-49 抑制性受體（Ly-49I 和Ly-49Q）缺陷的小鼠比野生型小鼠存活時(shí)間更長；而當(dāng)回補(bǔ)表達(dá)Ly-49I 和Ly-49Q 受體后，小鼠又恢復(fù)了對(duì)流感病毒的敏感性。提示NK 細(xì)胞參與流感病毒的疾病過程，Ly-49 受體直接參與了NK 細(xì)胞清除流感病毒的免疫應(yīng)答效應(yīng)。

Ly-49 基因家族受體主要表達(dá)在小鼠NK 細(xì)胞，是C 型凝集素超家族成員之一。Ly-49D 是Ly-49 家族中第一個(gè)被證實(shí)傳遞激活性信號(hào)的蛋白分子[12-13]，屬于KAR 類受體，Ly-49D 受體介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)是促進(jìn)NK 細(xì)胞活化，進(jìn)而促使NK 細(xì)胞發(fā)揮殺傷效應(yīng)。PR8 流感病毒感染顯著下調(diào)Ly-49D 受體介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[14]。

Ly-49H是Ly-49 家族的另一個(gè)激活性受體，其激活效應(yīng)由NK 細(xì)胞表面的跨膜接頭蛋白DAP12（DAP12 的胞質(zhì)域含有免疫受體酪氨酸激活基序）介導(dǎo)。Ly-49H 的抗病毒效應(yīng)最早發(fā)現(xiàn)于小鼠巨細(xì)胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）。表達(dá)Ly-49H 受體的轉(zhuǎn)基因小鼠更不易感染MCMV[15]。當(dāng) Ly-49H-DAP12 受體復(fù)合物突變的小鼠感染MCMV 時(shí)，脾臟病毒滴度增加30～40 倍，肝臟病毒滴度增加2～5 倍，且肝臟NK 細(xì)胞產(chǎn)生γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的比例降低了（56.00±0.22）%，說明Ly-49H的正常活化對(duì)抑制MCMV具有重要作用[16]。有研究還發(fā)現(xiàn)，Ly-49H 受體表達(dá)呈陽性的NK 細(xì)胞會(huì)在小鼠淋巴組織和非淋巴組織存在數(shù)月；在MCMV 感染小鼠的恢復(fù)期，當(dāng)再次感染MCMV 時(shí)，Ly-49H 受體表達(dá)呈陽性的NK 細(xì)胞會(huì)被重新激活，并迅速發(fā)生脫顆粒、釋放細(xì)胞因子[17]。這打破了人們對(duì)NK 細(xì)胞在傳統(tǒng)意義上的認(rèn)識(shí)：NK細(xì)胞不僅參與抗病毒反應(yīng)的固有免疫應(yīng)答，而且同樣參與了獲得性免疫應(yīng)答。關(guān)于Ly-49H 受體在流感病毒中的作用，目前還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中，PR8 流感病毒的感染使Ly-49H 受體在肺臟的含量降低，經(jīng)抗病毒藥物利巴韋林和銀翹散及其拆方（臣藥、使藥、君藥和佐藥）治療后，Ly-49H受體含量均升高；而且，這些藥物對(duì)流感病毒PR8感染引起的小鼠肺炎有抑制作用。上述藥物對(duì)肺炎的抑制作用和對(duì)肺臟中Ly-49D、Ly-49H 含量的促進(jìn)作用基本一致，其作用強(qiáng)度均為臣藥＞銀翹散/使藥＞君藥＞佐藥。說明上述藥物對(duì)病毒性肺炎的抑制作用越強(qiáng)，NK 細(xì)胞激活性受體（L-49D和Ly-49H）在肺臟中的含量也越高。

NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)是NK 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的重要途徑，該效應(yīng)主要由細(xì)胞毒性受體介導(dǎo)。人類主要有3 種細(xì)胞毒性受體：NKp30、NKp44 和NKp46。小鼠NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)由NKp46 介導(dǎo)；小鼠的NKp46 又稱作NCR1（natural cytotoxicity receptor 1）。NKp46 識(shí)別流感病毒血凝素[18]，使NK細(xì)胞能夠識(shí)別病毒感染的細(xì)胞，進(jìn)而損傷靶細(xì)胞，防止流感病毒感染宿主細(xì)胞[19]。有研究者采用綠色熒光蛋白（green fluorescent proteins，GFP）報(bào)告基因標(biāo)記的NKp46 受體示蹤NK 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在小鼠感染流感病毒PR8 后的5 d 內(nèi)，肺臟、血液、脾臟和骨髓均觀察到GFP，且肺臟中GFP 數(shù)量最多，感染第5 天的數(shù)量高于前4 d；并證明NKp46 對(duì)于體內(nèi)流感病毒的清除發(fā)揮了關(guān)鍵作用[20]。本研究中，小鼠肺臟中NKp46 受體因感染PR8 流感病毒含量降低，銀翹散和臣藥均能增加NKp46 受體的含量，這可能是銀翹散和臣藥抑制小鼠感染PR8病毒引起肺炎的作用途徑之一。

本研究分別從藥效學(xué)（肺質(zhì)量抑制率）和作用機(jī)制（NK 細(xì)胞激活性受體和細(xì)胞毒性受體）2 方面證實(shí)：銀翹散中臣藥（薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荊芥穗）的藥效與銀翹散全方相似，且略優(yōu)于銀翹散。這為銀翹散的精簡提供了現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)，臣藥可以作為一個(gè)獨(dú)立的復(fù)方用于流感病毒引起的感冒的治療。為了進(jìn)一步探究臣藥優(yōu)于銀翹散的原因，本實(shí)驗(yàn)建立了人流感病毒HK8 感染人NK 細(xì)胞株NK-92MI 的細(xì)胞模型，分別以銀翹散和臣藥進(jìn)行干預(yù)，分析藥物對(duì)NK 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響。

銀翹散顯著上調(diào)的基因在臣藥組也同樣顯著上調(diào)；且很多基因在臣藥治療后上調(diào)，而銀翹散不能顯著上調(diào)這些基因（圖5）。如對(duì)細(xì)胞表面成分的影響，銀翹散上調(diào)6 個(gè)基因（VCAM1、SLC3A2、HRG、AREG、KCNE2、SLC7A11），而臣藥同時(shí)還上調(diào)VEGFA、HBEGF、TIGIT3 個(gè)基因。T 細(xì)胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸基抑制基序結(jié)構(gòu)域（ T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain，TIGIT）是一種新型的抑制性受體，在T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞上均有表達(dá)。TIGIT 編碼的蛋白有助于輔助性T 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞之間的相互作用，以調(diào)節(jié)T 細(xì)胞依賴的B細(xì)胞的反應(yīng)。TIGIT 雖被定義為抑制性受體，但研究表明，NK 細(xì)胞上TIGIT 受體表達(dá)陽性的野生型小鼠對(duì)各種刺激的反應(yīng)增強(qiáng)，而TIGIT 受體缺陷會(huì)損害 NK 細(xì)胞的“missing-self”識(shí)別功能。TIGIT-CD155 信號(hào)通路能夠使NK 細(xì)胞更好地作為效應(yīng)細(xì)胞參與到免疫應(yīng)答反應(yīng)中，而這一通路是不依賴于主要組織相容性復(fù)合體 I （ major histocompatibility complex I，MHC I）類分子的新的NK 細(xì)胞激活的途徑[21]。

再如有關(guān)分子功能的“RNA polymerase II regulatory region sequence-specific DNA binding”條目，銀翹散顯著上調(diào)4 個(gè)基因（EGR1、ATF3、NR4A2、NR4A3），而臣藥除上調(diào)這4 個(gè)基因外，同時(shí)還上調(diào)GLIS1、CREBRF、BCL6、CREM、FOSL2、ARID5B6 個(gè)基因。如 cAMP 反應(yīng)元件調(diào)節(jié)子（cAMP responsive element modulator，CREM）編碼的蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合病毒中的環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）響應(yīng)元件，而且它是細(xì)胞因子生成重要的調(diào)節(jié)因子[22]。FOS 相關(guān)抗原2（Fos-related antigen 2，F(xiàn)OSL2）編碼的蛋白是亮氨酸拉鏈蛋白，它可以與JUN 家族的蛋白形成二聚體，從而形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，主要參與細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)。研究報(bào)道，F(xiàn)OSL2是一個(gè)新穎的參與NK 細(xì)胞成熟和功能發(fā)揮的轉(zhuǎn)錄因子[23]。富含AT 序列的相互作用結(jié)構(gòu)域蛋白5B（AT-rich interactive domain-containing protein 5B，ARID5B）的編碼產(chǎn)物是DNA 結(jié)合蛋白，它是一個(gè)富含AT 的結(jié)構(gòu)域。研究顯示，降低NK-92MI 細(xì)胞中ARID5B的表達(dá)，會(huì)引起細(xì)胞中線粒體氧化代謝損傷和電子傳遞鏈相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步表現(xiàn)出細(xì)胞生存受損和IFN-γ 生成減少；相反，過表達(dá)ARID5B后，NK-92MI 細(xì)胞氧化代謝和IFN-γ 的生成均增加[24]。對(duì)于GO 分析中富集到的下調(diào)基因，臣藥富集到30 個(gè)條目，銀翹散僅富集到10 個(gè)條目（表5）；說明臣藥對(duì)NK 細(xì)胞的作用位點(diǎn)遠(yuǎn)多于銀翹散。

在KEGG 富集分析的TOP20 上調(diào)信號(hào)通路中，臣藥和銀翹散有13 條信號(hào)通路相同，且臣藥上調(diào)的基因不僅包含銀翹散上調(diào)的基因，還富集到其他基因（圖6）。另外，對(duì)于相同信號(hào)通路，臣藥和銀翹散也出現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)方式。如雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路，銀翹散對(duì)該通路表現(xiàn)為顯著上調(diào)（表7），而臣藥對(duì)該通路表現(xiàn)為顯著下調(diào)（表8）；且富集到的基因也不同，銀翹散上調(diào)SESN2、SGK1、SLC3A23 個(gè)基因，臣藥下調(diào)FZD2、TNF、WNT10B3 個(gè)基因。

由此推測臣藥和銀翹散在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)NK 細(xì)胞中基因的調(diào)節(jié)作用相似，但臣藥的作用更為廣泛。臣藥的調(diào)節(jié)作用不僅涵蓋了銀翹散的全部作用，涉及到的作用點(diǎn)還比銀翹散更為廣泛，這或許是臣藥藥效與銀翹散相似的一個(gè)重要原因。

綜上所述，本研究首先從藥效學(xué)和效應(yīng)相關(guān)機(jī)制證明，對(duì)于流感病毒感染小鼠引起的肺炎，臣藥的治療作用與銀翹散相似，且略優(yōu)于銀翹散；并證明該藥效與NK 細(xì)胞活性增強(qiáng)相關(guān)。進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析得知，臣藥對(duì)NK 細(xì)胞中基因的調(diào)節(jié)作用比銀翹散更為廣泛。本研究為銀翹散的拆方研究提供研究思路，亦為其組分臣藥作為一個(gè)獨(dú)立的復(fù)方、替代銀翹散用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突