李振 陳結(jié)梅 劉賢釗 譚麗容 孫紅梅

摘要：建立木耳多糖新的測定方法，比較不同品種及產(chǎn)地木耳多糖含量的差異，為木耳的質(zhì)量評價提供依據(jù)。采用蒽酮-硫酸法分別測定黑木耳、毛木耳不同產(chǎn)地的多糖含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。葡聚糖在3.27～23.61μg/mL范圍內(nèi)，其濃度與對應(yīng)的吸光度呈良好的線性關(guān)系（R2=0.9993），平均回收率為101.2%，RSD為3.5%（n=9）。浙江江山、遼寧本溪、福建漳州產(chǎn)黑木耳中多糖含量分別為4.1%、3.0%和3.5%；浙江江山和江蘇徐州產(chǎn)毛木耳中多糖含量分別為4.1%和3.6%。蒽酮-硫酸法簡便可行、重復(fù)性好，適用于木耳中多糖含量的測定。不同產(chǎn)地的黑木耳多糖含量有一定的差異，不同產(chǎn)地的毛木耳多糖含量差異不明顯，同產(chǎn)地或地域位置相近的不同產(chǎn)地黑木耳與毛木耳品種間的多糖含量無明顯差異。

關(guān)鍵詞：黑木耳；毛木耳；多糖；蒽酮-硫酸法；產(chǎn)地

中圖分類號：S184文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號：cjas2020-0155

Auricularia of Different Varieties and Habitats： A Comparative Study on the Polysaccharides Content

Li Zhen1， Chen Jiemei1， Liu Xianzhao1， Tan Lirong2， Sun Hongmei1

（1Infinitus （China） Co.， Ltd.， Jiangmen 529100， Guangdong， China； 2Hongzhengdao （China） Traditional Chinese Medicine Research Company Ltd.， Guangzhou 510665， Guangdong， China）

Abstract： The paper aims to establish a method for the determination of polysaccharides in Auricularia and compare the polysaccharide content of Auricularia in different varieties and regions. Anthrone-sulfuric acid method was used to determine the content of polysaccharides in Auricularia auricula and Auricularia polytricha from different habitats， and the methodological investigation was conducted. The results showed that： the concentration of dextran had a good linear relationship with its absorbance in the range of 3.27-23.61μg/mL（R2=0.9993）， with an average recovery rate of 101.2% and RSD of 3.5% （n=9）. The polysaccharides content of A. auricula from Jiangshan， Benxi and Zhangzhou was 4.1%， 3.0% and 3.5%， respectively； the polysaccharides content of A. polytricha from Jiangshan and Xuzhou was 4.1% and 3.6%， respectively. The method is suitable for the determination of polysaccharides in Auricularia. There was certain difference in the polysaccharides content of A. auricula from different habitats， but not for the A. polytricha. The overall difference in the polysaccharides content between the two varieties was not obvious.

Keywords： Auricularia auricular； Auricularia polytricha； Polysaccharides； Anthrone-sulfuric Acid Method； Region

0引言

木耳（Auricularia）屬擔(dān)子菌綱木耳目木耳科，是一種主產(chǎn)于中國的大型食用真菌，營養(yǎng)價值豐富[1]，有“素中之葷”的美譽。木耳的種類多樣，常見的有黑木耳（Auriculariaauricula）和毛木耳（Auricularia polytricha），也是目前在黑龍江、遼寧、吉林、福建、江蘇、浙江、湖北、四川、云南、廣西等地廣泛栽培種類[2-3]。木耳多糖是木耳子實體的重要活性物質(zhì)，具有抗氧化[4-5]、抗輻射[6]、抗病毒[7]、抗腫瘤[8-9]、降血糖[10-11]、降血脂[12-13]、增強機體免疫[14]等多種有益于人體健康的功能作用。作為原料，木耳已被應(yīng)用于功能食品、保健品及藥品等領(lǐng)域。

目前，行業(yè)內(nèi)尚未制定木耳多糖含量檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)大多數(shù)食用菌企業(yè)采用農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《食用菌中粗多糖含量的測定（NY/T 1676—2008）》，即苯酚-硫酸法對食用菌多糖進(jìn)行檢測質(zhì)控[15]，文獻(xiàn)報道的木耳多糖含量測定方法也主要為苯酚-硫酸法[16-17]。但苯酚-硫酸法使用的苯酚有一定的毒性，不利于檢測操作的安全。而蒽酮-硫酸法是多糖含量測定的常用方法，此法不僅簡便、快速、靈敏，而且重現(xiàn)性好[18]。另外，關(guān)于不同產(chǎn)地、不同品種間木耳多糖含量比較的研究尚未見文獻(xiàn)報道。本研究采用蒽酮-硫酸法測定木耳中多糖含量，并比較不同產(chǎn)地木耳多糖的含量差異，以期為木耳的質(zhì)量控制、企業(yè)原料采購及相關(guān)食品研發(fā)利用等提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Evolution 300紫外可見分光光度計（ThermoFisher公司）；MS204S 1/10000電子天平（瑞士Mettler公司）；ST16R離心機（Thermo Fisher公司）；WBK-4B水浴鍋（HKM公司）；渦旋振蕩器（ThermoFisher公司）；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子量4萬，Sigma）；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）；濃硫酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；蒽酮（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2材料

供試黑木耳（浙江江山、福建漳州、遼寧本溪3個產(chǎn)地）、毛木耳（江蘇徐州、浙江江山2個產(chǎn)地）購于天方?。ㄖ袊┧帢I(yè)有限公司，均為干制品。

1.3實驗方法

1.3.1多糖樣品的制備取木耳適量，粉碎過40目篩，取粉末0.5 g，精密稱定，置于500 mL錐形瓶中。加200 mL蒸餾水于100℃水浴浸提2 h，提取2次。浸提完后，冷卻至室溫，置50 mL離心管中進(jìn)行離心（5000 r/min，10 min），上清液用快速濾紙進(jìn)行抽濾。合并上述濾液置蒸發(fā)皿中，于100℃水浴中蒸至約30 mL，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，并用少量熱水多次潤洗蒸發(fā)皿，合并洗液置上述容量瓶中，定容，搖勻，備用。精密量取上述溶液2 mL，置50 mL離心管中，加入8 mL無水乙醇，離心（5000 r/min，10 min），傾去上清液，沉淀用10 mL無水乙醇洗滌1次，振搖、離心。沸水浴中蒸至無醇味，用蒸餾水定容于10 mL容量瓶中，搖勻，即為供試液。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取0.1 mg/mL葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，并用蒸餾水補充至1.0 mL，將試管放入冷水浴中，分別加入蒽酮試劑4.0 mL（稱取50 mg蒽酮，用100 mL濃硫酸溶解），搖勻。置沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫。以空白作對照，在620 nm波長處測定吸收度。以吸收度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3多糖的測定精密量取樣品供試液1 mL，置于10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制項下操作，測定吸光度，計算樣品多糖含量。

1.3.4不同醇沉濃度影響的考察稱取3份相同產(chǎn)地的黑木耳樣品，按1.3.1項中方法提取多糖，分別用90%、80%、70%濃度的乙醇進(jìn)行醇沉，考察不同醇沉濃度對多糖檢測的影響。

1.3.5不同對照品影響的考察稱取3份相同產(chǎn)地的黑木耳樣品，按1.3.1項中方法提取多糖，分別用葡聚糖和葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察不同對照品對多糖檢測的影響。

2結(jié)果與分析

2.1醇沉濃度的確定

多項研究表明，多糖沉淀使用的乙醇濃度對沉淀的效果（包括多糖得率、分子組成、表觀粘度等）有重要的影響[19-22]，濃度過低（沉淀不完全）或者過高（易產(chǎn)生漿狀，不易操作）都不利于多糖的純化[23]。因此，選擇合適的醇沉濃度對保證多糖測定的準(zhǔn)確性尤為重要。醇沉濃度對木耳多糖含量影響見圖1。隨著醇沉濃度的增加，樣品多糖含量略呈上升趨勢，但差異不顯著（RSD=1.5%），為便于實驗操作和經(jīng)濟性，選用80%的醇沉濃度作為實驗條件。

2.2對照品的確定

研究表明，不同對照品對多糖含量測定有一定的影響[24]。本研究選用葡萄糖和葡聚糖2種對照品進(jìn)行考察，結(jié)果見圖2。與葡萄糖相比，采用葡聚糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測得木耳樣品中多糖含量較高，差異明顯（RSD=2.9%），因此本方法確定對照品為葡聚糖。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性實驗葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，可知葡聚糖在3.27～23.61μg/mL范圍內(nèi)，其濃度與對應(yīng)的吸光度呈良好的線性關(guān)系。其回歸方程見公式（1）。

2.3.2回收率實驗取同產(chǎn)地黑木耳樣品適量，粉碎過40目篩，取粉末0.25 g，按1.3.1項制備供試品，分別在醇沉后定容前加入相當(dāng)于樣品含量50%、100%、150%的葡聚糖對照品各3份（加標(biāo)葡聚糖濃度為0.1023 mg/mL，加標(biāo)體積分別為1.5、3.0、4.5 mL），按照1.3.2和1.3.3項完成測定。由表1可見，加標(biāo)樣品的回收率為101.2%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.3.3精密度實驗取同一批黑木耳樣品，按1.3項下方法平行制備并測定6份平行樣中的多糖含量，結(jié)果6份樣品多糖含量平均值為8.2%，RSD=1.5%，表明方法精密性良好。

2.3.4穩(wěn)定性實驗取同一批黑木耳樣品，按1.3項下方法制備供試品，記錄其在顯色反應(yīng)后3 h內(nèi)的吸光度，每0.5 h測定1次，連續(xù)測定6次，結(jié)果測得的吸光度平均值為0.381，RSD=0.6%，表明蒽酮-硫酸顯色后，樣品溶液在3 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4不同品種、產(chǎn)地木耳的多糖含量測定

制備不同品種、產(chǎn)地木耳的供試品溶液，于620 nm波長處測定吸光度，每個產(chǎn)地測定10個批次，每批次平行處理2份，計算多糖的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表2。不同產(chǎn)地黑木耳中多糖含量存在顯著差異（P<0.01），其中浙江江山產(chǎn)的黑木耳中多糖含量最高，為4.1%。浙江江山產(chǎn)的毛木耳中多糖含量整體較江蘇徐州產(chǎn)的含量稍高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05），即不同產(chǎn)地毛木耳中多糖含量差異不明顯。除遼寧本溪產(chǎn)地的黑木耳中多糖顯著低于其他2個產(chǎn)地的毛木耳外（P<0.01），同產(chǎn)地或地域位置相近的不同產(chǎn)地木耳2個品種間的多糖含量水平相當(dāng)，無顯著差異（P>0.05）。

3結(jié)論

本研究采用蒽酮-硫酸法測定木耳多糖，結(jié)果表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于木耳多糖的質(zhì)量控制。不同產(chǎn)地的黑木耳多糖含量有一定的差異，在選取的3個黑木耳產(chǎn)地中，以浙江江山產(chǎn)的黑木耳多糖含量最高，為4.1%。不同產(chǎn)地的毛木耳多糖含量差異不明顯，同產(chǎn)地黑木耳和毛木耳2個品種間的多糖含量水平相當(dāng)。遼寧本溪產(chǎn)的黑木耳中多糖含量顯著低于其他南方產(chǎn)地木耳中多糖含量，這可能是木耳生長受到溫度、濕度、光照等生長環(huán)境因素南北差異比較大導(dǎo)致的。

4討論

多糖常用的測定方法目前主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法及高錳酸鉀法，每種方法都有各自優(yōu)缺點。蒽酮-硫酸法的原理是糖在濃硫酸作用下，經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮試劑反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量呈正比，從而可進(jìn)行糖的定量。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，故木耳在提取時要注意將提取液離心和過濾干凈，以免濾渣中纖維素、淀粉等糖類物質(zhì)與蒽酮試劑發(fā)生反應(yīng)從而增加了測定誤差。另外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度會有不同，從而影響測定的結(jié)果，筆者考察了葡萄糖和葡聚糖2個對照品在測定結(jié)果上的差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用葡聚糖測定的結(jié)果較高，這可能與黑木耳多糖的單糖組成主要為甘露糖和鼠李糖而非葡萄糖有關(guān)[25]。

李承范[26]用蒽酮-硫酸法測定了木耳中多糖的含量，其結(jié)果為3.48%，與本實驗結(jié)果接近。但與之相比，本實驗多糖前處理方法更為簡便。杜娟等[17]用苯酚-硫酸法測定了黑木耳中多糖的含量，其結(jié)果為3.50%，也與本實驗結(jié)果接近。本研究在預(yù)實驗中也考察了苯酚-硫酸法，發(fā)現(xiàn)與蒽酮-硫酸法測定的結(jié)果接近，差異不明顯。周勇等[27]以香菇為研究對象，比較了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法在香菇多糖含量測定上的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)香菇中多糖采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法測定結(jié)果接近，2種方法的線性關(guān)系、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性均較好。這說明苯酚-硫酸和蒽酮-硫酸2種方法在測定某些特定多糖上同樣適用，雖然苯酚-硫酸法在多糖含量測定上目前較為常用，但考慮到苯酚的毒性，不利于檢測操作的安全，用蒽酮-硫酸法測定木耳多糖含量不失為一種合適的選擇。

參考文獻(xiàn)

[1]馮小飛，陳玉惠，趙寧，等.不同產(chǎn)地黑木耳水溶性多糖與蛋白質(zhì)含量測定比較[J].食用菌，2016（4）：57-58.

[2]呂文英.黑木耳和毛木耳中無機營養(yǎng)元素含量的測定與研究[J].微量元素與健康研究，2007，24（4）：30-31.

[3]李睿瑞，唐金敏，趙行建，等.黑木耳中水溶性多糖提取條件的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2018，24（11）：9-10.

[4]Yoona S J， Yub M A， Pyunb Y R， et al. The nontoxic mushroom Auricularia auricular contains polysaccharide with anticoagulant activity mediated by antithrombin[J]. Thrombosis Research，2003， 112（3）：151-158.

[5]Zeng W C， Zhang Z， Gao H， et al. Characterization of antioxidant polysaccharides from Auricularia auricular using microwave -assisted extraction[J]. Carbohydrate Polymers，2012，89（2）：694-700.

[6]Chen Z Q， Wang J H， Fan Z L， et al. Effects of polysaccharide from the fruiting bodies of Auricularia auricular on glucose metabolism in60Co-γ- radiated mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2019，135：887-897.

[7]Nguyen T L， Chen J， Hu Y L， et al. In vitro antiviral activity of sulfated Auricularia auricula polysaccharides [J]. Carbohydrate Polymers，2012，90（3）：1254-1258.

[8]Reza M A， Hossain M A， Lee S J， et al. Dichlormethane extract of the jelly ear mushroom Auricularia auricular Judae （higher Basidiomycetes） inhibits tumor cell growth in vitro[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms，2014，16（1）：37-47.

[9]Song G L， Du Q Z. Structure characterization and antitumor activity of anαβ-glucan polysaccharide from Auricularia polytricha[J]. Food Research International，2012，45（1）：381-387.

[10]Lu A X， Yu M G， Shen M， et al. Preparation of the Auricularia auricularpolysaccharidessimulatedhydrolysatesandtheir hypoglycaemiceffect[J].InternationalJournalofBiological Macromolecules，2018，106：1139-1145.

[11]Yang B K， Ha J Y， Jeong S C， et al. Hypolipidemic effect of an exobiopolymerproducedfromsubmergedmycelialcultureof Auricularia polytricha in rats[J]. Biotechnology Letters，2002，24（16）： 1319-1325.

[12]Ma J W， Qiao Z Y， Xiang X. Optimisation of extraction procedure for black fungus polysaccharides and effect of the polysaccharides on blood lipid and myocardium antioxidant enzymes activities[J]. Carbohydrate Polymers，2011，84（3）：1061-1068.

[13]Zhao S， Rong C， Liu Y， et al. Extraction of a soluble polysaccharide fromAuriculariapolytrichaandevaluationofitsantihypercholesterolemic effect in rats[J]. Carbohydrate Polymers，2015， 122：39-45.

[14]Nguyen T L， Wang D， Hu Y， et al. Immuno-enhancing activity of sulfated Auricularia auriculapolysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers，2012，89（4）：1117-1122.

[15]楊偉君，馬詩經(jīng)，焦春偉，等.靈芝孢子粉多糖含量檢測方法的優(yōu)化[J].中國食用菌，2018，37（2）：67-72.

[16]殷貝貝，趙爽，劉宇，等.市售不同品種木耳蛋白質(zhì)和水溶性多糖含量的研究[J].北方園藝，2011（23）：147-149.

[17]杜娟，時文靜.香菇、金針菇、黑木耳多糖的提取與測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（8）：347-350.

[18]郭曉雷，朱思潮.硫酸蒽酮法與硫酸苯酚法測定靈芝多糖含量比較[J].中國中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（9）：2000-2002.

[19]顏夢秋，唐慶九，楊焱，等.醇沉條件和干燥方式對毛頭鬼傘子實體多糖品質(zhì)的影響[J].菌物研究，2014，12（4）：221-225.

[20]耿安靜，陳健.香菇精多糖乙醇沉淀規(guī)律的研究[J].食品科學(xué)， 2010，31（4）：99-102.

[21]Xue B L， Wen J L， Xu F， et al. Structural characterization of hemicelluloses fractionated by graded ethanol precipitation from Pinus yunnanensis[J]. Carbohydrate Research，2012，352（9）：159-165.

[22]Balto A S， Lapis T J， Silver R K， et al. On the use of differential solubility in aqueous ethanol solutions to narrow the DP range of food-grade starch hydrolysis products[J]. Food Chemistry，2016，197： 872-880.

[23]黃慶斌，鄭志昌，陳竟豪，等.不同醇沉竹蓀多糖組分對青春雙歧桿菌體外增殖作用的影響[J].食品工業(yè)科技，2020（4）：86.

[24]孫曉燕，蔡昌利，徐麗莉，等.多糖含量測定方法的比較[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2015，29（3）：58-62.

[25]莊偉，屈咪，趙迪，等.黑木耳多糖的結(jié)構(gòu)組成及其免疫活性研究[J].食品科技，2020，45（2）：205-210.

[26]李承范.7種常見食用菌中多糖的提取和測定[J].光譜實驗室， 2012，29（2）：996-999.

[27]周勇，易延逵，楊曉敏，等.香菇中多糖含量測定方法的比較研究[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（13）：124-128.