王志博，白家赫，周孝貴，郭華偉，肖強(qiáng)

3種抗生素處理對(duì)灰茶尺蛾內(nèi)生菌群的影響

王志博，白家赫，周孝貴，郭華偉，肖強(qiáng)*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008

為明確不同抗生素對(duì)灰茶尺蛾內(nèi)共生菌群落的影響，分別選用質(zhì)量濃度2.5?mg·mL-1的四環(huán)素、頭孢氨芐、利福平3種抗生素溶液浸泡新鮮茶樹(shù)葉片持續(xù)飼喂灰茶尺蛾幼蟲3代，通過(guò)16?S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)內(nèi)生菌群群落變化展開(kāi)研究，并進(jìn)一步基于基因分子標(biāo)記對(duì)灰茶尺蛾沃爾巴克氏體菌去除效果進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，3種抗生素處理后，灰茶尺蛾菌群落均表現(xiàn)為豐富度增加、多樣性減??；四環(huán)素和利福平飼喂處理能夠成功將灰茶尺蛾沃爾巴克氏體菌去除，進(jìn)而建立了不攜帶沃爾巴克氏體菌的灰茶尺蛾種群，為進(jìn)一步開(kāi)展沃爾巴克氏體菌的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

灰茶尺蛾；共生菌；沃爾巴克氏體；抗生素

昆蟲體內(nèi)棲息了大量的微生物，它們與宿主之間長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成了相互依存的共生關(guān)系[1]。這些共生菌在宿主免疫、代謝、生殖等方面發(fā)揮了重要作用，因此，利用昆蟲共生菌開(kāi)發(fā)新型害蟲防治技術(shù)具有重要的應(yīng)用前景[2]。沃爾巴克氏體（）是廣泛共生于自然界節(jié)肢動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)的一類革蘭氏陰性細(xì)菌，可通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)宿主的生殖方式[3]。其中細(xì)胞質(zhì)不親和（Cytoplasmic Incompatibility，CI）現(xiàn)象是最常見(jiàn)的表型，其特征為感染沃爾巴克氏體的雄性和未感染或感染不同沃爾巴克氏體品系的雌性宿主交配后，受精卵不能正常發(fā)育，在胚胎期死亡[4-5]。基于該理論開(kāi)發(fā)出了利用沃爾巴克氏體防治蚊媒病的新型技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在阻止登革熱和寨卡病毒傳播中成功應(yīng)用[6-7]。

灰茶尺蛾（Warren）和小茶尺蠖（Prout）是茶園中最主要的1對(duì)近緣種食葉類害蟲，二者形態(tài)相似，分布區(qū)域部分重疊[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)二者能夠交配并產(chǎn)生不可育的后代，且存在生殖競(jìng)爭(zhēng)行為[9-10]。近期的研究發(fā)現(xiàn)二者共生菌群存在顯著差異，特別是灰茶尺蛾體內(nèi)自然攜帶沃爾巴克氏體，而小茶尺蠖不攜帶[11]。沃爾巴克氏體的差異是否介導(dǎo)了兩種茶尺蠖生殖隔離？這是我們一直關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。開(kāi)展該方面的研究首先要建立不攜帶沃爾巴克氏體的灰茶尺蛾品系。目前，對(duì)于昆蟲共生菌去除手段主要以抗生素處理為主，具體操作形式有顯微注射和飼喂兩種方法[12-13]。馮宏祖等[14]使用頭孢氨芐飼喂處理蘋果蠹蛾成功建立了不攜帶沃爾巴克氏體蘋果蠹蛾品系。任素麗等[15]使用利福平飼喂處理Q型煙粉虱發(fā)現(xiàn)，利福平對(duì)其體內(nèi)共生菌有良好的去除效果。謝蓉蓉等[16]使用四環(huán)素喂食處理二斑葉螨成功建立了不攜帶沃爾巴克氏體的二斑葉螨品系。上述研究結(jié)果均證明使用抗生素喂食處理是獲得不攜帶某種共生菌品系的有效手段，但不同種類抗生素處理昆蟲也會(huì)對(duì)其自身的免疫系統(tǒng)帶來(lái)不同程度的傷害[17]。目前，選用何種抗生素能夠達(dá)到去除灰茶尺蛾體內(nèi)沃爾巴克氏體，同時(shí)保證其種群正常生長(zhǎng)發(fā)育尚不清楚。本研究選取3種抗生素（四環(huán)素、頭孢氨芐、利福平）對(duì)灰茶尺蛾進(jìn)行飼喂處理以明確不同抗生素對(duì)沃爾巴克氏體的去除效果及其共生菌群落的影響，為進(jìn)一步開(kāi)展沃爾巴克氏體介導(dǎo)茶尺蠖兩近緣種生殖隔離及遺傳防治應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

灰茶尺蛾采自浙江省新昌縣（120.99° E，29.50° N）。野外收集灰茶尺蛾幼蟲后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：(25±1)℃；光周期為13?h/11?h（L/D）；相對(duì)濕度為75%~80%。采摘新鮮茶葉（迎霜品種）每天喂食，直至化蛹。將蛹按雌雄分開(kāi)，待成蟲羽化后，將雌雄成蟲各兩對(duì)置于500?mL養(yǎng)蟲瓶中配對(duì)，同時(shí)在養(yǎng)蟲瓶中放入2個(gè)產(chǎn)卵條[18]。

1.2 抗生素處理

選擇四環(huán)素、頭孢氨芐、利福平3種抗生素（麥克林公司，上海），配制質(zhì)量濃度為2.5?mg·mL-1溶液分別對(duì)新鮮茶樹(shù)葉片進(jìn)行浸液處理1?min?？股靥幚磉^(guò)的葉片置于25℃、相對(duì)濕度為50%~60%條件下進(jìn)行攤晾，待葉片表面溶液完全干后（約5?h），取適量處理過(guò)的茶葉對(duì)灰茶尺蛾進(jìn)行喂食，并將處理組進(jìn)行標(biāo)記。每個(gè)世代取羽化2日齡成蟲用于沃爾巴克氏體去除效果檢測(cè)。連續(xù)處理3個(gè)世代后，對(duì)羽化2日齡的成蟲進(jìn)行隨機(jī)取樣用于共生菌群落測(cè)序。每個(gè)處理組和對(duì)照組選取雌雄蟲各5頭，每頭樣本單獨(dú)保存在2?mL離心管中置于–80℃冰箱中待后續(xù)研究。

1.3 樣品DNA提取

樣品DNA提取采用試劑盒提取法。將樣品成蟲的翅用剪刀除去，剩余部分裝入2?mL的滅菌EP管中并加入1粒4?mm的滅菌鋼珠，置于振蕩研磨器上研磨2?min。待樣品研磨完成后按照血液/組織DNA提取試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司，北京）操作手冊(cè)逐步提取樣品DNA，并保存于–20℃冰箱中備用。

1.4 共生菌群落擴(kuò)增與測(cè)序

對(duì)DNA樣本的16?S V3-V4變異區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物341F：CCTACGGGNGGC WGCAG；805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC）[19]。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3?min；94℃變性30?s，46℃退火20?s，65℃延伸30?s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性20?s，55℃退火20?s，72℃延伸30?s，20個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5?min[11]。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，之后由浙江天科公司使用Illumina的MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.5 Wolbachia去除效果檢測(cè)

使用的特異性引物_F1：GTCCAATARSTGATGARGAAAC；_R1：CYGCACCAAYAGYRCTRTAAA擴(kuò)增基因進(jìn)行去除效果檢測(cè)[11]。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3?min；95℃變性1?min，59℃退火1?min，72℃延伸90?s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10?min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

共生菌測(cè)序成功序列使用PEAR（V1.2.11）對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)過(guò)濾得到有效數(shù)據(jù)（Effective tags）。利用Uparse軟件（Uparse V8.1.1861）對(duì)所有樣品的全部Effective tags進(jìn)行聚類將序列聚類成為OTUs，對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Uclust方法與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（www.arb-silva.de）進(jìn)行物種注釋分析。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods_coverag指數(shù)[11]。樣品間差異性檢驗(yàn)使用SPSS 17.0 （IBM）軟件Tukey檢驗(yàn)法，<0.05代表具有顯著差異，<0.01代表具有極顯著差異。

2 結(jié)果分析

2.1 灰茶尺蛾體內(nèi)共生菌種群組成的差異序列拼接與注釋

本研究共對(duì)4個(gè)處理（利福平L組、頭孢氨芐T組、四環(huán)素S組、空白對(duì)照CK組，每組10頭樣本）的40頭灰茶尺蛾樣本進(jìn)行了16?S rDNA的高通量測(cè)序，測(cè)序結(jié)果及質(zhì)檢信息見(jiàn)表1。每個(gè)樣品的Q20值均大于98%，Goods_coverage值均大于0.99，代表該測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性和注釋覆蓋率高，可滿足后續(xù)分析要求。本次測(cè)序共獲得了1?472?992條原始數(shù)據(jù)（每條平均長(zhǎng)度為416?bp），經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和篩選后共得到1?281?916條有效tags用于后續(xù)分析。以97%的一致性作為相似性的閾值將序列聚類為598個(gè)OTUs，共注釋到了22個(gè)門，40個(gè)綱，90個(gè)目，135個(gè)科，241個(gè)屬，157個(gè)種。

我們對(duì)4個(gè)組別的OTUs進(jìn)行比較分析。4個(gè)組別共注釋到598個(gè)OTUs，其中43個(gè)核心OTUs在4個(gè)組中均有注釋。核心OTUs經(jīng)鑒定隸屬于厚壁菌門Firmicutes（4科），變形菌門Proteobacteria（15科），放線菌門Actinobacteria（6科），擬桿菌門Bacteroidetes（鞘脂桿菌科Sphingobacteriaceae），微桿菌科門Microbacteriaceae（皮桿菌科Dermabacteraceae），軟壁菌門Tenericutes（支原體科Mycoplasmataceae）。其中豐度最高的均來(lái)自腸球菌科Enterococcaceae（厚壁菌門），無(wú)漿體科Anaplasmataceae（變形菌門）和腸桿菌科Enterobacteriaceae（變形菌門），平均豐度分別為29.6%，28.2%和15.2%。L組與CK組相比，共有的OTUs 51個(gè)，獨(dú)有的159個(gè)，被去除的40個(gè)；T組與CK組相比，共有的OTUs 69個(gè)，獨(dú)有的168個(gè)，被去除的27個(gè)；S組與CK組相比，共有的OTUs 65個(gè)，獨(dú)有的206個(gè)，被去除的31個(gè)（圖1）。由此可見(jiàn)，抗生素去除掉了宿主自身的部分菌種同時(shí)也打破了原有菌落的平衡，而一些新菌種也會(huì)在宿主體內(nèi)定植。

2.2 灰茶尺蛾體內(nèi)共生菌的多樣性和豐度差異

使用Alpha Diversity指數(shù)對(duì)每個(gè)樣本的多樣性和豐富度進(jìn)行分析（圖2），Shannon和Simpson指數(shù)反映菌群的多樣性，指數(shù)越大多樣性越高；Ace和Chao1指數(shù)反映樣品中菌群的豐富度，指數(shù)越大豐富度越高。從Shannon和Simpson指數(shù)來(lái)看，對(duì)照CK組最大，分別為2.56和0.70，顯著高于L組（1.43，0.42）和T組（0.56，017），與S組（1.97，0.47）并未形成顯著差異。從Ace和Chao1指數(shù)來(lái)看，對(duì)照組最小，分別為52.17和47.96。極顯著小于L組（83.26，80.60）和T組（92.76，87.90），但與S組（85.00，86.78）差異不顯著。綜合分析顯示，使用3種抗生素處理后，灰茶尺蛾菌群均呈現(xiàn)出豐富度增加，多樣性減小的變化規(guī)律，其中以頭孢氨芐處理組最為明顯。

注：韋恩圖代表不同組別OTUs組成；右邊代表共有的43個(gè)核心OTUs中豐度大于1%的菌群

注：*代表與對(duì)照組存在顯著差異（P<0.05）；**代表與對(duì)照組存在極顯著差異（P<0.01）

2.3 不同抗生素處理灰茶尺蛾樣本相似度分析

基于OTUs注釋結(jié)果對(duì)40個(gè)樣品進(jìn)行了PCoA相似性分析（圖3），圖中各點(diǎn)代表樣品，點(diǎn)間距離越近代表樣品在共生菌群組成上相似度越高。

分析結(jié)果顯示，4個(gè)組別的灰茶尺蛾樣品分布于相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域，說(shuō)明4個(gè)組共生菌組成具有較為明顯的差異。4個(gè)組別中樣品相似度最高的為T組，其樣品主要分布于第四象限；對(duì)照CK組中除樣品G1外，其他樣品全部分布在第二象限；L組和T組二者共生菌組成相對(duì)相似，樣品主要分布在一、二、三象限，且組內(nèi)樣品間差異較其他兩個(gè)組更大。

2.4 灰茶尺蛾體內(nèi)共生菌群落種類及豐度差異

根據(jù)OTUs的注釋結(jié)果，對(duì)照CK組獲得的371?549條有效tags聚類為96個(gè)OTUs，共生菌群落注釋到了10個(gè)門，19個(gè)綱，34個(gè)目，58個(gè)科，75個(gè)屬，40個(gè)種；利福平處理L組獲得的279?444條有效tags聚類為210個(gè)OTUs，共生菌群落注釋到了13個(gè)門，27個(gè)綱，57個(gè)目，82個(gè)科，134個(gè)屬，87個(gè)種；頭孢氨芐處理T組獲得的363?010條有效tags聚類為237個(gè)OTUs，共生菌群落注釋到了15個(gè)門，30個(gè)綱，61個(gè)目，89個(gè)科，136個(gè)屬，65個(gè)種；四環(huán)素處理S組獲得的267?913條有效tags聚類為271個(gè)OTUs，共生菌群落注釋到了17個(gè)門，30個(gè)綱，60個(gè)目，97個(gè)科，154個(gè)屬，111個(gè)種（表2）。

在門的水平（圖4），4個(gè)組別共生菌均以變形菌門、放線菌門、厚壁菌門為主，但在不同的組別中菌落的相對(duì)豐度有所差異。在對(duì)照CK組中主要共生菌豐度排名依次為變形菌門（79.13%），放線菌門（14.06%），厚壁菌門（5.13%）；在L組中排名依次為厚壁菌門（65.39%），變形菌門（30.15%），放線菌門（2.47%）；在T組中排名依次為變形菌門（94.74%），厚壁菌門（5.06%），擬桿菌門（0.06%）；在S組中排名依次為厚壁菌門（45.47%），變形菌門（33.79%），放線菌門（13.04%）。

圖3 樣品相似性PCoA分析

表2 灰茶尺蛾及不同處理組共生細(xì)菌分類的基本信息

在屬的水平（圖5），各組別共生菌群落組成差異較大。對(duì)照CK組中主要共生菌豐度排名前5的依次為沃爾巴克氏體屬（，28.97%），腸球菌屬（，24.17%），假單胞菌屬（，14.82%），節(jié)桿菌屬（，7.74%），蜜蜂球菌屬（，5.09%）；L組中排名依次為蜜蜂球菌屬（，61.12%），沙雷氏菌屬（，15.63%），假單胞菌屬（1.11%），鞘氨醇單胞菌屬（，0.39%），節(jié)桿菌屬（，0.28%）；T組中排名依次為沃爾巴克氏體屬（84.05%），假單胞菌屬（8.10%），蜜蜂球菌屬（4.99%），鞘氨醇單胞菌屬（1.84%），沙雷氏菌屬（0.21%）；S組中排名依次為蜜蜂球菌屬（43.50%），沙雷氏菌屬（11.72%），鏈霉菌屬（，7.57%），泛菌屬（，5.13%），鞘氨醇單胞菌（3.71%）。以對(duì)照CK組的主要共生菌的變化比較分析發(fā)現(xiàn)，L和S組中5類共生菌呈現(xiàn)出相對(duì)一致的變化趨勢(shì)。沃爾巴克氏體在L和S組中基本消除，但在T組中卻呈現(xiàn)了更高的豐度占比；腸球菌屬和節(jié)桿菌屬在3個(gè)處理組中均只有很小的豐度占比；假單胞菌屬在3個(gè)處理組中與對(duì)照組相比未呈現(xiàn)顯著差異，但均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，尤其在L和S組中更為明顯；蜜蜂球菌屬在L和S組呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，但在T組中未發(fā)生顯著變化（圖6）。

2.5 灰茶尺蛾體內(nèi)共生菌沃爾巴克氏體的去除效果

在使用抗生素對(duì)灰茶尺蛾進(jìn)行處理過(guò)程中，每個(gè)世代取6個(gè)樣品使用基因作為分子標(biāo)記對(duì)沃爾巴克氏體進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，使用抗生素處理1代后，3種抗生素處理組樣品中均能檢測(cè)到沃爾巴克氏體（S組中1個(gè)樣品除外）（圖7-A），說(shuō)明使用3種抗生素飼喂處理灰茶尺蛾1個(gè)世代均不能將沃爾巴克氏體去除?？股剡B續(xù)處理2代后，L組和S組所有樣品均檢測(cè)不到沃爾巴克氏體，但T組所有樣品中均能檢測(cè)到沃爾巴克氏體，說(shuō)明使用利福平或四環(huán)素抗生素連續(xù)處理灰茶尺蛾2個(gè)世代能夠?qū)⑽譅柊涂耸象w去除，但頭孢氨芐不能將其去除（圖7-B）?？股剡B續(xù)處理3代后，T組中依然能夠檢測(cè)出沃爾巴克氏體，說(shuō)明頭孢氨芐對(duì)沃爾巴克氏體的去除效果并不理想（圖7-C）。停用四環(huán)素10代后隨機(jī)選取10個(gè)樣品檢測(cè)顯示，該組群依然不攜帶沃爾巴克氏體并且生長(zhǎng)發(fā)育正常（圖8）。

3 討論

昆蟲共生菌是一類生活在昆蟲體內(nèi)與昆蟲互相依賴、影響并協(xié)同進(jìn)化的微生物[21]。昆蟲共生菌種類與其棲息宿主環(huán)境及宿主自身的免疫、食性等多種因素相關(guān)[1]。因此，不同昆蟲類群中共生菌種類和數(shù)量也存在一定程度上的差異。例如等翅目白蟻（）腸道優(yōu)勢(shì)共生菌為螺旋體門（Spirochaetes）、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門[22]；半翅目褐飛虱（）腸道優(yōu)勢(shì)共生菌為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門[23]；鱗翅目中家蠶（）、小菜蛾（）、?；页嵋苟辏ǎ┑饶c道優(yōu)勢(shì)共生菌主要以變形菌門、厚壁菌門和放線菌門細(xì)菌為主[24]。雖然親緣關(guān)系相近的昆蟲共生菌在高級(jí)階元具有相似性，但不同物種間在低級(jí)階元依然存在著差異。以常見(jiàn)的幾種鱗翅目昆蟲為例，稻縱卷葉螟（）優(yōu)勢(shì)共生菌為類諾卡氏屬（）和鞘脂單胞菌屬（）[25]；甜菜夜蛾（）優(yōu)勢(shì)共生菌為不動(dòng)桿菌屬（）和噬氫菌屬（）[26]；而在家蠶中不同品系其優(yōu)勢(shì)共生菌在屬水平上的組成也存在差異[27]。在本研究中，灰茶尺蛾優(yōu)勢(shì)共生菌為沃爾巴克氏體（28.97%）、腸球菌屬（24.17%）和假單胞菌屬（14.82%），其中沃爾巴克氏體作為一類主要存在于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的共生細(xì)菌，其在宿主中的多種生殖調(diào)控機(jī)制是引起研究者廣泛關(guān)注并持續(xù)開(kāi)展探索的科學(xué)問(wèn)題。由此可見(jiàn)，每種昆蟲共生菌群落組成具備各自的特點(diǎn)，這種多樣性也為研究共生菌功能及其與寄主之間的互作提供了充分的條件。

圖4 樣品主要共生菌相對(duì)豐度門水平的比例

圖5 樣品主要共生菌相對(duì)豐度屬水平的比例

注：*代表與對(duì)照組存在顯著差異（P<0.05）

圖7 3種抗生素處理灰茶尺蛾后沃爾巴克氏體檢測(cè)

圖8 四環(huán)素停用10代后沃爾巴克氏體檢測(cè)

本研究選擇了3種抗生素（四環(huán)素、頭孢氨芐、利福平）對(duì)灰茶尺蛾進(jìn)行了飼喂處理以探索不同抗生素對(duì)沃爾巴克氏體去除效果及共生菌群落的影響。選取的3種抗生素在其他昆蟲物種上均有除去沃爾巴克氏體的成功先例，但對(duì)灰茶尺蛾體內(nèi)沃爾巴克氏體的去除效果卻呈現(xiàn)了明顯差異。使用四環(huán)素和利福平飼喂處理灰茶尺蛾兩個(gè)世代后均能成功去除沃爾巴克氏體；而使用頭孢氨芐連續(xù)飼喂處理灰茶尺蛾3個(gè)世代依然未能達(dá)到去除沃爾巴克氏體的效果。這可能與各抗生素抗菌機(jī)理不同有關(guān)。四環(huán)素主要通過(guò)干擾氨酰-tRNA與核糖體的結(jié)合而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)革蘭氏陽(yáng)、陰性細(xì)菌、細(xì)胞內(nèi)支原體、衣原體和立克次體均有抑制效果[28]。頭孢氨芐的抑菌機(jī)理是通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，使細(xì)胞內(nèi)容物膨脹至細(xì)胞自溶，從而達(dá)到殺菌作用。頭孢氨芐對(duì)革蘭氏陽(yáng)、陰性細(xì)菌均有抑制效果。利福平的抑菌機(jī)理是通過(guò)和依賴于DNA的RNA多聚酶的亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌RNA的合成，從而阻斷RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程，達(dá)到阻止DNA和蛋白的合成效果[13]。因此，3種抗生素飼喂處理灰茶尺蛾后對(duì)其共生菌群落影響也存在差異，推測(cè)可能頭孢氨芐不能很好的抑制沃爾巴克氏體細(xì)胞壁的合成。目前，已有一些使用抗生素對(duì)不同昆蟲體內(nèi)沃爾巴克氏體去除效果的相關(guān)報(bào)道[12-13]，但對(duì)其作用機(jī)理方面尚未見(jiàn)報(bào)道。即使同種抗生素對(duì)不同昆蟲體內(nèi)沃爾巴克氏體去除效果也存在差異。由此可見(jiàn)，抗生素對(duì)沃爾巴克氏體的去除機(jī)制研究中不僅涉及了抗生素自身的抑菌機(jī)理而且與寄主體內(nèi)微環(huán)境及抗菌肽等多種因素相關(guān)?，F(xiàn)有的研究顯示，尚無(wú)成功分離培養(yǎng)沃爾巴克氏體的相關(guān)報(bào)道，一定程度上限制了對(duì)其功能作用的研究。本文首次對(duì)抗生素影響灰茶尺蛾共生菌群效果進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，四環(huán)素和利福平對(duì)灰茶尺蛾優(yōu)勢(shì)菌群（排名前5）中沃爾巴克氏體屬、腸球菌屬和節(jié)桿菌屬均有顯著的去除效果；而頭孢氨芐僅對(duì)腸球菌屬和節(jié)桿菌屬具有顯著的去除效果。另外，頭孢氨芐處理后沃爾巴克氏體，四環(huán)素和利福平處理后蜜蜂球菌屬的相對(duì)豐度均顯著提高。這可能與菌群之間的抑制作用有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究選了的3種抗生素對(duì)灰茶尺蛾進(jìn)行了飼喂處理，通過(guò)分子標(biāo)記檢測(cè)，四環(huán)素和利福平連續(xù)飼喂灰茶尺蛾兩個(gè)世代后均能達(dá)到去除沃爾巴克氏體的效果。而使用分子對(duì)停用四環(huán)素10代后樣品檢測(cè)顯示，該種群依然不攜帶沃爾巴克氏體并且生長(zhǎng)發(fā)育正常。通過(guò)上述方法首次成功建立了不攜帶沃爾巴克氏體的灰茶尺蛾種群。目前，現(xiàn)有的研究顯示沃爾巴克氏體能夠通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控宿主的生殖行為，常表現(xiàn)為誘導(dǎo)宿主發(fā)生細(xì)胞質(zhì)不親和（CI）、雄性致死（MK）、誘導(dǎo)孤雌生殖（PI）、雌性化（Feminization）、增強(qiáng)雌性繁殖力和雄性生育力等[3]。此外，沃爾巴克氏體對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝、抗逆能力等方面同樣具有調(diào)控作用[21]。不攜帶沃爾巴克氏體的灰茶尺蛾種群的建立實(shí)現(xiàn)了開(kāi)展沃爾巴克氏體在宿主灰茶尺蛾中功能研究的可能性，特別是在灰茶尺蛾與其近緣種茶尺蠖二者間生殖隔離機(jī)制研究方面具有重要的意義。沃爾巴克氏體通過(guò)何種方式調(diào)控茶尺蠖兩近緣種之間的生殖行為？沃爾巴克氏體是否是二者分化早期的驅(qū)動(dòng)因素？這些科學(xué)問(wèn)題也是我們獲得了不攜帶沃爾巴克氏體的灰茶尺蛾種群之后計(jì)劃開(kāi)展的研究方向。

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Effect of Three Antibiotic Treatments on Bacterial Endosymbiont Community ofWarren

WANG Zhibo, BAI Jiahe, ZHOU Xiaogui, GUO Huawei, XIAO Qiang*

Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China

In order to study the effects of three antibiotics on bacterial endosymbiont community of, relative experiment was carried out with three antibiotics (tetracycline, cefalexin and rifampicin) at the concentration of 2.5?mg·mL-1. Larvae ofwere fed the tea leaves with antibiotics for continuous 3 generations. Variation of endosymbiont community was studied using 16?S rDNA Illumina MiSeq technique. Besides, theofwere detected basing ongene.The results show thatabundance and diversity of endosymbiont community inwere increased and reduced,respectively under antibiotic treatments. The tetracycline and rifampicin could effectively removefromFurther, the population ofwithoutwas established, which laidthefoundationfor thestudy on functionof

, symbiotic bacteria,, antibiotics

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2021)01-090-11

2020-08-12

2020-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金（31700613）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-TRICAAS）

王志博，男，副研究員，主要從事茶園病蟲害防治研究，wangzhibo9527@163.com。*通信作者：xqtea@vip.163.com

(責(zé)任編輯：趙鋒)