劉凱雯，劉志杰，華甜

上?？萍即髮W(xué) iHuman研究所，上海 201210

趨化因子受體（chemokine receptor）是七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor, GPCR）超家族中的重要成員，通常表達(dá)于中性粒細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上。GPCR是最大的膜蛋白家族，天然配體包括多肽、脂類、生物胺、糖蛋白、核苷酸和離子等，由其介導(dǎo)的信號通路在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，市場中約有40%的藥物是靶向GPCR的[1-2]。GPCR與配體或GPCR與配體及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)解析，以及基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，對于我們揭示GPCR與配體及GPCR下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制十分重要。近十年來，GPCR結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，人們對于趨化因子受體家族的結(jié)構(gòu)與功能研究也投入了大量精力進(jìn)行探索并獲得了豐厚的知識。這些結(jié)構(gòu)對于趨化因子受體的激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究，以及相關(guān)疾病的藥物設(shè)計(jì)研發(fā)提供了非常重要的理論基礎(chǔ)。

1 趨化因子及趨化因子受體

趨化因子（chemokine）是一種分子量為8～10 kDa的多肽，是最大的細(xì)胞因子家族，主要功能是招募血液中的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等進(jìn)入特定的淋巴器官和組織以及感染發(fā)生的部位。大多數(shù)趨化因子的氨基酸序列中有4個(gè)保守的半胱氨酸（Cys），并形成1或2對保守二硫鍵穩(wěn)定趨化因子的核心結(jié)構(gòu)[3-4]。根據(jù)保守的半胱氨酸殘基的間隔氨基酸個(gè)數(shù)，通常將它們分為4個(gè)亞類：CXC類、CC類、CX3C類和C類。其中CXC 類趨化因子可以根據(jù)結(jié)構(gòu)功能區(qū)第一個(gè)半胱氨酸靠近蛋白的氮（N）端處有無谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（Glu-Leu-Arg,ELR_）氨基酸特征性序列分為兩類：ELR+和ELR兩個(gè)亞家族[5]。趨化因子具有保守的二級結(jié)構(gòu)，一般由N端loop、3個(gè)反相平行的β折疊和1個(gè)碳（C）端α螺旋組成。

當(dāng)成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等組織細(xì)胞及免疫細(xì)胞在受到刺激物，如生長因子、干擾素、病毒產(chǎn)物及細(xì)菌產(chǎn)物等的誘導(dǎo)時(shí)，可分泌出不同的趨化因子。相應(yīng)的趨化因子受體受到調(diào)控后，會誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等向炎癥部位聚集活化，并參與組織損傷修復(fù)。研究表明，在急性炎癥反應(yīng)過程中，趨化因子在氨基葡聚糖作用下聚集至內(nèi)皮細(xì)胞表面，通過與表達(dá)相應(yīng)趨化因子受體的白細(xì)胞相結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子，對炎癥反應(yīng)起到關(guān)鍵作用[6-7]。

趨化因子受體是GPCR家族的重要成員，主要介導(dǎo)趨化因子的信號傳導(dǎo)，通常由300多個(gè)氨基酸組成。趨化因子受體根據(jù)其對應(yīng)結(jié)合的趨化因子配體的分類也可分為4個(gè)亞類：XCR、CCR、CXCR、CX3CR。它們都具有類似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，即7個(gè)跨膜螺旋區(qū)，細(xì)胞外的N端、3個(gè)細(xì)胞外loop、3個(gè)細(xì)胞內(nèi)loop和細(xì)胞內(nèi)C端。趨化因子受體被趨化因子等配體激活后，主要通過結(jié)合胞內(nèi)的G蛋白或阻遏蛋白（β-arrestin）等信號分子來進(jìn)行下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。趨化因子及其受體在病原體的清除、炎癥反應(yīng)、病原體感染、細(xì)胞及器官的發(fā)育、創(chuàng)傷的修復(fù)、腫瘤的形成及其轉(zhuǎn)移等方面都起著重要的作用。

2 趨化因子受體的結(jié)構(gòu)研究

GPCR的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究一直充滿挑戰(zhàn)，它們在異源系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)量很低，也很難從中提取純化目的蛋白并保持其穩(wěn)定性。此外，GPCR一直處于動態(tài)平衡的構(gòu)象狀態(tài)，很難捕捉解析某一構(gòu)象狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。近年來，X-射線晶體學(xué)（X-ray crystallography）和冷凍電子顯微鏡（cryo-electron microscopy, Cryo-EM）技術(shù)等的發(fā)展，極大加速了GPCR的結(jié)構(gòu)解析。迄今為止，研究者已經(jīng)發(fā)表了27個(gè)趨化因子受體的結(jié)構(gòu)，包括13種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)（圖1）。其中有5種趨化因子-趨化因子受體復(fù)合物晶體或電鏡三維結(jié)構(gòu)，包括首次解析的結(jié)合拮抗劑以及修飾過的病毒趨化因子的CXCR4[9]、結(jié)合CX3CL1的病毒趨化因子受體US28[10]、與拮抗劑5P7-CCL5結(jié)合的CCR5[11]、結(jié)合內(nèi)源性配體CCL20的CCR6-Go復(fù)合物[12]，以及分別與二體和單體狀態(tài)內(nèi)源性配體 CXCL8結(jié)合的CXCR2-Gi復(fù)合物[13]。其中前三種為非激活狀態(tài)或者類似激活狀態(tài)的趨化因子受體晶體結(jié)構(gòu)，后兩個(gè)受體的結(jié)構(gòu)均為結(jié)合內(nèi)源性配體的完全激活態(tài)趨化因子受體與下游G蛋白結(jié)合的復(fù)合物冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)。此外，研究者們還解析了一系列小分子拮抗劑結(jié)合的趨化因子受體結(jié)構(gòu)，包括CXCR4[14]、CCR5[15]、CCR9[16]、CCR2[17]、CCR7[18]和CXCR2[13]（圖1）等。

圖1 目前為止已解析的獨(dú)特的趨化因子受體結(jié)構(gòu)（藍(lán)灰色字體為PDB編號，亮藍(lán)色字體表示復(fù)合物所結(jié)合的配體，紅色字體表示結(jié)合趨化因子的受體結(jié)構(gòu)。每個(gè)結(jié)構(gòu)根據(jù)B因子進(jìn)行著色，2LNL（核磁結(jié)構(gòu)）除外）

2.1 趨化因子類配體與受體的相互作用

通常，趨化因子與受體的結(jié)合過程在空間和時(shí)間上稱為“兩步結(jié)合模型”[19]，第一步主要是趨化因子受體的N端對趨化因子的招募識別并結(jié)合其球狀核心，第二步主要是趨化因子的N末端插入到受體的跨膜區(qū)域口袋處進(jìn)而激活受體。兩步結(jié)合模型的位點(diǎn)一般稱為趨化因子識別位點(diǎn)（chemokine recognition site, CRS）1和2[20]。研究表明，趨化因子的N端信號傳導(dǎo)域在趨化因子受體激活中起著重要作用[19-21]。在趨化因子被招募初期，受體N端初始區(qū)域通過表面靜電吸附等作用力將趨化因子吸引招募過來，受體N端靠近跨膜區(qū)TM1的殘基與趨化因子的球狀核心（N loop和β折疊）形成靜電和疏水相互作用，將趨化因子穩(wěn)定在受體跨膜區(qū)附近。隨后，趨化因子的N末端逐漸靠近結(jié)合受體正構(gòu)口袋，與跨膜區(qū)螺旋和胞外loop區(qū)形成相互作用，引起受體構(gòu)象變化，從而激活下游信號。結(jié)合過程中，CRS1主要負(fù)責(zé)配體親和性與識別功能，CRS2則主要與受體激活和信號傳導(dǎo)功能相關(guān)聯(lián)。此外，還有提出介于CRS1和CRS2之間起承接關(guān)系的CRS1.5的位點(diǎn)，包括趨化因子N端中間保守半胱氨酸殘基與受體N端根部附近[9]。通常在CRS1.5處，趨化因子受體N端的Pro-Cys（PC）保守殘基中CysN-term與受體的第三個(gè)細(xì)胞外環(huán)上CysECL3形成二硫鍵，有助于CRS1相互作用的穩(wěn)定，起到彎折和定位作用[22]。近年來的趨化因子-趨化因子受體結(jié)構(gòu)解析，揭示了趨化因子與受體廣泛的結(jié)合界面，該結(jié)合界面在空間和時(shí)間上是連續(xù)不可孤立的。

趨化因子受體的正構(gòu)結(jié)合口袋可以分為主要和次要亞腔[23]，主要亞腔由靠近TM4(transmembrane helix 4)、TM5和TM6的口袋空腔組成，次要口袋指靠近TM1、TM2一側(cè)的空腔口袋，TM1和TM7則介于兩個(gè)亞腔之間（圖2）。通過結(jié)構(gòu)的對比分析發(fā)現(xiàn)，vMIP-II、CX3CL1或5P7-CCL5的N端主要在較深的次要口袋或同時(shí)在主、次要口袋亞腔中形成廣泛的相互作用。在CXCR2-CXCL8-Gi復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中，CXCL8在CRS2中的結(jié)合位點(diǎn)和特異性相互作用，與已解析的CXCR4-vMIP-II、US28-CX3CL1或CCR5-5P7-CCL5晶體結(jié)構(gòu)存在較大差異。CXCL8的N末端在受體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合位點(diǎn)口袋較淺，只占據(jù)主要口袋亞腔一側(cè)，與ECL2形成氫鍵和疏水相互作用，并與TM5和TM6的靠近胞外區(qū)精氨酸殘基（R2786.62、R2085.35和R2125.39）形成鹽橋，在激活過程中起著關(guān)鍵作用（圖3（a））。同時(shí)，CXCL8中的30s loop區(qū)域上的“GP”殘基也與CXCR2的ECL2有較好的疏水相互作用，穩(wěn)定了ECL區(qū)域構(gòu)象。此外，CXCR2口袋中TM2和TM4上的極性殘基Lys2.64和Arg4.64的大側(cè)鏈可能會阻止CXCL8的N端更深地進(jìn)入子口袋，使得CXCL8在淺層口袋結(jié)合，而Lys2.64和Arg4.64殘基只在CXCR2和CXCR1中存在，而在其他趨化因子受體中相應(yīng)位置主要為保守的短側(cè)鏈的Ala2.64和Ser4.64。在CCR6-CCL20-Go結(jié)構(gòu)中，趨化因子CCL20的N末端較短（NH2-ASNFD），結(jié)合口袋與CXCL8類似甚至更加淺，十分靠近胞外區(qū)域，并同時(shí)占據(jù)主要和次要亞腔口袋。CCL20的N端主要與受體胞外的ECL區(qū)域和N末端形成氫鍵等相互作用，并和受體ECL2上的可能的激活關(guān)鍵殘基E19845.51形成鹽橋，與TM1上的R421.28、TM7上的K2987.35形成鹽鍵等相互作用。

此外，CXCL8的結(jié)合模式與CXCR4中的vMIP-II的總體架構(gòu)更為相似（圖2），表明該CXC趨化因子亞家族可能具有相似的結(jié)合模式。由于CXCR4-vMIP-II和CCR5-5P7-CCL5處于非激活的狀態(tài)，其跨膜區(qū)與CXCR2激活態(tài)差異較大，而CX3CL1結(jié)合的US28處于近似激活的狀態(tài)，因此受體結(jié)構(gòu)上與CXCR2激活態(tài)更為相似。內(nèi)源性配體CXCL8和CCL20結(jié)合的均是完全激活態(tài)的相應(yīng)受體，它們與受體的作用均屬于淺口袋結(jié)合模式。

圖2 趨化因子-趨化因子受體復(fù)合物相互作用口袋橫截面示意圖（粉色表示CCR6，亮黃色表示CCL20，橙色表示CXCR2，紅色和藍(lán)色分別表示二體CXCL8中的兩個(gè)分子，淡紫色表示CXCR4，三文魚色表示vMIP-II，淺黃色表示US28，綠色表示hCXCL1，淺藍(lán)色表示CCR5，深紫色表示5P7-CCL5）

2.2 趨化因子受體與G蛋白的相互作用

趨化因子受體家族成員主要通過Gi/o蛋白傳遞信號，在CXCR2-CXCL8-Gi和CCR6-CCL20-Go復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，受體主要與G蛋白α亞基相互作用介導(dǎo)信號傳遞。相互作用界面由受體的TM3、TM5、TM6、ICL2和ICL3以及Gα亞基的α5螺旋、αN螺旋和αN-β1環(huán)、β2-β3環(huán)組成，α5螺旋結(jié)合在受體7TM近胞內(nèi)區(qū)形成的口袋中。主要的相互作用與其他已解析的GPCR-Gi復(fù)合物結(jié)構(gòu)相似[24-30]。在CXCL8-CXCR2-Gi結(jié)構(gòu)中，Gαi的α5螺旋的兩個(gè)大疏水側(cè)鏈的氨基酸L353和L348指向CXCR2靠近胞內(nèi)區(qū)的疏水口袋。該疏水區(qū)域主要由TM3、TM5、TM6和TM7的近胞質(zhì)末端的疏水殘基組成。由于CXCR2的ICL3相對較短，其上的疏水殘基與Gαi的α5螺旋殘基具有較好的疏水相互作用， 并與α5螺旋的部分側(cè)鏈形成氫鍵。相比較而言，在GPCR-Gs的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中ICL2保守的F/L34.51與Gαs形成疏水相互作用。但在大多數(shù)趨化因子受體中，相應(yīng)位置側(cè)鏈較短的V/T34.51減弱了這種相互作用。ICL2的氨基酸殘基的差異可能有助于分析趨化因子受體對下游 G蛋白的選擇性。在CCR6-CCL20-Go結(jié)構(gòu)中，受體上的ICL2形成兩圈α螺旋結(jié)構(gòu)，其上的苯丙氨酸側(cè)鏈也與G蛋白loop區(qū)和α5的側(cè)鏈形成較好的疏水相互作用，通常的34.51保守位點(diǎn)仍然為趨化因子受體家族保守的小側(cè)鏈的氨基酸V34.51。此外，當(dāng)將CXCR2-CXCL8-Gi復(fù)合物結(jié)構(gòu)與β2AR-Gs結(jié)構(gòu)[31]進(jìn)行比較時(shí)，主要區(qū)別在于Gαi和Gαs的α5螺旋的相對位置，以及Gαs偶聯(lián)受體中TM6的相應(yīng)位置的偏移。與TM5和TM6相互作用的Gαs的α5螺旋中的C末端殘基比Gi更大，因此胞質(zhì)結(jié)合腔中TM5、TM6的開合大小會發(fā)生相應(yīng)改變來容納不同側(cè)鏈大小的α5螺旋。總體來說，研究者們已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上闡明了結(jié)合內(nèi)源性趨化因子的激活態(tài)受體和下游G蛋白之間的相互作用界面，以及G蛋白偶聯(lián)至趨化因子受體的分子基礎(chǔ)。

3 趨化因子受體激活機(jī)制分析

最近CXCR2-CXCL8-Gi和CCR6-CCL20-Go復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析為我們打開了探索趨化因子激活機(jī)制的大門。由于研究者同時(shí)也解析了CXCR2結(jié)合別構(gòu)拮抗劑的非激活態(tài)結(jié)構(gòu)，我們主要以CXCR2為例來闡明趨化因子受體家族的激活機(jī)制。

白細(xì)胞介素8 (CXCL8, Interleukin-8或IL-8)屬于CXC類趨化因子家族ELR+亞家族成員，其N末端具有ELR特征序列[32]。在高濃度狀態(tài)下CXCL8以同源二聚體形式存在，而低濃度下以單體形式存在。研究表明，單體和二聚體狀態(tài)的CXCL8都能夠識別并與CXCR2結(jié)合，激活下游信號并參與人體復(fù)雜的炎癥反應(yīng)調(diào)控[33]。因此CXCL8/CXCR2是抗癌抗炎的重要藥物靶標(biāo)。

在已解析的二聚體CXCL8結(jié)合的CXCR2-Gi復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，將二聚體CXCL8中兩個(gè)蛋白分子定義為CXCL8-A和CXCL8-B。CXCL8-A分子與CXCR2受體正構(gòu)口袋結(jié)合并激活下游信號，與單體狀態(tài)的CXCL8結(jié)合機(jī)制幾乎相同，另一側(cè)的CXCL8-B與CXCR2只有較弱的相互作用。研究者通過比較CXCR2的激活態(tài)與非激活態(tài)發(fā)現(xiàn)，CXCL8中的N末端ELR基序在受體激活過程中起著十分關(guān)鍵的作用：當(dāng)受體識別并結(jié)合CXCL8后，在趨化因子正構(gòu)結(jié)合口袋處，CXCL8的N末端氨基酸R6和L5與受體建立的氫鍵和疏水相互作用分別起錨定點(diǎn)作用，以穩(wěn)定CXCL8的N端。CXCR2的Y197ECL2與CXCL8的L5和E4的羰基氧形成氫鍵，以誘導(dǎo)受體ECL2的構(gòu)象變化并促進(jìn)激活。在協(xié)同作用下，主要亞腔口袋中的E4與R2085.35、R2125.39和R2786.62分別形成關(guān)鍵的鹽鍵相互作用，引起TM5胞外部分向內(nèi)大幅度擺動，成為CXCR2受體激活的主要驅(qū)動力（圖3（a、 c））。

CXCL8引起TM5的構(gòu)象變化后，A類GPCR家族典型的激活特征之一——P5.50I3.40F6.44基序中，P2235.50發(fā)生旋轉(zhuǎn)，I1343.40和F2606.44發(fā)生協(xié)同重排（圖3（b）），并伴隨經(jīng)典開關(guān)殘基W2646.48的側(cè)鏈構(gòu)象變化（圖3（b））。隨后TM6螺旋靠近胞內(nèi)區(qū)的部分向外大幅擺動，TM7則向跨膜區(qū)中心靠近TM3和TM5的方向移動，通過氫鍵等形成螺旋之間的相互作用。此外，CXCR2的激活過程中，還表現(xiàn)出A類家族受體激活的其他特征，包括經(jīng)典的NPxxY（N3107.49、P3117.50和Y3147.53）和DRY（D1433.49、R1443.50和Y1453.51）保守結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化。

圖3 CXCR2-CXCL8-Gi為例展示的趨化因子受體家族激活機(jī)制：（a）CXCR2激活態(tài)結(jié)構(gòu)展示圖；（b）關(guān)鍵特征位點(diǎn)激活示意圖；（c）CXCR2受體激活模型圖

與其他已解析的與小分子或多肽結(jié)合的GPCR結(jié)構(gòu)不同，趨化因子受體的激活觸發(fā)位點(diǎn)相對較淺，靠近受體的胞外段。這主要是由于趨化因子刺激受體相應(yīng)口袋關(guān)鍵氨基酸，引起受體TM5的構(gòu)象變化，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)鍵的螺旋間相互作用被破壞，如TM3和TM6發(fā)生旋轉(zhuǎn)，并影響受體的近胞內(nèi)端跨膜區(qū)和loop區(qū)域的構(gòu)象，從而使得G蛋白α亞基能夠結(jié)合到胞內(nèi)區(qū)，引起下游信號傳遞（圖3（c））。

4 總結(jié)和展望

在過去的幾十年里，趨化因子及趨化因子受體因在人體細(xì)胞遷移和抵御病原體入侵中起到的重要作用而引起了人們的廣泛關(guān)注。除了它們在HIV病理機(jī)制方面的作用外，人們也更多地認(rèn)識到它們在自身免疫及炎癥、癌癥方面的重要影響。趨化因子網(wǎng)絡(luò)可以說是免疫系統(tǒng)的主要管理調(diào)控者。由于趨化因子及其受體功能多樣，相互作用錯綜復(fù)雜，一直以來的結(jié)構(gòu)信息不完善，科學(xué)家們對趨化因子及其受體的功能機(jī)制研究和相關(guān)的藥物研發(fā)受到制約。近年來，隨著多個(gè)趨化因子受體結(jié)構(gòu)的不斷解析，尤其是通過冷凍電鏡技術(shù)解析的同時(shí)結(jié)合內(nèi)源性配體和下游信號分子G蛋白的趨化因子受體復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，展示了內(nèi)源性趨化因子獨(dú)特的淺口袋結(jié)合模式，以及受體與下游G蛋白的相互作用分子機(jī)制，使我們對內(nèi)源性蛋白分子的識別、趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活機(jī)制有了更深入全面的理解，也為探索趨化因子受體家族相關(guān)多肽、抗體類藥物設(shè)計(jì)研發(fā)提供了指導(dǎo)方向。然而，趨化因子與其受體具有廣泛復(fù)雜的細(xì)胞來源以及生物學(xué)效應(yīng)，目前仍有大量未知的過程機(jī)制和待解決問題，需要科學(xué)家結(jié)合不同的研究方法，在分子、細(xì)胞、組織、器官和動物等不同尺度深入探索。