趙國春，裴志花，李曉涵

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2. 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118)

組織蛋白酶(cathepsin)在1920年由Lanner首次發(fā)現(xiàn)，它廣泛存在于動物各種組織細胞內(nèi)，在維持動物正常生命活動中扮演著重要角色。根據(jù)酶的催化機制，組織蛋白酶分為以下4大類：金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。除此之外，還有谷氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和一些尚未進行分類的蛋白酶。根據(jù)組織蛋白酶代表底物還可以分為L、B1、D、E、F、FG、GF、G、H、S等幾大類，如表1。

1973年，人們首次提出CTSL，Etsushiro等通過Sephadex或蔗糖梯度凝膠層析法分離純化豬腎中的2種不同的組織蛋白酶A，在純化過程中將組織蛋白酶A分為不同分子量大小的片段，分別命名為CTSL(分子量較大的組織蛋白酶A)和組織蛋白酶S(分子量較小的組織蛋白酶A)。在隨后十多年里，科學(xué)家又從大鼠肝臟、兔骨骼肌、人肝臟中分離純化出CTSL，并且證明人CTSL與大鼠和兔CTSL相似。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及先進的分析儀器的出現(xiàn)，國內(nèi)外學(xué)者對于CTSL的研究逐步深入，發(fā)現(xiàn)它與腫瘤、心肌病以及吸蟲病等密切相關(guān)，是近年來飽受關(guān)注的一類靶標(biāo)蛋白酶。但是，我國對CTSL的相關(guān)生理特性研究相對較少。本文就CTSL的結(jié)構(gòu)與功能、生物合成途徑、生物學(xué)效應(yīng)以及在人體和畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用進行綜述，為CTSL的深入研究提供理論依據(jù)。

表1 根據(jù)代表底物對組織蛋白酶進行分類[1]

1 CTSL的結(jié)構(gòu)

CTSL前體的起始由兩部分組成：N-末端球狀結(jié)構(gòu)域和C-末端延伸結(jié)構(gòu)。N-末端球狀結(jié)構(gòu)域與成熟結(jié)構(gòu)域的組氨酸(His140)至天冬氨酸(Asp155)的環(huán)相互作用，C-末端延伸結(jié)構(gòu)位于活性位點裂隙中。CTSL結(jié)構(gòu)與木瓜蛋白酶類具相似的折疊，在成熟CTSL的220個殘基中，183個Cα原子可與木瓜蛋白酶相應(yīng)Cα原子重疊。CTSL的結(jié)構(gòu)中包含2個域，左(L-)和右(R-)，L結(jié)構(gòu)域是α螺旋，而R結(jié)構(gòu)域形成β桶狀折疊，這些結(jié)構(gòu)域在“V”形活性位點裂口頂部分開，α螺旋保守殘基半胱氨酸25(Cys25)和β桶狀折疊的組氨酸163(His163)處于V形裂隙的中部，在該結(jié)構(gòu)域中，Cys25殘基突變?yōu)榻z氨酸以消除其活性，每個結(jié)構(gòu)域，最終形成酶的催化位點[2]。CTSL的4個活性結(jié)合位點分別為S′、S1、S2、S3。CTSL的S′區(qū)域類似于木瓜蛋白酶的S′區(qū)域，呈現(xiàn)為淺凹陷狀而不為常見酶類的裂縫狀；S1亞基位點呈環(huán)狀，且由S3和S2′的部分環(huán)構(gòu)成，并且在頂部由保守二元橋Cys22和Cys63所包圍；CTSL的S2亞基位點深且疏水，CTSL的S3亞基位點在裂隙左壁中間區(qū)域，該亞基位點中心有1個擴展的甘氨酸67(Gly67)和Gly68結(jié)構(gòu)，被天冬酰胺66(Asn66)、谷氨酸63(Glu63)和亮氨酸69(Leu69)的側(cè)鏈以及Gly61的羰基氧包圍[3]。

不同物種的CTSL結(jié)構(gòu)存在較大差異。Tsunemoto等[4]對于鯉魚的CTSL結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚CTSL與虹鱒CTSL的一致性為82%，但是與哺乳動物CTSL的一致性卻只為62%～69%，哺乳動物的CTSL的P1加工位點為絲氨酸(親水性氨基酸)，易被絲氨酸蛋白酶水解成雙鏈形式，而鯉魚的CTSL因在關(guān)鍵區(qū)域存在纈氨酸29～天冬氨酸295(Val29～Asp295)，P1加工位點為Val,該差異導(dǎo)致魚類CTSL所以不太可能加工成兩鏈形式。哺乳動物CTSL的39 kDa前體最終通過溶酶體半胱氨酸蛋白酶快速轉(zhuǎn)化為23 kDa雙鏈形式[5]。相比之下，鯉魚CTSL保持單鏈形式，沒有加工成兩鏈形式。在加工位置上的氨基酸性質(zhì)可能決定了哺乳動物與魚類CTSL的差異。

2 CSTL的生物合成及體內(nèi)轉(zhuǎn)運

CTSL位于初級溶酶體，在細胞核和細胞外也有發(fā)現(xiàn)，CTSL從mRNA內(nèi)下游AUG起始位點開始翻譯[6-7]。首先N末端的信號肽指導(dǎo)新生多肽鏈插入ER。在ER內(nèi)，信號肽被切割，釋放出含有前體肽和成熟肽的酶原，CTSL蛋白質(zhì)在前體肽的幫助下進行卷曲折疊，同時形成二硫鍵和高甘露糖聚糖的N-聯(lián)糖基化。在高爾基體內(nèi)，酶原上甘露糖殘基被磷酸化形成6-磷酸甘露糖(mannose-6 -phosphate，m6p)其通過m6p受體將蛋白質(zhì)靶向到溶酶體腔。經(jīng)過晚期溶酶體腔的初始酸化后，CTSL被激活，這導(dǎo)致組織蛋白酶前體肽被切割和組織蛋白酶的活化程度加大。到達溶酶體后，經(jīng)進一步處理，將蛋白水解加工成重鏈和輕鏈。甘露糖殘基未被磷酸化的CTSL將不會則不會進入溶酶體，而是作為酶原分泌。因組織蛋白酶的過表達極大地增加了該途徑中酶的比例，所以甘露糖殘基轉(zhuǎn)化為m6p的過程似乎是限速的[8]

3 CTSL的生物學(xué)效應(yīng)

3.1 毛發(fā)發(fā)育中的作用

脫發(fā)是由于毛囊形態(tài)發(fā)生和周期的改變，毛囊管的擴張和叢毛形成紊亂造成的。對小鼠毛發(fā)的研究發(fā)現(xiàn)，CTSL在毛發(fā)發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Roth等[9]為研究CTSL在小鼠毛發(fā)中的作用，在胚胎干細胞中對該基因進行基因靶向敲除，敲除CTSL基因的小鼠出現(xiàn)周期性脫發(fā)和表皮增生、棘皮癥(acanthosis)和角化過度。小鼠突變表型主要特征為毛囊上皮細胞和基底表皮角質(zhì)形成細胞的過度增殖。在對突變體無毛小鼠的CTSL基因研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠的g149r基因突變導(dǎo)致了蛋白酶失活[10]。對人類毛囊和甲床進行免疫組織化學(xué)和免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)CTSL特異性地表達于毛球和甲床，CTSL能參與到人類毛囊和指甲的終末分化進程中[11]。因此CTSL被證明是表皮穩(wěn)態(tài)、常規(guī)毛囊形態(tài)發(fā)生和循環(huán)所必需的第一種溶酶體蛋白酶。通過搜索人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫(OMIM)并未發(fā)現(xiàn)因相似原因而導(dǎo)致脫發(fā)的人類疾病，因此猜測CTSL在不同生物體內(nèi)所執(zhí)行的功能可能也會存在差異。

3.2 生理過程中的關(guān)鍵酶

近年來研究數(shù)據(jù)表明，新發(fā)現(xiàn)的分泌小泡中CTSL是一種用于產(chǎn)生活性腦啡肽(enkephalin)和其他神經(jīng)遞質(zhì)或激素，例如腦啡肽、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、α-促黑素細胞激素(α-MSH)、β-內(nèi)啡肽的蛋白水解加工酶。Yasothornsrikul等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在嗜鉻細胞顆粒中分泌囊泡中CTSL是負(fù)責(zé)將腦啡肽原轉(zhuǎn)化為活性腦啡肽半胱氨酸蛋白酶。腦啡肽生成時，CTSL需要將其定位于含有前體(PE)和蛋氨酸腦啡肽(ME)的分泌囊泡。在一元和二元激素原加工位點，CTSL通過對蛋白水解加工產(chǎn)生ME。同時還發(fā)現(xiàn)，敲除CTSL基因的小鼠腦中ME水平明顯低于對照組小鼠，而小鼠腦組織中ME前體的比例升高。這些發(fā)現(xiàn)提供了敲除CTSL基因小鼠中腦啡肽前體積累的證據(jù)，為CTSL在腦啡肽產(chǎn)生而發(fā)揮功能性作用提供支持。除此之外，CTSL能發(fā)生蛋白水解作用并且可以通過介導(dǎo)細胞內(nèi)PGRN(編碼谷粒蛋白)蛋白水解，可調(diào)節(jié)PGRN及其顆粒蛋白片段的水平[13]。據(jù)Funkelstein等[14]的研究，CTSL能通過蛋白水解加工促黑素皮質(zhì)素(POMC)前體而合成垂體激素ACTH，β-內(nèi)啡肽和α-MSH。CTSL在垂體AtT-20細胞中的表達導(dǎo)致分泌途徑中ACTH和β-內(nèi)啡肽的增加，經(jīng)CTSL的特異性抑制劑CLIK-148處理的AtT-20細胞則會造成ACTH的產(chǎn)出減少和POMC的積累的結(jié)果。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)的最重要的合并癥之一，是終末期腎病第二原因。CTSL可能通過參與激活影響DN發(fā)展的硫酸乙酰肝素糖苷內(nèi)切酶活性的機制，促使該酶在腎小球基底膜大量表達，在內(nèi)皮細胞和足細胞上特異性分解硫酸乙酰肝素，導(dǎo)致這兩細胞類型的硫酸乙酰肝素表達降低，導(dǎo)致足細胞損傷，最終產(chǎn)生DN蛋白尿[15-16]。以上研究均表明CTSL對ACTH、β-內(nèi)啡肽，內(nèi)切酶的產(chǎn)生與激活均具有重要作用。

3.3 腫瘤疾病標(biāo)志物

溶酶體CTSL是多種腫瘤疾病中的標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)的蛋白水解酶。根據(jù)Chauhan等[17]的研究表明，癌細胞通過分泌蛋白酶降解細胞外膜成分，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。對3種鼠黑素瘤變體的觀察發(fā)現(xiàn)，癌細胞通過CTSL mRNA的持久翻譯來維持CTSL的高表達水平，而腫瘤細胞本身就是CTSL mRNA表達升高的來源[18]。Vasishta等[19]測定腫瘤相鄰的非惡性組織(A-NM)和遠離腫瘤的非惡性組織(D-NM)的勻漿中幾種蛋白酶樣肽酶的活性，發(fā)現(xiàn)腫瘤相鄰的A-NM中CTSL的活性顯著高于D-NM組織。與正常組織相比，在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和甲狀腺癌中，也有CTSL酶活性增加的報道，這提示CTSL表達上調(diào)與疾病進展有密切關(guān)系[20]。同時研究發(fā)現(xiàn)CTSL參與卵巢癌細胞的增殖和侵襲，CTSL在卵巢癌(ovarian cancer，OC)中過度表達，CTSL的下調(diào)則能顯著抑制了人卵巢癌細胞(skov3)的增殖和侵襲能力，而CTSL在ov90細胞中的上調(diào)則會產(chǎn)生相反的效果。與OC細胞相比，在裸鼠體內(nèi)CTSL沉默細胞發(fā)育成腫瘤的能力降低，而這些細胞的異種移植瘤生長明顯受到抑制[21]。大量文獻資料表明癌癥組織CTSL的表達水平顯著高于正常組織，其中腎和睪丸腫瘤表達的CTSL水平最高，多數(shù)乳腺癌表達的CTSL水平較高。CTSL的過表達與人類動脈粥硬化和主動脈瘤(aortic aneurysm，AA)的發(fā)生發(fā)展同樣有著密切聯(lián)系[22]。重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑C具有較高的抗蛋白酶活性，主要通過抑制CTSL活性，達到抑制癌細胞的生長和侵襲的效果[23]。在主動脈瘤中，當(dāng)不存在半胱氨酸蛋白酶抑制劑C時，CTSL的活性增強，促進了微血管形成、細胞凋亡、白細胞黏附及細胞增殖，從而導(dǎo)致AA病變面積的增大以及動脈管腔直徑增大。因此CTSL和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C可能與AA存在相關(guān)關(guān)系[24]。以CTSL結(jié)構(gòu)特點為治療腫瘤的突破點，中國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)阿斯非芬酯及其類似物能與CTSL形成氫鍵，與其緊密結(jié)合，從而抑制癌細胞的增殖和遷徙[25]?？傊?，通過敲除卵巢癌細胞和乳腺癌細胞的CTSL基因來減少腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，增強膠質(zhì)瘤細胞對放射治療敏感性[26-27]的方法已逐步為我們所重視。除此之外，在以后的研究中，CTSL極有可能成為人類惡性腫瘤的診斷或預(yù)后標(biāo)志物，這將對惡性腫瘤的提前診斷具有積極的意義。

3.4 維持心肌穩(wěn)態(tài)中的作用

溶酶體CTSL作為心肌內(nèi)的穩(wěn)態(tài)蛋白酶，是心臟形態(tài)和功能的關(guān)鍵，對于維持心臟的正常運行發(fā)揮著重要的作用。心肌病(cardiomyopathy)是以進行性心肌重塑為特征的一組異質(zhì)性心臟病，會導(dǎo)致心臟泵功能受損[28]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，缺乏CTSL的心肌細胞含有多個大且明顯融合的溶酶體，用于儲存電子致密的異質(zhì)材料，同時發(fā)現(xiàn)該小鼠心肌的中間質(zhì)纖維化和多核化，這兩者也都是人心肌病的特征。缺乏CTSL的小鼠顯示出明顯的心室和心房擴大，且檢測到異常心律，如室上性心動過速、室性期外收縮等，超聲心動圖和心電圖檢查結(jié)果顯示小鼠左心室肥大，這很可代表著缺乏CTSL的小鼠對心臟損害的適應(yīng)性反應(yīng)[29]。在正常小鼠中，CTSL可通過阻斷AKT/GSK3β信號通路，延緩心力衰竭進展，改善心功能，抑制心肌肥厚、炎癥和纖維化，而CTSL缺乏則可導(dǎo)致小鼠心功能衰退及梗死后心肌重建，最終有可能發(fā)展為晚發(fā)性擴張型心肌病(DCM)[28,30]。在對擴張型心肌病研究中發(fā)現(xiàn)，DCM患者外周血單個核細胞中CTSL酶活性明顯高于健康對照組，CTSL的功能水平與心臟左室功能不全的嚴(yán)重程度有很強的相關(guān)性。這表明CTSL參與了擴張型心肌病的發(fā)病機制，CTSL可能成為評估擴張型心肌病嚴(yán)重程度的血基標(biāo)志物[31]。同時小鼠CTSL的缺乏影響新生小鼠心肌細胞的內(nèi)溶酶體系統(tǒng)。盡管這些囊泡缺乏溶酶體儲存材料并且他們的形態(tài)也有所改變，但這并不影響酸性細胞器的數(shù)量增加。酸性細胞區(qū)室缺陷將導(dǎo)致復(fù)雜生化和細胞反應(yīng)以及細胞骨架蛋白和線粒體損傷[32]。CTSL和酸性細胞區(qū)室缺乏的，提出了如何改變細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)用以誘導(dǎo)肥大反應(yīng)導(dǎo)致心臟擴張的問題[28]。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)CTSL還能參與心臟信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少了用于從受體發(fā)出信號的時間跨度和受體再循環(huán)的速率。這種信號的提前終止能降低細胞溶質(zhì)激酶(如AKT)的活化狀態(tài)，因此降低了受攻擊的小鼠心肌的肥大反應(yīng)[33]。在心臟重塑和修復(fù)中也扮演著重要的角色。主要位于溶酶體區(qū)室的CTSL，在中性pH條件下,其他蛋白酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶)可分泌和激活一部分酶原，其中活化的胞外CTSL也可處理ECM蛋白，如纖連蛋白、層粘連蛋白，這對于心臟重塑和修復(fù)極為重要[34]。

3.5 寄生蟲病防治方面作用

肝片吸蟲病(fasciolosis)是由肝片形吸蟲(Fasciolahepatica)寄生引起的人獸共患病，肝片吸蟲病在我國是危害最嚴(yán)重、覆蓋范圍最廣的反芻動物寄生蟲病之一,不但引起患病動物的生產(chǎn)能力降低，同時還會引起畜產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量的顯著下滑，對畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[35-36]。因此，如何防治吸蟲病成為一個亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)幼年肝吸蟲分泌的CTSL是可行的疫苗靶標(biāo)[37]。它存在于吸蟲屬(Fasciolaspp.)的排泄和分泌物中，用重組肝CTSL1蛋白酶對弗西尼亞牛進行免疫接種，與對照組相比，吸蟲負(fù)荷減少48.2%[38]。同屬于半胱氨酸蛋白酶家族的CsCPL可能參與華支睪吸蟲寄主蛋白質(zhì)的營養(yǎng)分解代謝，CsCPL可作為一種潛在的華支睪吸蟲疫苗抗原和藥物靶標(biāo)，用來預(yù)防和治療華支睪吸蟲感染病[39]。同時據(jù)Sansri等[40]的研究發(fā)現(xiàn)，接種重組幼年特異性CTSL的小鼠可預(yù)防大片吸蟲(Cyciolagigantica)感染。在吸蟲防治中，有科學(xué)家另辟蹊徑，在免疫保護試驗中利用肝片吸蟲的亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase)和CTSL1單獨作為抗原，試驗效果不盡相同。但Ortega-Vargas等[41]將肝片吸蟲FhLAP和FhCL1抗原序列組成嵌合蛋白(rFhLAP-CL1)，對綿羊進行免疫，免疫綿羊的rFhLAP-CL1特異性IgG1和IgG2等水平迅速升高，明顯高于對照組，表明嵌合蛋白對肝片吸蟲感染具有中度保護作用。這提示我們rFhLAP-CL1有做為疫苗的巨大潛力。布魯氏錐蟲可引起一種流行于非洲的家畜血液性疾病——干拿病。該病嚴(yán)重影響家畜的生產(chǎn)生活，對養(yǎng)殖企業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。半胱氨酸蛋白酶抑制劑的化學(xué)試驗證明，TbCATL對布魯氏錐蟲存活至關(guān)重要，溶酶體室中的TbCATL是決定半胱氨酸蛋白酶的大部分活性的關(guān)鍵酶。乙烯基砜化合物L(fēng)U102選擇性地抑制了錐蟲中TbCATL的活性，從而達到殺死布魯氏菌的目的，TbCATL抑制劑可能成為未來錐蟲藥物開發(fā)新的方向[42]。

3.6 抗原遞呈方面的作用

多項研究表明，CTSL在動物抗原遞呈方面發(fā)揮重要作用。CTSL在皮質(zhì)胸腺上皮細胞Ii(固定鏈)降解和CD4+T細胞選擇中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CTSL負(fù)責(zé)質(zhì)胸腺上皮細胞(cortical thymic epithelial cell, CTEC)的特異性Ii降解后期,而主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類抗原表達的關(guān)鍵步驟便是胸腺Ii的降解。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新合成的MHC類分子與恒定鏈(Ii)結(jié)合形成(αβIi)3九聚體，在恒定鏈胞漿端信號肽引導(dǎo)下，經(jīng)高爾基體進入上述內(nèi)吞系統(tǒng)，在那里胸腺Ii被CTSL快速降解，但II類相關(guān)的恒定鏈短肽(CLIP)仍結(jié)合在MHCII類分子肽結(jié)合槽內(nèi)；在HLA-DM分子協(xié)助下，將CLIP降解，使抗原肽與MHC類分子結(jié)合形成抗原肽MHC I類分子復(fù)合物；后者轉(zhuǎn)運至細胞表面，供成熟的CD4+T細胞識別[43]。CTSL為我們通過靶向特異性溶酶體酶調(diào)控CD4+T細胞和干預(yù)自身免疫提供新思路。最近就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在仔豬感染肺炎支原體期間，通過CTSL參與抗原呈遞途徑來促進IgA的分泌，導(dǎo)致CD4+T細胞百分比和MHC II分子水平升高，增強豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)黏膜免疫，進而為仔豬提供有效保護[44]。

4 總結(jié)與展望

自CTSL發(fā)現(xiàn)之日起，人們對其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進行了廣泛研究。隨著近年來科學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展和多種檢測手段的更新，人們對于CTSL有了更加深入的認(rèn)識，并將這些知識應(yīng)用到臨床疾病治療和藥物開發(fā)中。在癌癥治療方面，有人利用CTSL的陽離子和親水性殘基可與氧化石墨烯吸附的特性[45]，將氧化石墨烯做為該類酶的吸附劑，用于減緩癌癥擴散，轉(zhuǎn)移。還有人利用CTSL的抑制劑與該類酶結(jié)合，抑制酶的活性，來達到治療和抑制腫瘤目的。在農(nóng)業(yè)方面，有人利用CTSL做為吸蟲疫苗抗原和藥物靶標(biāo)，用于治療吸蟲病，為畜牧業(yè)挽回巨大經(jīng)濟損失?？傊?，只有充分了解了CTSL的生理特性以及CTSL在不同動物機體、不同發(fā)育階段中發(fā)揮的作用，才能利用這些特性制定出有針對性的研究方案，更好地為人類和動物疾病的治療和預(yù)防做出貢獻。

雖然人們對CTSL的研究已取得了一定的進展，但這只是冰山的一角，CTSL研究仍有許多未知領(lǐng)域需要進一步探索。隨著今后研究手段的不斷提高，CTSL在癌癥治療、寄生蟲病防治和促進神經(jīng)遞質(zhì)合成等領(lǐng)域必將得到更加深入的發(fā)掘，CTSL研究擁有廣闊的前景。