陳華峰 郭冰冰 代龍軍 楊洪 趙溪竹 王立豐

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所)

植物激素生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸在林木生長發(fā)育和抗逆生理中具有重要作用[1]。國際上認定的主要激素，為生長素類(IAA)、赤霉素類(GAs)、細胞分裂素類(CKs)、脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、油菜素內(nèi)酯類(BRs)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、獨腳金內(nèi)酯類(SLs)，分別在促進植物生長、催芽[2]、促進莖的伸長、開花[3]、果實膨大[4]、抗逆、早熟、抗病、抗蟲等過程起到關(guān)鍵作用；植物激素還存在劑量效應(yīng)和交互作用[5-6]；因此植物外源和內(nèi)源激素含量的分析與檢測，在理論研究和實際生產(chǎn)中具有重要地位。近年來植物激素檢測方法進展迅速，前處理技術(shù)主要采用固相萃取(SPE)小柱；檢測方法主要采用酶聯(lián)免疫法、氣相色譜、液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用、毛細管電泳、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用等[7]。檢測數(shù)量從單一激素檢測[8]多達39種激素同時檢測[9]。為植物生理、食品科學(xué)和遺傳育種等學(xué)科的發(fā)展提供了精準的定量化技術(shù)。

天然橡膠產(chǎn)業(yè)，長期以收集膠乳作為工業(yè)原料為主，以木材、種子等其他生物量開發(fā)利用為輔[10]。橡膠樹多以芽接苗[11]、組培苗[12]等作為種植材料，種植后6～8 a，樹干周長超過50 cm后，割取樹皮，取韌皮部乳管細胞的膠乳[13]。在橡膠樹中已經(jīng)證明，激素對橡膠生物合成[14]、芽接苗砧穗結(jié)合[15]、橡膠樹乳管分化[16]、愈傷組織誘導(dǎo)[17]等均具有重要作用；已經(jīng)相繼研究出樹皮茉莉酸含量[18]、茉莉酸自顯影[19]、氣相色譜檢測乙烯[20-21]、膠乳中4種植物激素(生長素、玉米素、赤霉素、脫落酸)的檢測方法[22]。隨著分子生物學(xué)在天然橡膠研究中不斷拓展和從產(chǎn)量目標向質(zhì)量目標的轉(zhuǎn)變[23]，植物激素在橡膠樹葉片和枝條等部位的功能持續(xù)得到挖掘和拓展[24-25]。建立橡膠樹葉片和枝條等部位的簡便、快捷的激素檢測方法，對橡膠樹基礎(chǔ)理論研究和技術(shù)研發(fā)具有重要意義。為此，本研究在借鑒已有研究成果基礎(chǔ)上，以2002年定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊的巴西橡膠樹(HeveabrasiliensisMuell. Arg.)熱研73397的枝條和葉片為研究對象，采用安捷倫1260II高效液相色譜儀測定葉片和枝條中的生長素、玉米素、赤霉素、脫落酸，分析高效液相色譜技術(shù)在植物激素檢測中的應(yīng)用，優(yōu)化植物激素提取方法，建立了一種同時檢測巴西橡膠樹葉片和枝條中4種植物激素的檢測方法。旨在為精確定量研究橡膠樹排膠前后過程中激素信號的功能提供參考。

1 材料與方法

試驗樹種：巴西橡膠樹，品種為熱研73397；2002年定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊，2010年開割。用枝剪取樹干上部枝條和葉片，置于液氮中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器：安捷倫1260II高效液相色譜儀(美國安捷倫技術(shù)有限公司生產(chǎn))、RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))。

主要試劑：植物激素標樣玉米素(ZT，Z0876)、生長素(IAA，H8876)、赤霉素(GA3，48880)、脫落酸(ABA，A1049)、抗氧化劑二丁基羥基甲苯(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，BHT，B1378)，均購自Sigma公司。色譜純甲醇、乙腈購自德國MERCK公司。其他試劑均為分析純，購自生工生物工程公司。試驗用水為超純水，經(jīng)0.45 μm有機過濾器過濾；過濾柱為ProElut PXC 60mg/3mL 300/pkgPXC小柱，購自中國迪馬科技公司。

樣品提取和前處理方法：樣品的前處理方法，將采集的葉片、枝條樣品，用液氮密封保存，在避光條件下帶回實驗室。取葉片、枝條各0.5 g，在液氮中碾磨后，加入5 mL體積分數(shù)為80%色譜純的甲醇和質(zhì)量濃度為1 mg/L的抗氧化劑二丁基羥基甲苯，避光條件下4 ℃提取24 h。提取液在15 000 r·min-1、4 ℃條件，離心10 min。取出上清液，殘渣加入5 mL體積分數(shù)為80%色譜純的甲醇和質(zhì)量濃度為1 mg/L的抗氧化劑二丁基羥基甲苯，避光條件下4 ℃再次提取24 h、再次離心。合并2次上清液，濾紙過濾，加50 μL氨水，在40 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至水相。水相用濃度為0.1 mol·L-1的稀鹽酸調(diào)pH至3.0，樣品過固相萃取小柱。固相萃取小柱使用方法：首先采用10 mL甲醇活化，隨后用10 mL超純水平衡；將處理好的樣品注入固相萃取小柱，分別用10 mL濃度為0.1 mol·L-1的HCl、10 mL甲醇洗脫。洗脫液在40 ℃下減壓蒸發(fā)至近絕干，用1 mL的色譜純甲醇溶解、0.22 μm有機相針式濾器過濾、-80 ℃保存，用液相色譜儀檢測。

4種植物激素色譜檢測方法：色譜柱為美國Waters公司生產(chǎn)的CNWSIL C18液相色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。柱溫30 ℃；流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(磷酸)為15∶15∶70、pH為3.5的等度洗脫；流速為1 mL·min-1；進樣量為10 μL；檢測波長為254 nm。以標樣出峰時間和峰高疊加定性，用外標法對峰面積定量。

4種植物激素標準液和混合標準液的配制：分別稱取4種植物激素(玉米素、生長素、赤霉素、脫落酸，精確至0.001 mg)，用色譜純甲醇溶解，至終質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中避光保存，置于冰箱中設(shè)置4 ℃保存?zhèn)溆??；旌蠘藴室旱呐渲茣r，準確吸取各組分適量的標準液混合，用色譜甲醇定容，轉(zhuǎn)移到棕色試劑瓶中，置于冰箱中設(shè)置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4種植物激素標準曲線設(shè)計和檢出限確定：配置曲線質(zhì)量濃度為0.001、0.010、0.100、0.500、1.000、2.000、10.000 mg·L-1的標準質(zhì)量濃度系列，經(jīng)液相色譜儀檢測后，以標準系列對應(yīng)的峰面積為縱坐標，標準系列質(zhì)量濃度為橫坐標，建立坐標系進行線性分析，得到4種激素的標準曲線方程。由3倍基線噪音得到的檢測量作為檢出限(Lod)，10倍基線噪音得到的檢測量作為定量下限(Loq)。將上述估計的Loq值作為樣品的添加質(zhì)量濃度，做7次重復(fù)，計算出其標準偏差。Lod、Loq計算公式為：Lod=t×S、Loq=3×Lod。式中：t是自由度為n-1、置信度為99%時的t值(本試驗7次重復(fù)，n=7，自由度為6，參考t值表，取t值為3.143)；S為n次平行測定的標準偏差。

4種植物激素的檢測回收率計算方法：取橡膠樹葉片，經(jīng)粉碎均勻后稱量成0.1 g的小份，分別加入10 μg激素標準樣品，靜置30 min，按“樣品提取和前處理方法”提取后，進行回收試驗。每個添加水平重復(fù)3個樣本，每個樣本重復(fù)測定6次，計算平均回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種植物激素混合樣品的色譜檢測結(jié)果

將激素質(zhì)量濃度分別為0.1 mg·L-1的玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸標準品混合后，按照此色譜檢測方法進行檢測，分析效果。結(jié)果表明，該方法可一次性將4種植物激素在15 min內(nèi)全部檢測出來(見圖1)。由圖1可見：4種激素洗脫的先后順序為玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸，洗脫時間分別在2.166、3.871、8.133、13.405 min，峰面積分別為3 549、70 609、751 048、3016，峰面積占比分別為0.43%、8.53%、90.68%、0.36%，峰高分別為733、1 686、33 438、107。4種激素區(qū)分效果明顯，檢測時間短。

圖1 4種植物激素混合標準品色譜圖

2.2 4種植物激素混標樣的色譜檢測曲線和檢出限

在檢測方法成功的基礎(chǔ)上，為了建立回歸方程和檢出限，進一步將質(zhì)量濃度為0.001、0.010、0.100、0.500、1.000、2.000、10.000 mg·L-1的4種激素標準樣品進行高效色譜檢測，根據(jù)檢測結(jié)果建立回歸方程、計算檢出限(見表1)。

表1 4種植物激素高效液相色譜檢測回歸方程和最低檢出限

2.3 巴西橡膠樹葉片和枝條中4種激素質(zhì)量分數(shù)測定

在建立標準曲線的基礎(chǔ)上，取0.5 g健康橡膠樹綠熟期葉片、枝條進行4種植物激素質(zhì)量分數(shù)測定。結(jié)果表明，所有樣品均可在2.195、3.838、8.053、13.893 min鑒定出4種植物激素的特異峰(見圖2)。按照回歸方程計算得出，正常橡膠樹綠熟期葉片玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸質(zhì)量分數(shù)(以鮮葉質(zhì)量計算)分別為151.17、190.77、0.19、37.10 μg·g-1；正常的枝條玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸質(zhì)量分數(shù)(以鮮枝條質(zhì)量計算)分別為1 581.64、5.07、0.12、65.85 μg·g-1。葉片中赤霉素質(zhì)量分數(shù)最高，枝條中玉米素、脫落酸質(zhì)量分數(shù)相對較高。

圖2 巴西橡膠樹葉片中4種植物激素色譜圖

2.4 4種植物激素的加標回收率

將熱研73397葉片經(jīng)粉碎均勻后稱量0.1 g，分別加入10 μg激素標準樣品，靜置30 min，待其充分混入樣品后，進行激素提取和測定分析。經(jīng)計算，采用本方法測定的4種激素玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸，加標回收率分別為85.63%、106.31%、90.91%、109.13%(見表2)，符合標準，進一步證明了本方法的可靠性。

表2 巴西橡膠樹葉片4種激素加標回收率

3 結(jié)論與討論

由于植物激素具有痕量且又重要的特點，其測定中最大難度是植物激素檢測不靈敏，或是內(nèi)源激素濃度變化范圍大[26]。因此，人們不斷創(chuàng)新激素檢測方法，如早期的同位素示蹤分析乙烯[27]，用放射免疫檢定法測定玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸等[28]，到最新的氣相、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用等[29-30]。樣品提取總的要求是盡可能完全地提取出所含植物激素成份，盡量少提取出干擾物質(zhì)。在選擇提取溶劑時，選擇和待測植物生長調(diào)節(jié)劑極性相近的溶劑，并且提取劑不能與樣品發(fā)生反應(yīng)，毒性較低[29]。對非極性的植物生長調(diào)節(jié)劑，可以用非極性溶劑提取，也可用混合溶劑提??；對含水量較高的樣品，如蔬菜[31]、水果[32]等，宜用極性溶劑，常用的提取劑有甲醇、丙酮、乙醇、乙腈等。由于林木中激素含量變化幅度較大，如采用用放射免疫檢定法測定土耳其櫟等14種林木的玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種激素濃度變化分別在7.1～50.4 nmol·L-1、0.9～22.7 mg·L-1、40～750 nmol·L-1、30～920 nmol·L-1[28]，因此，人們常在前處理優(yōu)化和檢測程序上優(yōu)化提取和檢測方法。在提取時，通常加入正己烷、乙酸乙酯、鹽酸增加提取效率[33]。龔明霞等[34]根據(jù)玉米素分子中嘌呤環(huán)側(cè)鏈末端帶1個極性羥基、生長素分子中碳鏈末端帶有1個極性羧基、赤霉素分子中弱極性的碳環(huán)被極性的基團(羥基、羧基、酯基)包圍而使得整個分子具有中等極性、脫落酸帶有極性的羥基和羧基，設(shè)計梯度洗脫檢測植物中激素。易勇等[35]分析海藻玉米素、吲哚丁酸、吲哚乙酸、脫落酸這4種激素，在前處理部分采用體積分數(shù)為70%的甲醇提取，加了抗氧化劑二丁基羥基甲苯防止氧化，同時分別采用混合型弱陽離子交換和混合陰離子交換柱兩種固相小柱凈化，回收率達90%以上。本研究中，采用體積分數(shù)為80%色譜純的甲醇提取，只用固相萃取小柱一次凈化，加標回收率在85.63%～109.13%(見表2)，這與已有研究結(jié)果相一致。

適合的甲醇濃度既可以提高生長素的提取效率，又可以保證4種植物激素能夠有效分開。劉婷等[36]建立了根際促生菌玉米素、生長素、脫落酸的檢測方法，發(fā)現(xiàn)僅以甲醇-水為流動相，其色譜圖峰形畸變、不對稱，且拖尾嚴重，加入一定的乙酸抑制溶質(zhì)的離子化，使分離得到改善。本研究中，進一步采用V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(磷酸)為15∶15∶70、pH為3.5的等度洗脫，4種激素在15 min內(nèi)即可得到完全分離。王杏等[32]在20 min之內(nèi)檢測出果樹中玉米素、生長素、脫落酸等6種植物激素，本研究結(jié)果的洗脫時間與文獻[32]的相近；在方法的檢出限方面，本研究結(jié)果的檢出限(0.5～3.1 μg·L-1)與文獻[32]的檢出限(1.4～30 μg·L-1)近似。李華等[37]建立了枇杷果實中10種激素的檢測方法，加標回收率在58.6%～85.2%，這既與果實中成分復(fù)雜、干擾率高有關(guān)，也與激素檢測次數(shù)過多有關(guān)，可見一次性檢測4種激素的準確度更高。

針對橡膠樹已經(jīng)分別建立了膠乳中4種激素的檢測方法，其中：玉米素采用等度洗脫方法，赤霉素、生長素、脫落酸采用梯度洗脫方法，這些方法存在無法一次性檢測4種激素的缺點，且回收率在70%～92%之間。

本研究采用液氮研磨處理巴西橡膠樹葉片和枝條，體積分數(shù)為80%色譜純的甲醇暗中抽提24 h，離心后減壓蒸發(fā)后過固相萃取小柱淋洗，用鹽酸和色譜純的甲醇洗脫后，1 mL甲醇溶解提取物。樣品測定采用安捷倫1260II高效液相色譜儀，反相色譜柱CNWSIL C18 4.6 mm×150 mm 5 μm，柱溫30 ℃；流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(磷酸)為15∶15∶70、pH為3.5的等度洗脫。檢測限低至0.5 μg·L-1，加標回收率在85.63%～105.13%。本研究檢測方法，建立了橡膠樹葉片和枝條的簡便、快捷的激素檢測方法，可為精確定量研究橡膠樹排膠前后過程中激素信號的功能提供參考。