梁敏，蔡慧慧，周佩燕，譚智瓊*

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州510700；2.廣東省人民醫(yī)院兒童血液科，廣東 廣州510000；3.廣州市白云區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東 廣州510000）

肝母細胞瘤（hepatoblastoma，HB）是兒童最常見的肝臟惡性腫瘤，占所有兒童肝臟惡性腫瘤的2/3，年發(fā)病率為0.5%～1.5%［1］。肝母細胞瘤是0-5歲兒童最常見的兒童肝臟惡性腫瘤之一，其發(fā)病年齡多為出生后6 個月至3 年，在小兒腹部實體腫瘤中的發(fā)病率排第三位［2］。肝母細胞瘤的病因和發(fā)病機制目前尚未完全闡明。目前，Beckwith-Wiedemann 綜合征、家族性腺瘤性息肉病和18 三體綜合征是其公認的先天性危險因素。此外患兒母親若患羊水過多、子癇、孕期早期肥胖、吸煙史、以及新生兒出生體重＜1500 g 等因素，亦會進一步增加HB 的發(fā)病概率［2-4］。目前HB 的治療主要仍是以鉑類為主的化療聯(lián)合根治性手術治療為主。但是，肝臟病灶往往無法完全切除，手術后的復發(fā)轉移常常導致患者預后不佳，同時鉑類藥物會引起患兒聽力損害等副作用，亦是限制其治療的因素［5］。目前公認的分子生物學標志物仍未被發(fā)現(xiàn)，因此深入開展HB 的分子遺傳學研究將有助于制定更加精準的危險度分層體系，進而為HB 患者的治療提供有效靶點。因此，完善發(fā)病的分子機制和尋找有效的治療靶點是目前HB 治療最為迫切的需要。

lncRNA 是一類非編碼蛋白、轉錄本長度超過200nt 的非編碼RNA 分子，其編碼基因廣泛分布于基因組內［6］。與miRNAs 和其他較小的非編碼RNA不同，lncRNAs 可以通過多種途徑在轉錄和轉錄后水平上通過順式和反式調節(jié)作用來調節(jié)下游靶基因。LncRNA ADAMTS9-AS2 是一種位于人染色體3p14.1，由2 258 個核苷酸組成，是含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶9（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif 9，ADAMTS9）基因的反義RNA，其已被報道在膠質瘤［7］、肺癌［8］.、卵巢癌［9］、胃癌［10］和唾液腺癌［11］.中發(fā)揮重要的生物學作用。然而，對于 LncRNA ADAMTS9-AS2 在肝母細胞瘤中的表達及生物學效應目前尚不清楚?；诖?，本研究通過探索LncRNA ADAMTS9-AS2 在肝母細胞瘤中的表達特性及其與臨床病理特征的聯(lián)系，研究LncRNA ADAMTS9-AS2 在肝母細胞瘤中的分子機制，為探尋出新的分子生物學標志物和有效的治療靶點提供理論基礎，對改善肝母細胞瘤的患兒的臨床預后具有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織樣本信息

本研究共收集45 對肝母細胞瘤組織和配對的正常組織標本，并且對其臨床病理特征進行評價。所有參與本研究的組織標本均購于廣州鋮銨生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

本研究所采用的正常人肝細胞（L02）、肝母細胞瘤細胞（HepG2 和Huh6）均從中國上海公司ATCC 獲得。將細胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的McCoy’ s5a 培養(yǎng)基中（Gibco，Grand Island，NY，USA）以37°C、5%CO2 的環(huán)境培養(yǎng)。每24 h 更換一次培養(yǎng)基，細胞密度超過70%時，以0.25%胰酶消化進行傳代培養(yǎng)

1.3 細胞轉染

采用ADAMTS9-AS2 質粒載體（pc-ADAMTS9-AS2）以上調LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達。取指數生長期的HepG2 細胞按1.2 方法進行培養(yǎng)。待HepG2 細胞密度為70%～80%時，使用lipofectamine 3000 轉染試劑將pc-ADAMTS9-AS2 質?；蚩蛰d質粒（pc-NC）以2 000 ng/孔轉染到HepG2 細胞中。轉染48 h 后，采用RT-qPCR 檢測不同轉染組中LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達水平。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測

首先，從冰凍組織和細胞系中提取總RNA（TRIzol；Invitgen，USA），然后用PrimeScript RT Master Mix（T Akara）將其轉錄為cDNA。隨后，使用試劑盒（SYBR PreMix Ex T AQ II Kit；T Akara）分析LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達。最后，采用2-ΔΔCT方法對蛋白質的折疊變化進行評價，并以磷酸甘油醛脫氫酶作為內源性參照。引物序列如下：ADAMTS9 AS2：forward 5′-TTTACCATGCGCTGAGTGAG-3′，reverse 5′AAAGTTGCGTCATGCTTCGG-3′；GAPDH：forward 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，reverse 5′-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。

1.5 CCK-8 測定

首先，將LncRNA ADAMTS9-AS2 過表達的肝母細胞瘤細胞株從培養(yǎng)瓶中收集并接種于96 孔板中（5×103個細胞/孔）。經培養(yǎng)24、48、72、96 h 后，每孔加入含10% CCK-8 溶液100 μL。最后，使用微型平板讀取器（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）讀取每孔的A值。

1.6 Transwell 遷移和侵襲實驗

為了解LncRNA ADAMTS9-AS2 對肝母細胞瘤的細胞遷移影響，我們將細胞消化并適度稀釋，平板計數儀檢測細胞密度。Transwell 小室上層預先用Matrigel 基質膠包被，再將含5×104個轉染細胞的細胞懸液加入200 μL 無血清培養(yǎng)基接種于小室上層；小室下層加入600 μL 含20%血清的培養(yǎng)基。24 小時后用4%多聚甲醛固定細胞，2.5%結晶紫染色20 min，在光學顯微鏡下隨機選取5 個視野拍照并計數，重復3 次。

1.7 上皮細胞-間充質轉化（EMT）分析及其相關蛋白印跡分析

為了解LncRNA ADAMTS9-AS2 對肝母細胞瘤的上皮細胞-間充質轉化影響，將收集的細胞加入適量RIPA 裂解液提取新鮮冰凍組織或者細胞的總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，每個孔的上樣量調整為15 μg，經SDS-PAGE（10%）凝膠電泳后，凝膠蛋白轉移到硝酸纖維素膜。經過5%BSA 封閉后，以E-Ca，N-Ca，Vimentin，Slug 一抗（1 ∶1 000），GAPDH抗（1 ∶1 000）置4 ℃冰箱孵育過夜。次日，經PBST洗滌3 次后，以二抗（1 ∶1000）常溫孵育2 h。經PBST 洗滌3 次，ECL 化學發(fā)光法顯像并保存圖像。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 臨床表達與臨床參數相關性

通過對癌旁正常組織與肝母細胞瘤中LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達量分析，我們可以知道，相對于癌旁正常組織，肝母細胞瘤病灶中LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達水平較其配對癌旁正常組織明顯下調。見圖1。臨床病理特征相關性分析顯示肝母細胞瘤患者組織中ADAMTS9-AS2 的表達高低與患者的年齡、性別（P＞0.05）無關，而與腫瘤大小、組織類型、淋巴結轉移情況有關。（P＜0.05，表1）。并且，LncRNA ADAMTS9-AS2 高表達狀態(tài)往往預示著患兒腫瘤病灶小、組織分化程度好和淋巴結陰性等臨床病理特點。

圖1 LncRNA ADAMTS9-AS2 在人肝母細胞瘤組織和癌旁正常組織中的表達水平比較

表1 LncRNA ADAMTS9-AS2 表達量和肝母細胞瘤患兒臨床病理特征的關系

2.2 肝母細胞瘤細胞內LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達水平及LncRNA ADAMTS9-AS2 低表達的細胞模型構建

為證實LncRNA ADAMTS9-AS2 是否與肝母細胞瘤發(fā)生發(fā)展相關，我們檢測肝母細胞瘤細胞與人正常肝細胞中LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達水平，RT-qPCR 結果顯示：相對于人正常肝細胞（L02），LncRNA ADAMTS9-AS2 在Huh6 細胞和HepG2 細胞中的表達水平均明顯下調，其中HepG2 細胞在所有肝母細胞瘤細胞中呈現(xiàn)相對低表達狀態(tài)（圖2A）?；诖?，接下來我們利用HepG2 細胞株進行實驗。本研究利用質粒轉染技術構建LncRNA ADAMTS9-AS2 過表達的HepG2 細胞株，結果提示：相對于陰性對照組（pc-NC），質粒轉染組可顯著增強HepG2 細胞內LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達水平（圖2B），這提示LncRNA ADAMTS9-AS2 過表達的HepG2 細胞模型被成功構建。

2.3 過表達LncRNA ADAMTS9-AS2 顯著抑制肝母細胞瘤細胞的增殖能力

在HepG2 細胞內LncRNA ADAMTS9-AS2 明顯過表達后（圖2A），CCK-8 檢測結果顯示：在HepG2細胞中，實驗組（OE-LncRNA ADAMTS9-AS2）的細胞增殖能力明顯低于對照組（OE-vector）（P＜0.001，圖3）。這說明上調細胞內LncRNA ADAMTS9-AS2的表達能顯著抑制肝母細胞瘤細胞的增殖能力。

圖2 肝母細胞瘤細胞內LncRNA ADAMTS9-AS2 的表達水平及LncRNA ADAMTS9-AS2 低表達的細胞模型構建

圖3 上調ADAMTS9-AS2 的表達后能顯著抑制HepG2 細胞株的體外增殖能力

2.4 過表達LncRNA ADAMTS9-AS2 后能顯著抑制肝母細胞瘤細胞的侵襲及轉移能力

為了進一步探究LncRNA ADAMTS9-AS2 對肝母細胞瘤細胞侵襲轉移能力的影響，在本研究中我們還進行了Transwell 實驗，其結果顯示：在HepG2 細胞中，pc-ADAMTS9-AS2 組的細胞遷移能力（P＜0.001；圖4）和侵襲能力（P＜0.001；圖4）均較pc-NC 組明顯下降。這說明過表達LncRNA ADAMTS9-AS2 后能顯著抑制肝母細胞瘤細胞的侵襲及轉移能力。

圖4 增強ADAMTS9-AS2 的表達后，HepG2 細胞的侵襲能力和轉移能力檢測

2.5 過表達ADAMTS9-AS2 抑制上皮-間充質轉化（EMT）

為了進一步探究ADAMTS9-AS2 對肝母細胞瘤細胞侵襲轉移能力的影響，對對照組（pc-NC）和實驗組（pc-ADAMTS9-AS2）進行上皮-間充質轉化（EMT）相關蛋白的蛋白印跡分析，實驗結果表明，pc-ADAMTS9-AS2 組中，代表上皮細胞-間充質轉化的E-Ca 蛋白表達顯著升高，蛋白N-Ca 和Vimentin表達顯著降低。在腫瘤EMT 的過程中，E-Ca 蛋白的減少和N-Ca 的增加起重要的推動作用。因此，此結果說明ADAMTS9-AS2 的過表達能夠顯著抑制肝母細胞瘤細胞的上皮-間充質轉化（EMT），抑制腫瘤轉移。見圖5。

圖5 過表達ADAMTS9-AS2 抑制上皮-間充質轉化

3 討論

HB 在全球發(fā)生率為5/10 萬～15/10 萬［12］。近年來HB 的發(fā)病率以每年4%的速度增長，大于其他兒童腫瘤的發(fā)病率增長速度［13］。由于HB 手術和化療方案的改良，患兒預后較以往得到很大改善，但是，相對于其他兒童實體腫瘤的治愈率仍較低。目前HB 的病因仍不清楚，有研究指出，HB 在家族性腺瘤息肉病患者中較多見。并有研究指出MPO、SULT、等基因也與HB 的發(fā)生發(fā)展密切相關［14］。HB 可能還與子癇前期、羊水異常、父母生育功能障礙等有關?；純弘p親吸煙對HB 的形成也有促進作用［15］.但總的來說，目前HB 的根本病因仍不清楚。因此，闡明HB 的內在分子機制可能為肝母細胞瘤患兒的治療帶來新的啟發(fā)。隨著分子生物學的進步，尋找肝母細胞瘤的關鍵調控靶標成為了可能，完善發(fā)病的分子機制和尋找有效的治療靶點可為臨床治療HB 提供關鍵性的指導作用。

據今年研究報道，ADAMTS9 基因在鼻咽癌、乳腺癌、胃癌和結腸癌等多種癌癥中均以抑癌基因的功能被報道，其在抑制細胞增殖、抑制腫瘤轉移和血管生成方面具有顯著的作用［16-19］。相關研究指出：于肺癌、胃癌、卵巢癌中也可觀察到ADAMTS9-AS2的異常低表達。以上研究表明，ADAMTS9-AS2 可能作為抑癌因子調控相關的細胞信號通路以調控癌細胞的增殖、凋亡和轉移等生物學行為［20-22］。因此，ADAMTS9-AS2 的低表達可預示著患者的預后不良。然而，肝母細胞瘤中的ADAMTS9-AS2 表達情況及其對肝母細胞瘤的生物學行為影響仍未被研究。因此，研究肝母細胞瘤中ADAMTS9-AS2 的表達方式和生物學功能具有重要意義。

基于以上背景，為明確ADAMTS9-AS2 在肝母細胞瘤中的生物學調控作用，本研究還通過realtime PCR 法在40 例配對的兒童肝母細胞瘤組織及外周正常組織標本中對ADAMTS9-AS2 的表達水平進行分析，結果發(fā)現(xiàn)肝母細胞瘤組織中ADAMTS9-AS2 的表達水平明顯低于癌旁正常組織。且臨床病理相關性分析表明，ADAMTS9-AS2 的低表達狀態(tài)往往預示著患兒腫瘤分化程度低、腫瘤分期晚以及淋巴結侵犯等腫瘤惡性表型。因此可推測，對于肝母細胞瘤患兒，ADAMTS9-AS2 的表達水平越低與患兒的預后差、死亡率高相關，ADAMTS9-AS2 有可能在肝母細胞瘤中起抑癌作用。同時，我們的實驗結果和以往在肺癌、胃癌、卵巢癌的研究中相一致。

為探究ADAMTS9-AS2 對肝母細胞瘤的生物學行為的影響，我們通過質粒轉染技術成功構建ADAMTS9-AS2 過表達的肝母細胞瘤細胞模型。研究結果提示，ADAMTS9-AS2 的過表達能顯著抑制肝母細胞瘤細胞的增殖能力。同時，在以往的研究中，ADAMTS9-AS2 在肺癌、胃癌、卵巢癌細胞中構建過表達細胞株，亦能顯著抑制其增值能力。L i 等人研究發(fā)現(xiàn)在結腸癌組織中的ADAMTS9-AS2 存在異常低表達，通過構建起過表達細胞系能夠顯著抑制起細胞的增殖能力［23］。本研究同時通過Transwell 實驗指出，ADAMTS9-AS2 對癌細胞遷移與侵襲轉移能力亦被抑制。同時，蛋白印跡實驗也指出，ADAMTS9-AS2 亦能抑制上皮-間充質轉化相關蛋白的表達，說明ADAMTS9-AS2 能夠抑制癌細胞的上皮-間充質轉化從而抑制癌細胞的轉移。

綜上所述，lncRNA ADAMTS9-AS2 通過抑制肝母細胞瘤細胞的增殖和轉移發(fā)揮抑癌基因的作用，為深入研究肝母細胞瘤發(fā)病及進展機制提供了理論依據。同時，ADAMTS9-AS2 作為早期肝母細胞瘤患者的預后因子，有望用于指導臨床治療和術后隨訪。其臨床應用和作用分子機制有待進一步研究。