韓光明，藍(lán)家樣，陳全求，張勝昔，李國(guó)榮

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中游棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430064）

生物炭作為一種環(huán)境友好型土壤改良劑已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)障礙性土壤的改良，對(duì)農(nóng)業(yè)土壤的質(zhì)量產(chǎn)生了積極的影響[1]。中國(guó)人口眾多，對(duì)基本農(nóng)產(chǎn)品的需求也較高，相對(duì)來(lái)說(shuō)可耕地面積并不充足，因而連作現(xiàn)象比較普遍。然而，棉田連作不僅引起土壤嚴(yán)重退化，進(jìn)而引起棉花產(chǎn)量下降。大多數(shù)農(nóng)民都采用土壤改良技術(shù)來(lái)幫助恢復(fù)土壤完整性[1]。盡管大多數(shù)研究關(guān)注使用生物炭對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的好處，長(zhǎng)期連續(xù)施用生物炭被證實(shí)對(duì)棉田土壤細(xì)菌群落的多樣性有顯著影響[2]，但生物炭處理對(duì)不同連作年限棉田土壤細(xì)菌群落及代謝途徑的研究相對(duì)較少[3-4]。事實(shí)上，很少有關(guān)于施用生物炭對(duì)長(zhǎng)期連作（超過(guò)20a）棉田土壤細(xì)菌群落組成的影響的研究。此外，這些研究也未能整合使用生物信息學(xué)技術(shù)提高研究結(jié)果和推論的準(zhǔn)確性[2]。因此，為了確定生物炭作為土壤改良劑應(yīng)用于多種長(zhǎng)期連作土壤而引起的土壤細(xì)菌群落的響應(yīng)，有必要整合生物信息學(xué)綜合分析技術(shù)以提高分析的可靠性[5]。通過(guò)探究在不同連作年限棉田中施用不同量的生物炭作為土壤改良劑對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，利用16SrRNA基因的高通量測(cè)序和基于生物信息學(xué)技術(shù)測(cè)定土壤細(xì)菌群落組成、關(guān)鍵物種、土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)和代謝功能，以及土壤微生物成分、比例和多樣性，以期為確定生物炭在不同連作年限棉田的最佳施用量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于新疆博樂(lè)市新疆金博種業(yè)中心的中試基地（北緯44°46′56.0”，東經(jīng)82°23′57.0”）。該地區(qū)位于新疆西北部的溫帶地區(qū)，與哈薩克斯坦接壤。年平均氣溫-17～23°C，平均降水量為181mm。選用湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所自育棉花（Gossypiumspp）品種ZD2040，該品種早熟抗黃萎病性強(qiáng)，青枝綠葉吐白絮。供試土壤樣品是從常規(guī)連續(xù)耕種5，10，20，40a棉田的表層（0～15cm）獲取的。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織（FAO）分類指南，獲得的采樣土壤分類為強(qiáng)淋溶土，粘土含量為66.3%。供試土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

供試生物炭為山東豐本生物科技有限公司生產(chǎn)，是玉米芯經(jīng)炭化爐高溫?zé)峤猥@得，加熱速率為10℃·min-1，加熱到550℃。供試生物炭的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 供試生物炭及土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of biochar and soil in the study

1.2 方法

為研究不同生物炭施用量（0，20，40t·hm-2）對(duì)不同連作年限（5，10，20，40a）棉田土壤細(xì)菌群落的影響，試驗(yàn)共設(shè)12個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，共36個(gè)試驗(yàn)區(qū)。在各試驗(yàn)區(qū)清除石頭和植物殘?jiān)?，將表層土與生物炭均勻混合。于2017年4月15日播種，行距50cm，株距10cm。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中采用人工除草，并在必要時(shí)澆水。生育期各試驗(yàn)區(qū)統(tǒng)一施用同種復(fù)合肥料（N∶P∶K=15∶15∶15）。

花鈴期（7月25日）在棉花植株周圍5cm的范圍內(nèi)0～15cm深的土壤中隨機(jī)取10個(gè)土壤樣本，每個(gè)樣本取土100g；將重復(fù)樣本混勻后裝入冰盒，6h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，1周內(nèi)分析理化參數(shù)。將一部分土壤樣品冷凍保存（-80°C），用于土壤微生物分析，另一部分進(jìn)行風(fēng)干，研磨、過(guò)篩（1～2mm）后進(jìn)行理化分析。

1.2.1 DNA提取及16SrRNA的PCR擴(kuò)增 參照HAN等[2]的方法，使用土壤微生物總DNA提取試劑盒（OmegaBio-Tec，Inc.，USA）從土壤樣品中直接提取基因組DNA。在1%瓊脂糖凝膠上運(yùn)行10μL的DNA樣品評(píng)估提取DNA的質(zhì)量。利用融合引物（正向引物341F：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG；反向引物805R：GACTGGAG TTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）通過(guò)PCR對(duì)微生物基因組DNA 16SrRNA V3～V4的高可變性區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體積50μL，包含5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液（日本TakaRa），10ng DNA模板，前后引物各0.5μL，0.5μL dNTPs和0.5μL白金聚合酶（TakaRa，日本）。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋撼跏?4℃3min，94℃30s，45℃退火20s，65℃退火30s，重復(fù)5個(gè)循環(huán)，隨后94℃持續(xù)20s，55℃持續(xù)20s和72℃持續(xù)30s，然后重復(fù)20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性測(cè)試，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化。

1.2.2 Illumina測(cè)序及數(shù)據(jù)處理 參考HAN等[2]的方法，略有改動(dòng)。使用Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）系統(tǒng)的雙端測(cè)序法對(duì)V3和V4擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制檢查，并使用Prinseq軟件（PRINSEQ-lite 0.19.5）刪除質(zhì)量較差的測(cè)序數(shù)據(jù)。使用Flash軟件（FLASH v1.2.7），在無(wú)錯(cuò)配的10bp讀段重疊的基礎(chǔ)上，組裝V3和V4雙端測(cè)序讀段，丟棄未組裝的讀段。從組裝的重疊群中適當(dāng)修剪編碼區(qū)和測(cè)序引物。使用Uclust軟件（Uclust v1.1.579）對(duì)序列進(jìn)行聚類，并使用3%的相似度將其分配給操作分類單位（OTU）。使用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)上核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)（RDP）樸素貝葉斯分類器（v.2.2），為每個(gè)序列分配分類學(xué)等級(jí)[6]。

1.2.3 分類地位鑒定 使用QIIME軟件實(shí)現(xiàn)操作分類單元（OTU）的識(shí)別，該軟件將OTU代表序列與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)的模板序列進(jìn)行比較，以獲得與每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的分類信息。每個(gè)特定的數(shù)據(jù)庫(kù)都用作不同類別序列的OTU分類狀態(tài)標(biāo)識(shí)的模板序列[7]。利用MEGAN軟件（http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan6/）[8]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和分類樹(shù)，將每個(gè)樣本中包含的OTU豐度信息和分類學(xué)組成數(shù)據(jù)映射到NCBI網(wǎng)站（https://www.NCBI.nlm.nih.gov/Taxonomy）提供的微生物分類學(xué)層次樹(shù)中，以在標(biāo)準(zhǔn)分類層次結(jié)構(gòu)中顯示每個(gè)分類級(jí)別上所有樣本的具體組成。通過(guò)GraPhlAn（Asnicar et al.2015）和Krona軟件[9]進(jìn)行比較分析。

1.2.4 群落多樣性分析 使用QIIME軟件通過(guò)Chao 1，Ace，Shannon和Simpson指數(shù)計(jì)算群落多樣性。根據(jù)OTU分類鑒定的結(jié)果計(jì)算每個(gè)樣品在屬水平下的組成。

1.2.5 主要物種的篩選 通過(guò)PLS-DA（偏最小二乘判別分析）進(jìn)行細(xì)菌的比較分析和關(guān)鍵物種的篩選。

1.2.6 微生物代謝功能的簇分布和預(yù)測(cè) 通過(guò)R軟件Venn圖分析計(jì)算唯一和共享功能組的數(shù)量。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)重要的微生物代謝功能（http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS、QIIME和R軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算均值差異，p值為0.05，使用LSD確定平均值之間的顯著差異。使用Mothur中的t檢驗(yàn)和Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）來(lái)比較差異，并使用R中mt.rawp2adjp功能的BH方法以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）調(diào)整所有p值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭對(duì)連作棉田細(xì)菌類別的影響

MiSeq Illuminas測(cè)序后，產(chǎn)生了超過(guò)400，000條有效序列，平均長(zhǎng)度為400bp。具有97%以上同一性序列分布在24，417個(gè)OTU中。通過(guò)MEGAN和Krona分析軟件對(duì)OTU進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明在屬水平3種生物炭施用量下，代爾夫特菌屬和蒼白桿菌屬被確定為連作棉田土壤中存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群（圖1），與棉花連作的年限無(wú)關(guān)。0t·hm-2生物炭處理的優(yōu)勢(shì)菌屬有乳酸桿菌屬、代爾福特菌屬、蒼白桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬、根瘤菌屬和甲基桿菌屬。20t·hm-2生物炭處理的優(yōu)勢(shì)菌屬有蒼白桿菌屬、代爾福特菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、根瘤菌屬、無(wú)色桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬、乳酸桿菌屬、甲基桿菌屬等。而40t·hm-2生物炭處理的優(yōu)勢(shì)菌屬有蒼白桿菌屬、代爾福特菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬、根瘤菌、鮭色沉積物桿狀菌屬、甲基桿菌屬和無(wú)枝酸菌屬。使用GraPhlAn分析進(jìn)一步證實(shí)了在20個(gè)相對(duì)豐富的細(xì)菌類群中，生物炭0t·hm-2施用量下單胞菌屬的豐度最高，而生物炭在20t·hm-2和40t·hm-2的施用量下蒼白桿菌屬豐度最高。而且，在生物炭處理區(qū)，變形桿菌綱、布魯氏菌科和叢毛單胞菌科的相對(duì)豐度顯著增加，而黃單胞菌和丙型變形菌的相對(duì)豐度降低（圖1）。

圖1 生物炭對(duì)長(zhǎng)期連作棉田土壤細(xì)菌分類學(xué)組成的影響Figure 1 Effect of biochar on bacterial taxonomy in long-term continuous cropping cotton fields

2.2 生物炭對(duì)連作棉田土壤細(xì)菌α多樣性的影響

使用多種指標(biāo)（Simpson、Chao 1、ACE和Shannon）表征供試土壤樣品中微生物群落的α多樣性?？偟膩?lái)說(shuō)，Chao1和Ace指數(shù)衡量了微生物群落的豐富度，而Shannon和Simpson指數(shù)對(duì)微生物的豐富度以及稀有OUT、微生物均勻度和優(yōu)勢(shì)OUT則更敏感。使用QIIME軟件計(jì)算了4種多樣性指數(shù)。結(jié)果表明，施加生物炭提高了連作棉田微生物群落多樣性，并且在生物炭施用量為20t·hm-2時(shí)最高，在連作20a棉田達(dá)顯著水平（p＜0.05）（表3）。

表3 生物炭對(duì)連作棉田多樣性指數(shù)的影響Table 3 The influence of index of diversity of biochar to continuous cropping cotton fields

2.3 生物炭對(duì)連作棉田土壤細(xì)菌β多樣性的影響

β多樣性反映不同連作年限間土壤微生物群落構(gòu)成。根據(jù)給定的樣本分布信息，對(duì)群落結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLSDA）。樣品的空間距離越接近，表示樣品的物種組成結(jié)構(gòu)越相似。對(duì)不同生物炭施用量處理下不同連作年限土壤樣品進(jìn)行PLSDA分析顯示，不施用生物炭處理，連作20a以下3個(gè)棉田較接近，而連作40a棉田被明顯分開(kāi)，說(shuō)明連作20a以下3個(gè)棉田細(xì)菌物種組成結(jié)構(gòu)接近，與連作40a棉田細(xì)菌物種組成有較大差異。生物炭施用量為20t·hm-2時(shí)，不同連作年限棉田細(xì)菌物種組成差異不大。生物炭施用量為40t·hm-2時(shí)，連作40a棉田與連作20a及以下棉田的物種組成差異較大，說(shuō)明20t·hm-2生物炭施用量可以有效改善長(zhǎng)期連作棉田土壤微物的多樣性，而40t·hm-2的生物炭施用量對(duì)連作40a以上棉田細(xì)菌群落影響較?。▓D2）。

圖2 不同生物炭施用量下不同連作年限土壤樣本間的偏最小二乘法判別分析Figure 2 Partial least squares discriminant analysis among samples with different continuous cropping years under different biochar application concentrations

2.4 微生物代謝功能的簇分布和預(yù)測(cè)

通過(guò)R軟件計(jì)算，Venn圖和PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析獨(dú)特共享功能組的結(jié)果表明（圖3），在代謝功能上，最高細(xì)菌相對(duì)豐度（＞0.09）為碳水化合物和氨基酸代謝，而最低細(xì)菌相對(duì)豐度（＜0.01）為其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成?；诩?xì)胞過(guò)程，最高的細(xì)菌相對(duì)豐度（＞0.02）都表現(xiàn)出細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，最低的細(xì)菌相對(duì)豐度（＜0.005）表現(xiàn)出細(xì)胞訊息傳遞。在環(huán)境信息處理方面，最高的細(xì)菌相對(duì)豐度（＞0.10）都表現(xiàn)為膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而最低的細(xì)菌相對(duì)豐度（＜0.01）表現(xiàn)為信號(hào)分子和相互作用。在遺傳信息處理方面，最高細(xì)菌相對(duì)豐度（＞0.05）表現(xiàn)為復(fù)制和修復(fù)，而最低細(xì)菌相對(duì)豐度（＜0.02）表現(xiàn)為折疊、分選和去輻射。

圖3 不同生物炭施用量下不同連作年限獨(dú)特和共享功能組分析Figure 3 Unique and shared functional group analysis for different continuous cropping years under different biochar application concentrations

3 討論與結(jié)論

細(xì)菌多樣性及其在土壤中相對(duì)比例的變化取決于不同的棉田生物炭處理和棉花連作年限。在20t·hm-2和40t·hm-2的生物炭施用量下，顯著增加了連作20a棉田土壤的細(xì)菌多樣性，而施用生物炭顯著降低了連作40a棉田土壤細(xì)菌的多樣性和豐富度。這些結(jié)果與LI等[10]的發(fā)現(xiàn)一致。生物炭處理對(duì)土壤微生物的影響是復(fù)雜且變化的，并且與生物炭的應(yīng)用時(shí)間、類型和數(shù)量密切相關(guān)[10-12]。編碼16SrRNA基因的測(cè)序已被廣泛用于土壤中細(xì)菌群落的深入分析[13-14]。其與Chao 1、Ace、Shannon和Simpson的豐富度和多樣性指數(shù)一起，用于評(píng)估生物炭處理棉田土壤中細(xì)菌群落的多樣性。細(xì)菌類群在所有試驗(yàn)區(qū)差異顯著（表3）。施用0，20，40t·hm-2生物炭的土壤與放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形桿菌門(mén)等4種原生菌相關(guān)聯(lián)。這與前人研究一致[8，15-16]。另外，正如CARSON等[17]揭示的那樣，棉田持續(xù)連作改變了土壤環(huán)境的物理化學(xué)狀態(tài)（例如pH，礦物質(zhì)含量，孔隙和粒徑）及水分和養(yǎng)分利用率，這也可能是影響細(xì)菌群落和土壤微生境的關(guān)鍵因素。

本研究表明，在生物炭施用量為0t·hm-2的情況下，連作5a和20a的棉田土壤樣品間的OUT相似度更高；在生物炭施用量為20t hm-2，連作10a和20a的棉田土壤樣品間OTU相似度更高；生物炭施用量在40t·hm-2下，連作5a和40a棉田土壤樣品間OTU相似度更高。此外，UPGMA還證實(shí)了在生物炭3種施用量下，連續(xù)種植5a和20a的樣品之間的OTU相似性均最高。這與CANNAVAN等（2016）[18]研究發(fā)現(xiàn)相一致，其研究發(fā)現(xiàn)生物炭影響包括微生物構(gòu)成在內(nèi)的幾種土壤參數(shù)，并且生物炭可以潛在地容納重要的微生物。當(dāng)然，已經(jīng)證明生物炭作為土壤改良劑對(duì)土壤細(xì)菌群落具有重大影響，這可能會(huì)改善棉田連作系統(tǒng)的微生物多樣性[4，17]。

通過(guò)PLSDA進(jìn)行的群落結(jié)構(gòu)判別分析表明，組間差異主要表現(xiàn)在0t·hm-2生物炭施用量棉花連作5a和40a的樣品、20t·hm-2生物炭施用量棉花連作20a和40a的樣品、40t·hm-2生物炭施用量棉花連作20a和40a的樣品。這證明了生物炭施用量和棉花連作對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的綜合影響。AMARAL等[19]的一項(xiàng)研究表明，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用生物炭不僅影響土壤碳、氮和磷的含量，而且還影響細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)。根據(jù)微生物功能組的預(yù)測(cè)豐度，在20t·hm-2生物炭施用量下，共有的功能組數(shù)量最少，表明在該施用量下存在獨(dú)特的土壤特性。獨(dú)特功能組最高數(shù)量出現(xiàn)在0t·hm-2和20t·hm-2生物炭施用量下連作10a棉田，以及在40t·hm-2生物炭施用量下棉花連作40a棉田。研究表明細(xì)菌簇的分布與土壤性質(zhì)如碳含量有關(guān)[19]，資源的有限利用可能會(huì)通過(guò)增強(qiáng)微生物運(yùn)動(dòng)來(lái)促進(jìn)早期微生物簇的形成[20]。此外，在資源有限的環(huán)境中，為了生存以及早期微生物簇的形成，及其隨后的動(dòng)力學(xué)，微生物更喜歡相對(duì)簇生長(zhǎng)模式而不是分散模式[20]。

理想情況下，細(xì)菌群落的整體代謝途徑可以根據(jù)各自實(shí)體在代謝途徑中起主要作用的必需資源的可用性，以及被用來(lái)調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能重要的種間相互作用來(lái)預(yù)測(cè)[21]。本研究表明，即使棉花連作會(huì)影響細(xì)菌多樣性，但基于其在整個(gè)生物炭處理中的代謝功能，這些細(xì)菌群落的豐度也沒(méi)有明顯變化。但是，代謝功能（碳酸鹽和氨基酸代謝，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，膜運(yùn)輸，復(fù)制和修復(fù)等）表現(xiàn)為較高的細(xì)菌相對(duì)豐度。在生物炭處理下，連作20a棉田土壤表現(xiàn)出最佳的細(xì)菌豐度。碳水化合物和氨基酸代謝物相關(guān)細(xì)菌群落可能對(duì)整體土壤肥力有利。實(shí)際上，這提供了額外的證據(jù)，即生物炭的施用量和棉花連作不僅影響土壤細(xì)菌的多樣性，而且還影響特定代謝功能的特定群落的相對(duì)豐度，其中一些有益于提高作物生產(chǎn)力。

研究結(jié)果表明，在連作20a棉田，施用生物炭對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、α多樣性、β多樣性和代謝功能性質(zhì)具有顯著增益的效果，并且在生物炭施用量為20t·hm-2和40t·hm-2時(shí)表現(xiàn)為最高的細(xì)菌多樣性。但是，與棉花連作20a相反，連作40a的較高生物炭施用量并未顯著改變細(xì)菌的多樣性?？傮w而言，施用20t·hm-2生物炭可促進(jìn)40a以下連作棉田的細(xì)菌群落和代謝途徑向有益于提高棉花生產(chǎn)力的方向發(fā)展。