姜夢(mèng)珂，李孟霜，李中源，曾忠秀，楊林美，杜 欣，李淑英

(玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100)

無(wú)花果藥食兼用，具有較高的藥用、營(yíng)養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且無(wú)花果適應(yīng)性強(qiáng)，種植簡(jiǎn)單，采收期長(zhǎng)，產(chǎn)值較高，是一種高效益的特色種植果林品種[1]，果實(shí)及其葉具有顯著的抗癌與抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抑菌作用[2-3]。無(wú)花果的這些營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用功效一定程度上與其器官中的內(nèi)生菌有關(guān)[4-5]。植物內(nèi)生菌與高等植物在長(zhǎng)時(shí)間的協(xié)同進(jìn)化中，與植物體內(nèi)物質(zhì)或根際分泌物等相互作用，可以提高宿主植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力等[6]，無(wú)花果根、莖、葉及果實(shí)中含有豐富的內(nèi)生菌，包括具有發(fā)酵性能酵母菌和具有抑菌性能的細(xì)菌、真菌[7]，劉瑞[8]等人從無(wú)花果葉內(nèi)篩到5株內(nèi)生真菌并進(jìn)行了分類鑒定和抑菌活性測(cè)定，陳正培[9]等人從百香果果漿分離到的3株內(nèi)生細(xì)菌研究認(rèn)為其生長(zhǎng)最適pH值均為5.5，分析認(rèn)為與內(nèi)生細(xì)菌的存在環(huán)境有關(guān)。本文選擇無(wú)花果作為實(shí)驗(yàn)材料，從其果實(shí)內(nèi)分離篩選出兩株活性內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)特征觀察及分子生物學(xué)方法鑒定，確定其分類地位，并對(duì)它們的耐堿性、耐鹽性及產(chǎn)淀粉酶能力等生物學(xué)特征進(jìn)行了研究，為兩株無(wú)花果活性內(nèi)生細(xì)菌的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與培養(yǎng)基

1.1 材料

無(wú)花果(FicuscaricaLinn.)：超市購(gòu)買；菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，湖北保藏中心購(gòu)買；大腸桿菌(Escherichiacoli)及變形桿菌(P.vulgaris)，本校微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml。

淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，可溶淀粉20g，瓊脂粉20g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。

2 方案設(shè)計(jì)

2.1 無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌分離及純化

新鮮無(wú)花果經(jīng)無(wú)菌水沖洗后用75%乙醇浸泡2min，無(wú)菌水沖洗3次，再用3% NaClO溶液浸泡3min，無(wú)菌水沖洗3次。無(wú)菌刀切為小塊后轉(zhuǎn)入研缽加100ml無(wú)菌水與滅菌石英砂充分研磨。取0.5ml菌液加入有4.5ml無(wú)菌水的試管中，吹打均勻制成稀釋梯度為10-1菌懸液，同樣方法稀釋至10-3，靜置15min，取10-1、-10-3菌懸液各0.5ml上清液涂布LB平板,每個(gè)稀釋梯度接種3個(gè)LB平板，35℃恒溫培養(yǎng)24～48h，挑選生長(zhǎng)良好單菌落純化2～3次保存于4℃冰箱備用。把最后一遍漂洗無(wú)花果的無(wú)菌水涂布于LB培養(yǎng)基上，做漂洗液檢驗(yàn)法對(duì)照,35℃培養(yǎng)24～48h。

2.2 無(wú)花果活性內(nèi)生細(xì)菌篩選

采用平板對(duì)峙法將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及變形桿菌及分離純化得到的無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，35℃下恒溫培養(yǎng)48h后觀察平板是否有抑菌帶產(chǎn)生，篩選出活性內(nèi)生細(xì)菌。

3 無(wú)花果活性內(nèi)生細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

3.1 活性內(nèi)生細(xì)菌細(xì)胞DAN提取

采用改良的CTAB法[10-11]提取DNA，經(jīng)電泳檢測(cè)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.2 PCR擴(kuò)增

采用30μl體系：提取所得DNA1μl、前引物和后引物各1μl(細(xì)菌通用引物：前引物27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和后引物1525R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')、Taq酶5.5μl(Ex Taq 0，1μl、10x Ex Taq Buffer 3μl、dNTP mixture 2.4μl)；

擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?4℃預(yù)變性4min；②94℃變性30s；③57℃退火30s；④72℃延伸1min；⑤72℃延伸10min，步驟②-④循環(huán)33次。

3.3 堿基序列測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行堿基測(cè)序，將測(cè)序得到的16S rRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性分析，選取下載同源性最高的幾條序列，用MECA-X10.2.5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

4 活性內(nèi)生細(xì)菌生物學(xué)特征研究

4.1 革蘭氏染色及芽孢染色

簡(jiǎn)單染色及芽孢染色參照[12]進(jìn)行：培養(yǎng)至24h進(jìn)行簡(jiǎn)單染色；培養(yǎng)至16h開(kāi)始進(jìn)行芽孢染色[13]，染色間隔時(shí)間為2h，最初出現(xiàn)芽孢的時(shí)間即為活性內(nèi)生細(xì)菌開(kāi)始產(chǎn)芽孢的時(shí)間。

4.2 活性內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)最適pH及耐堿性實(shí)驗(yàn)

用5ml無(wú)菌水洗脫活性內(nèi)生細(xì)菌斜面，重復(fù)3次合并于同一無(wú)菌試管中制成菌懸液。

4.2.1活性內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)最適pH

取1ml菌懸液接種到不同pH(5、6、7、8)LB液體培養(yǎng)基中，3個(gè)平行/菌/pH，35℃、120r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，于可見(jiàn)光分光光度計(jì)600nm測(cè)定OD。

4.2.2 活性內(nèi)生細(xì)菌耐堿性

取1ml接種于pH為8、9、10、11的LB液體培養(yǎng)基中，3個(gè)平行/菌/pH，35℃、120r/min)恒溫振蕩培養(yǎng)24h,于可見(jiàn)光分光光度計(jì)600nm測(cè)定OD。

4.3 活性內(nèi)生細(xì)菌耐鹽性實(shí)驗(yàn)

將活性內(nèi)生細(xì)菌分別接種到含NaCl為0、5%、10%、15%、20%的LB液體培養(yǎng)基中，35℃、120r/min恒溫震蕩培養(yǎng)24h后600nm測(cè)定OD。

4.4 活性內(nèi)生細(xì)菌解淀粉能力

采用點(diǎn)種[14]方法將活性內(nèi)生細(xì)菌接種于淀粉瓊脂篩選培養(yǎng)基平板上，點(diǎn)種3次/平板，35℃倒置培養(yǎng)24h，滴加適量盧戈式碘液于平板，觀察菌苔周圍是否出現(xiàn)水解圈，并測(cè)量水解圈大小。

5 結(jié)果與分析

5.1 無(wú)花果活性內(nèi)生細(xì)菌篩選結(jié)果及形態(tài)學(xué)特征

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、濕潤(rùn)度等特征從無(wú)花果果實(shí)中分離得到19株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和變形桿菌(P.vulgaris)篩選后得到2株活性內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)為3251、3252，通過(guò)革蘭氏染色兩株細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌、桿狀，芽孢染色有芽孢生成，3251芽孢生成時(shí)間為25h，3252芽孢生成時(shí)間為26h，兩株細(xì)菌初始芽孢形成時(shí)間有一定差異，研究[13]發(fā)現(xiàn)1株簡(jiǎn)單芽孢桿菌芽孢形成時(shí)間為16h(六氯苯脅迫寬葉香蒲根際分離得到)，1株枯草芽孢桿菌芽孢形成時(shí)間為46h，張戈等[15]指出不同的微生物形成芽孢的機(jī)制并不相同，對(duì)特定的微生物而言，需要探索其合適的條件控制其芽孢的形成。研究認(rèn)為[16-17]營(yíng)養(yǎng)缺乏、高濃度礦物元素、pH、溫度、水分、高細(xì)胞密度和輻射等多種因素都可引發(fā)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的分化并形成芽孢。

注：A-3251菌落形態(tài)，B-3251簡(jiǎn)單染色，C-3251芽孢染色(總放大倍數(shù)：1600)。圖1 無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌3251菌落及形態(tài)特征

注：A-3252菌落形態(tài)，B-3252簡(jiǎn)單染色，C-3252芽孢染色(總放大倍數(shù)：1600)。圖2 無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌3252菌落及形態(tài)特征

5.2 兩株活性內(nèi)生細(xì)菌(3251、3252)菌株16S rDNA鑒定

圖3看出3251、3252兩株活性內(nèi)生細(xì)菌DNA分子量大小為1500bp，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因組測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果于NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如表1，并通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建3251、3252親系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)，親緣關(guān)系進(jìn)化樹所示，兩株活性內(nèi)生細(xì)菌均屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，根據(jù)兩株芽孢桿菌生理生化特征分別命名為BacillusWHG3251、BacillusstrainBF3252。

圖3 活性內(nèi)生細(xì)菌電泳結(jié)果

表1 16SrDNA同源性比對(duì)結(jié)果表

圖4 3251、3252系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

5.3 兩株活性內(nèi)生細(xì)菌生物學(xué)特征

5.3.1 pH對(duì)兩株活性內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

圖5結(jié)果發(fā)現(xiàn)BacillusWHG3251和BacillusstrainBF3252生長(zhǎng)最適pH為7.0，較多細(xì)菌生長(zhǎng)的最適pH為6.0～8.0,本實(shí)驗(yàn)從無(wú)花果中分離到的兩株活性內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)最適pH在此范圍內(nèi)；通過(guò)圖6耐堿性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)花果兩株活性內(nèi)生細(xì)菌耐堿性有較大差異，BacillusWHG3251在LB培養(yǎng)基pH=11時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于BacillusstrainBF3252，說(shuō)明BacillusWHG3251耐堿能力較強(qiáng)，而BacillusstrainBF3252在pH=9時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)較好，pH=11時(shí)BacillusWHG3251生長(zhǎng)受到明顯抑制，兩株無(wú)花果活性內(nèi)生芽孢桿菌對(duì)pH的耐受性有明顯不同。從植物分離到兩株具有芘降解功能內(nèi)生細(xì)菌[18]及銀杏內(nèi)生細(xì)菌JX-3進(jìn)行條件優(yōu)化}結(jié)果發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)最適pH為7.0，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

圖5 無(wú)花果兩株活性內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)最適pH

圖6 pH對(duì)無(wú)花果兩株活性內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

5.3.2 不同濃度NaCl對(duì)兩株活性內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)從無(wú)花果分離到的兩株活性內(nèi)生細(xì)菌BacillusWHG3251和BacillusstrainBF3252耐鹽性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖7)，兩株活性內(nèi)生細(xì)菌耐鹽性也較強(qiáng)，NaCl濃度為10%時(shí)對(duì)兩株無(wú)花果活性內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其中BacillusstrainBF3252的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于BacillusWHG3251，BacillusWHG3251在NaCl濃度為5%時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)比對(duì)照好，而NaCl濃度為5%對(duì)BacillusstrainBF3252的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定抑制作用，當(dāng)NaCl濃度增加到15%時(shí)兩株無(wú)花果活性內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制，NaCl鹽濃度為20%時(shí)兩株無(wú)花果活性內(nèi)生細(xì)菌又表現(xiàn)出生長(zhǎng)，一般來(lái)說(shuō)，低濃度鹽對(duì)厭氧微生物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度鹽對(duì)厭氧微生物有抑制作用[20]，代金霞[21]等從小葉錦雞兒分離到78株內(nèi)生細(xì)菌發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌NaC1的耐受能力差異較大，只有少部分(該實(shí)驗(yàn)為5%)能夠在NaC1濃度10%的平板上生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)從無(wú)花果分離到的兩株活性內(nèi)生細(xì)菌為芽孢桿菌屬細(xì)菌，兩株芽孢桿菌芽孢形成時(shí)間分別為25h、26h，芽孢出現(xiàn)時(shí)間相對(duì)較短(本實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌芽孢出現(xiàn)時(shí)間為46h)[13]，芽孢的形成對(duì)不良環(huán)境條件有一定的耐受性，另外，BacillusWHG3251和BacillusstrainBF3252在鹽濃度為20%出現(xiàn)生長(zhǎng)可能深度休眠芽孢萌發(fā)有關(guān)[22]，研究[23-24]也發(fā)現(xiàn)不同植物分離到的內(nèi)生細(xì)菌能在NaCl濃度為10%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

圖7 NaCl對(duì)無(wú)花果兩株活性內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

5.3.3 兩株活性內(nèi)生細(xì)菌菌解淀粉能力結(jié)果

表2 株活性內(nèi)生細(xì)菌解淀粉能力

表2結(jié)果顯示BacillusWHG3251和BacillusstrainBF3252都能產(chǎn)生淀粉酶，兩株無(wú)花果活性內(nèi)生細(xì)菌在淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，BacillusWHG3251的水解圈平均直徑為0.21cm，BacillusstrainBF3252水解圈平均值為0.26cm，兩株細(xì)菌產(chǎn)淀粉酶的能力有一定差異但比較接近，該水解圈大小不能完全代表這兩株活性內(nèi)生細(xì)菌的最大分解淀粉能力，研究[25-26]發(fā)現(xiàn)不同植物分離到的內(nèi)生細(xì)菌有產(chǎn)淀粉酶的能力，其中內(nèi)生芽孢桿菌具有產(chǎn)淀粉酶能力，但產(chǎn)淀粉酶能力有一定差異，微生物分解淀粉能力較弱與其對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力有關(guān)。

6 結(jié)論

(1)從無(wú)花果果實(shí)中分離得到19株內(nèi)生細(xì)菌，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和變形桿菌(P.vulgaris)篩選后得到2株活性內(nèi)生細(xì)菌，分子量大小為1500bp,16SrRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)后確定為芽孢桿菌屬細(xì)菌，生理生化實(shí)驗(yàn)后命名為BacillusWHG3251、BacillusstrainBF3252。

(2)兩株活性內(nèi)生細(xì)菌形態(tài)為桿狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢產(chǎn)生時(shí)間分別為25h和26h。

(3)BacillusWHG3251和BacillusstrainBF3252的生長(zhǎng)最適pH為7.0，BacillusWHG3251比BacillusstrainBF3252有較強(qiáng)的耐堿性；兩株活性內(nèi)生細(xì)菌都有較強(qiáng)的耐鹽性，BacillusstrainBF3252表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性特點(diǎn)；兩株活性內(nèi)生細(xì)菌都有產(chǎn)淀粉酶的能力。