沈舒婷，于 坤，王亞軒，吳運(yùn)軍，王 慧

（皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

有機(jī)硼化合物作為一種新興的光電功能材料，具有量子產(chǎn)率高、平面性好、近紅外發(fā)光、結(jié)構(gòu)易修飾、組裝形式多樣等優(yōu)勢，已被廣泛用于發(fā)光二極管（OLEDs）、生物顯影、生物傳感、化學(xué)傳感等領(lǐng)域[1-3]。目前，有機(jī)硼化合物主要包括N，N-二齒型、N，O-二齒型和O，O-二齒型三種結(jié)構(gòu)類型[4-5]。其中N，N-二齒型化合物是目前研究最多的一類，雖然此類化合物具有優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，但也存在著產(chǎn)率低、合成原料價格高、溶解性差等不足之處。隨著研究的不斷深入，科研工作者們發(fā)現(xiàn)β-二酮化合物是一類很好的螯合有機(jī)配體，可與三氟化硼反應(yīng)生成O，O-二齒型有機(jī)二氟化硼化合物，即β-二酮二氟化硼化合物[6]。研究表明，β-二酮二氟化硼化合物具有較高的量子產(chǎn)率、較高的光穩(wěn)定性和電子遷移率、較大的斯托克斯位移等特點(diǎn)，在光電材料、生命科學(xué)、生物醫(yī)藥、生物化學(xué)傳感等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值[7-8]。因此，開發(fā)新型的β-二酮二氟化硼衍生物并探索其在生物體內(nèi)的應(yīng)用具有重要的科學(xué)意義。

咪唑是一種五元含氮雜環(huán)化合物，也是一種重要的有機(jī)合成中間體，其衍生物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種生物活性，在藥物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[9]。基于此，本文以咪唑和β-二酮二氟化硼為原料，設(shè)計合成了一種有機(jī)化合物L(fēng)（圖1），研究了化合物L(fēng)在不同溶劑中的光物理性質(zhì)，探索了化合物L(fēng)在細(xì)胞和組織中的成像情況。

圖1 化合物L(fēng)的合成路線圖Figure 1 The synthetic route of compound L

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Bruker Avance 600型核磁共振儀，德國Bruker公司；Finnigan LCQ 型質(zhì)譜儀，美國Thermo Finnigan公司；UV-5900 PC型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡，德國徠卡微系統(tǒng)有限公司；HITACHI F-4600型熒光分光光度計(實驗參數(shù)：激發(fā)波長為410 nm，狹縫寬度均為5 nm，電壓為500 V)，日本日立公司；Nicolet FTIR is5 型傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司。

試劑：苯甲酰丙酮（98%），三氟化硼二甲醚，咪唑（99%），對氟苯甲醛（98%），其他藥品為分析純，購于上海阿拉丁試劑有限公司。人肝癌細(xì)胞株（HepG2）來源于皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中心實驗室。

1.2 化合物L(fēng)的合成

中間體M1和M2的合成參照文獻(xiàn)[10-11]。在100 mL圓底燒瓶中加入0.21 g M1（1 mmol），用30 mL乙醇使其完全溶解，然后加入0.17 g M2（1 mmol）和100μL哌啶，回流反應(yīng)20 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，減壓抽濾，粗產(chǎn)品用乙醇重結(jié)晶，得到黃色固體0.29 g。1H NMR（600 MHz，d6-DMSO），δ 8.47（d，J=12.6 Hz，1H），8.17（d，J= 7.6 Hz，1H），8.02～7.98（m，2H），7.92～7.83（m，3H），7.78（m，1H），7.72（d，J= 16.0 Hz，1H），7.64（m，2H），7.57～7.53（m，1H），7.30（d，J=16.0 Hz，1H），7.17（s，1H），7.03（d，J=16.0 Hz，1H）。13C NMR（151 MHz，d6-DMSO），δ 181.14，160.41，146.99，140.89，139.37，136.02，131.68，130.15，129.98，129.39，129.19，127.70，122.11，120.92，118.29，98.47，56.44，18.98。ESI-MS：理論值364.119 5；實驗值365.125 6。IR（selected bands，cm-1）：2 361，1 631，1 585，1 543，1 490，1 381，1 303，1 250，1 188，1 111，1 083，1 005，960，832，685，654。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物L(fēng)的光學(xué)性質(zhì)研究

首先測試了化合物L(fēng)在七種不同極性的溶劑中的紫外可見吸收光譜和熒光光譜。在所有測試中，化合物L(fēng)的濃度為10μM，溶劑分別為二甲基亞砜（DMSO）、乙腈（CH3CN）、乙醇（EtOH）、四氫呋喃（THF）、乙酸乙酯（EA）、苯（Benzene）和PBS緩沖溶液（pH=7.40）。圖2（A）是化合物L(fēng)在不同溶劑中的紫外可見吸收光譜，從圖2（A）中可以看出，化合物L(fēng)在350～500 nm之間有一個很強(qiáng)的吸收峰，可歸屬于分子內(nèi)電荷躍遷或ππ*躍遷[10]。此外，與其他極性的溶劑相比，化合物L(fēng)在大極性溶劑（DMSO）中（PBS除外）的最大吸收峰發(fā)生了明顯的紅移，這可能是由于在化合物分子軌道的π-π*躍遷過程中，其激發(fā)態(tài)的極性大于基態(tài)的極性，所以在極性較大的溶劑中，盡管基態(tài)和激發(fā)態(tài)的能量都有所降低，但激發(fā)態(tài)降低得更多，導(dǎo)致分子軌道的電子躍遷所需能量較極性較小的溶劑中減小，因而吸收帶向長波方向移動[12]。圖2（B）是化合物L(fēng)在不同溶劑中的熒光光譜，隨著溶劑極性的增加，化合物L(fēng)的熒光發(fā)射峰呈現(xiàn)出明顯的紅移趨勢，且熒光強(qiáng)度也在降低，可解釋為激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，溶劑化效應(yīng)與能級降低有關(guān)，溶劑與溶質(zhì)之間偶極-偶極相互作用的增強(qiáng)會導(dǎo)致激發(fā)態(tài)能級的降低；同時，溶質(zhì)分子激發(fā)態(tài)與基態(tài)間能級差的降低還引起了非輻射躍遷的增大，從而使化合物熒光強(qiáng)度降低[13]。

圖2 化合物L(fēng)在不同溶劑中的紫外可見吸收光譜（A）和熒光發(fā)射光譜（B）Figure 2 UV-vis absorption(A)and fluorescence emission(B)spectra of compound L in different solvents

2.2 不同分析物和pH對化合物L(fēng)光學(xué)性質(zhì)的影響

由于生物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，在進(jìn)一步將化合物L(fēng)用于生物體內(nèi)研究之前，考察了生物體內(nèi)各種分析物和不同的pH對化合物L(fēng)光學(xué)性質(zhì)的影響，如圖3所示。首先配制了pH值為2～11的PBS緩沖溶液和各種不同分析物（包括ADP、Ag+、Al3+、ATP、Ba2+、BSA、Bi3+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、DNA、Fe3+、GSH、Hg2+、K+、Li+、Mg2+、Mn2+、Na+、Ni2+、ppi、RNA、Zn2+、脂質(zhì)體、組氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組蛋白）的溶液。測試時，移取50μL的化合物L(fēng)溶液（母液濃度為10-3mol/L，溶劑為二甲基亞砜），用PBS緩沖溶液定容至5 mL，然后加入20倍當(dāng)量的各種分析物，搖勻即可。從圖3（A）中可以看出，化合物L(fēng)僅與脂質(zhì)體（liposome）有熒光增強(qiáng)作用，與其他分析物沒有響應(yīng)，說明化合物L(fēng)與脂質(zhì)體之間產(chǎn)生了某些相互作用，從而導(dǎo)致其熒光增強(qiáng)。由于脂質(zhì)體是一種類似生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子層微小囊泡，而化合物L(fēng)具有較好的親脂性，當(dāng)二者混合在一起后，化合物L(fēng)中的親脂基團(tuán)使其更傾向于滲入脂質(zhì)體的封閉囊泡中，分子中單鍵的旋轉(zhuǎn)受到脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的限制，最終使得其熒光增強(qiáng)。此結(jié)果表明化合物L(fēng)具有靶向細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的潛在能力。由圖3（B）可知，在pH值為6～8范圍內(nèi)，化合物L(fēng)的熒光強(qiáng)度變化不大，表明化合物L(fēng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度不受生理環(huán)境pH值的影響。

圖3 （A）化合物L(fēng)與各種不同分析物相互作用后的熒光光譜；（B）化合物L(fēng)在不同pH下的相對熒光強(qiáng)度（I代表化合物L(fēng)在不同pH下的熒光強(qiáng)度，I0代表化合物L(fēng)在pH=2.65時的熒光強(qiáng)度）Figure 3 (A)Fluorescence spectra of compound L interacting with various analytes;(B)Relative fluorescence intensity of compound L at different pH（I represents the fluorescence intensity of compound L at different pH values，and I0 represents the fluorescence intensity of compound L at pH=2.65）

2.3 化合物L(fēng)的細(xì)胞和組織成像研究

采用MTT 法[14]研究了化合物L(fēng) 對HepG2 細(xì)胞的毒性實驗。如圖4 所示，當(dāng)不同濃度的化合物L(fēng) 與HepG2細(xì)胞共同作用24 h后，細(xì)胞的存活率仍在80%以上，表明化合物L(fēng)具有較高的細(xì)胞存活率，可用于活細(xì)胞成像研究。

圖4 化合物L(fēng)與HepG2細(xì)胞作用24 h后的細(xì)胞存活率圖Figure 4 Survival rate of HepG2 cells incubated with compound L for 24 h

將HepG2細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，待皿內(nèi)細(xì)胞密度漲至50%時，移去皿中的培養(yǎng)基，加入新鮮的含有10μM化合物L(fēng)的培養(yǎng)基溶液，培養(yǎng)30 min后，用PBS緩沖溶液洗滌3遍，用徠卡TCS SP8型顯微鏡觀察，如圖5所示。從圖5可以看出，化合物L(fēng)可在30 min內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞，著色細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部位，并在細(xì)胞內(nèi)顯示出較強(qiáng)的熒光信號。為了進(jìn)一步研究化合物L(fēng)在細(xì)胞內(nèi)的靶向部位，選擇商業(yè)染料ER tracker（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)商染，激發(fā)波長為587 nm，發(fā)射波長為600～640 nm）和Mito tracker Red（線粒體商染，激發(fā)波長為579 nm，發(fā)射波長為580～620 nm）進(jìn)行共定位實驗。如圖6 所示，化合物L(fēng) 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)商染和線粒體商染的皮爾森系數(shù)分別為0.86和0.27，說明化合物L(fēng)主要靶向在細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部位，部分靶向在線粒體上。這種現(xiàn)象可解釋為線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是高疏水性的膜質(zhì)細(xì)胞器，化合物L(fēng)是親脂性分子，當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞后，可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜結(jié)構(gòu)中的親脂區(qū)域重疊。以上實驗結(jié)果表明化合物L(fēng)主要定位于細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)上。

圖5 化合物L(fēng)與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)30 min后的細(xì)胞成像圖Figure 5 Image of HepG2 cells incubated with compound L for 30 min

圖6 化合物L(fēng)與商業(yè)染料的共定位圖Figure 6 Images of HepG2 cells incubated with compound L and different commercial dyes

在細(xì)胞顯影的基礎(chǔ)上又探索了化合物L(fēng)在組織上的成像研究。選取新鮮的小鼠大腦組織，厚度約為30μm。將含有10μM化合物L(fēng)的PBS溶液與小鼠大腦組織在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)30 min后，用PBS緩沖溶液洗滌3遍，將組織固定在黏附載玻片上，用Leica TSC SP8顯微鏡觀察，實驗結(jié)果見圖7，化合物L(fēng)可以很好地著色小鼠的大腦組織，滲透深度達(dá)到15.8μm，表明化合物L(fēng)可用于組織成像研究。

圖7 （A）化合物L(fēng)與小鼠大腦組織共培養(yǎng)后的組織成像圖；小鼠大腦組織的3D成像圖（B）和滲透深度圖（C）Figure 7 (A)Tissue image of mouse brain tissue incubated with compound L;3D imaging of mouse brain tis?sue(B)and penetration depth(C)after incubated with compound L

3 結(jié)論

本文設(shè)計合成了一種β-二酮二氟化硼的衍生物L(fēng)，系統(tǒng)研究了化合物L(fēng)在七種不同極性溶劑中的光物理性質(zhì)及不同pH和各種分析物對其熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，化合物L(fēng)具有良好的光物理性質(zhì)，且在生理環(huán)境下不受pH及各種分析物的干擾。生物實驗結(jié)果表明化合物L(fēng)可定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中的膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，也能對小鼠的大腦組織進(jìn)行成像。此實驗結(jié)果為后期設(shè)計合成靶向細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的化合物奠定了實驗基礎(chǔ)。