張茂榮，黃碧捷，涂志睿，廖 俊

(江漢大學 化學與環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430056)

1 引言

生態(tài)環(huán)境部于2019 年4 月首次發(fā)布《水質(zhì) 致突變性的鑒別 蠶豆根尖微核試驗法》(HJ 1016-2019)，該標準2019 年9 月起正式實施，標志著經(jīng)過近40 年在我國的研究與應用，蠶豆根尖微核檢測技術(shù)(以下簡稱：MCN技術(shù))終以國標的形式正式進入到環(huán)境監(jiān)測中。1982 年，Degrassi等正式建立了MCN技術(shù)方法體系。隨后，陳光榮、王英彥、金波等研究者做了大量的基礎(chǔ)應用研究工作，促使我國于1986 年就將蠶豆根尖微核實驗列入到《環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》生物監(jiān)測(水環(huán)境)部分。2002 年，該技術(shù)又編入《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)，用于水與廢水遺傳毒性的規(guī)范檢測[1]。EPA(美國環(huán)保署)也利用MCN技術(shù)對環(huán)境致癌物進行標準化試驗，建立了毒性數(shù)據(jù)庫并建議在全世界推廣[2]。1980～2018年，CNKI中關(guān)于根尖微核研究的文獻有1016篇[3]，2008年開始該領(lǐng)域的研究趨于平穩(wěn)。隨著HJ 1016-2019的正式實施，必然帶來新一輪熱點的MCN技術(shù)的相關(guān)研究與應用。

2 MCN技術(shù)原理與優(yōu)勢

微核是指位于細胞漿中獨立于主核的小核[4]，是細胞受外界脅迫后由有絲分裂后期散失著絲粒的染色體片斷產(chǎn)生，微核的發(fā)生頻率與細胞染色體發(fā)生損傷、變異的頻率顯著相關(guān)。蠶豆細胞DNA含量多，染色體數(shù)目少且大，對外源誘變物敏感且易于觀察[5]，是經(jīng)典的遺傳學研究材料。蠶豆根尖微核的突變形成主要來源于穩(wěn)定性染色體畸變[6](易位、到位、缺失等)。以蠶豆微核的變化做為檢測指標的MCN技術(shù)具備成本低、試驗周期短、操作簡便、結(jié)果可靠、靈敏度高等優(yōu)點[7]。MCN技術(shù)的核心就是要建立待檢物與受試物間良好、穩(wěn)定和明確的效應-劑量關(guān)系。已有研究表明：輻射，聲波，重金屬，無機非金屬，疊氮化物、苯環(huán)等有機污染物、抗菌素、真菌霉素等微生物因素都能誘發(fā)蠶豆根尖細胞形成微核，重復性好，已在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域有著廣泛應用，例如用于水(淡水、海水、工業(yè)廢水、地下水、核廢水、自來水)污染監(jiān)測，土壤污染監(jiān)測，空氣污染監(jiān)測，毒物(農(nóng)藥、藥品、礦塵、洗滌劑、香煙等)致突變性檢測，食品安全等多方面。

世界上至今已發(fā)展了百余種方法檢測污染物的遺傳毒性。1975年建立并不斷發(fā)展完善的可用于污染物致突變性的沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)已被廣為采用。ISO(國際標準化組織)發(fā)布了《水質(zhì) 水和污水的遺傳毒性測定 沙門氏菌/微粒體試驗》(ISO 16240-2005)并執(zhí)行至今。我國也相繼發(fā)布了《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗》(GB 15193.4-1994、GB 15193.4-2003，均已廢止)、《農(nóng)藥登記毒理學試驗方法(第14部分：細菌回復突變試驗)》(GB/T 15670.14-2017)等標準。Ames試驗也能用于環(huán)境監(jiān)測中的致突變性檢測，相比于Ames試驗，MCN技術(shù)的優(yōu)勢在于所需儀器和實驗室條件簡單，經(jīng)濟性強，對待檢物要求低，不需要純化處理，受限因素更少，操作要求不高。在以復合污染和未知痕量污染物為特征的現(xiàn)實各環(huán)境介質(zhì)條件下，只需要判斷其突變性，而不需要嚴格確定具體某污染物的突變性下限值。因此，MCN技術(shù)成為了我國環(huán)保部門頒布的環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域采用的首個國標致突變性檢測方法。筆者認為：Ames試驗和MCN技術(shù)用于環(huán)境監(jiān)測中致突變性檢測并不沖突，分別從動物/微生物細胞和植物細胞兩方面染色體的變化揭示了污染物的遺傳毒性特征，起到相互補充和相互驗證的作用。

3 MCN技術(shù)中致突變性的鑒別方法

MCN技術(shù)直接得到的實驗數(shù)據(jù)是微核千分率(MCN ‰)。污染程度或致突變性的判斷的是以實驗中得到的不同的微核千分率數(shù)值為基礎(chǔ)?！端h(huán)境生物檢測技術(shù)規(guī)范：蠶豆根尖微核技術(shù)》采用MCN污染指數(shù)(PI)區(qū)間劃分方法判斷試樣的污染程度。污染指數(shù)(PI=MCN試樣/MCN空白)按不同的數(shù)值區(qū)間，如0～1.5、1.5～2、2～3.5以及3.5以上，分別對應基本無遺傳性污染，輕度污染，中度污染以及重度污染。PI值大于1.5預示著該污染物具有了一定的遺傳毒性。該傳統(tǒng)方法判定致突變性是有偏差的，空白組、對照組和試樣組中的蠶豆都可能隨機產(chǎn)生數(shù)量相對較多的微核，僅用平均值的方式并沒有考慮到隨機因素，缺少統(tǒng)計學驗收支撐，導致本身就是隨機概率的致突變性的結(jié)論容易出現(xiàn)假陽性或假陰性。HJ 1016-2019并未采用傳統(tǒng)的污染指數(shù)法，而是采用了MCN試樣與實驗室歷史累積MCN空白相比較，再通過非參數(shù)檢驗法(推薦Kruskal-Wallis方法)計算判斷兩者間是否存在顯著性差異相結(jié)合的判定方法。該方法既考量了微核千分率數(shù)值變化的直觀體現(xiàn)，又考慮到了統(tǒng)計學意義上的顯著性因素，使得結(jié)論更科學，更可信。

4 MCN技術(shù)的新應用

MCN技術(shù)應用廣泛，用于重金屬、有機物、藥物的遺傳毒性的研究被大量報道。隨著MCN技術(shù)的不斷成熟發(fā)展，無論是否已知待測物的成分及其配比，尤其是對痕量污染物的綜合遺傳毒性效應判斷上，都可以利用MCN技術(shù)。近5年來，MCN技術(shù)在藥物、日常生活用品、食品/添加劑、自然水體及特殊工業(yè)廢水和場地污染監(jiān)測等方面的應用上顯示出獨特的優(yōu)勢。

4.1 MCN在藥物遺傳毒性檢測中的應用

MCN技術(shù)已被應用到檢測強力霉素(DOX)、環(huán)丙沙星(CIP)、三氯卡班(TCC)、卡馬西平(CBZ)、阿莫西林、四環(huán)素類抗生素(如：土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四環(huán)素(TTC))和磺胺類獸藥(磺胺嘧啶(SD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)和磺胺甲噁唑(SMZ))等藥物遺傳毒性上。以上藥物都能誘發(fā)微核效應。例如：DOX、CIP、TCC和CBZ在12.5～100 mg/L濃度范圍內(nèi)，微核千分率均顯著(P<0.05)高于對照組，PI值均大于3.5，屬于重度損傷，微核千分率隨濃度的增大均呈先增后減的趨勢[8]。OTC、CTC和TTC在0.1～1.6 mmol/L濃度范圍內(nèi)，微核千分率均高于3.33‰，PI值均大于1.5，且差異顯著，微核千分率隨濃度的增大呈先減后增的趨勢[9]。SD、SMM和SMZ在1～100 mg/L濃度范圍內(nèi)，微核千分率均在20 ‰左右，顯著高于空白組(6.5‰)，微核千分率隨濃度變化不明顯[10]。隨著新型藥物的不斷研發(fā)及使用，MCN在藥物遺傳毒性檢測中的應用會越來越多，將為藥物安全使用和藥物進入環(huán)境后的生態(tài)風險研究提供支撐。

4.2 MCN在日常生活用品毒性檢測中的應用

MCN技術(shù)在檢測日常生活用品(尤其是個人護理品)領(lǐng)域應用很廣。大量研究集中在對家用洗滌劑(衣物洗滌劑(洗衣粉、洗衣液等)、清潔用品(洗潔精、潔廁劑等)和日化用品(洗發(fā)水、洗面奶、沐浴露、精油等)，染發(fā)膏/劑(海娜粉)，洗甲水，蚊香液(氯氟醚菊酯)，塑料袋浸濾液，增塑劑(鄰苯二甲酸二丁酯)等的檢測中。例如：許媛媛[11]等研究發(fā)現(xiàn)3種不同染發(fā)膏分別在0.10、1.00、4.00 g/L處理濃度時的最高PI值分別為139.39、95.32、63.63，即使是稀釋10倍后，PI值也大于3，有較強的遺傳毒性風險。李瑩[12]等將3種蚊香液制成25 %、50%和75%的體積濃度時，PI值均在2～5之間，75%體積濃度的蚊香液微核千分率為(2.5±0.65)‰顯著高于空白組的(0.5±0.29)‰。不同的塑料袋浸濾液制備溫度對誘導的微核千分率影響較大，其隨溫度的增加而增大。常溫條件下，白色食品塑料袋和紅色普通塑料袋浸提液微核千分率較小，隨浸提溫度升高，快遞包裝袋浸濾液產(chǎn)生較大的遺傳損傷[13]。賴柯華[14]等發(fā)現(xiàn)0～0.2 mg/L的薰衣草精油誘導蠶豆根尖細胞的微核千分率和脂質(zhì)過氧化呈正相關(guān)；超過0.2 mg/L時細胞正常的生理代謝和應激反應受到影響。對日常生活用品的MCN技術(shù)應用研究的報道均發(fā)現(xiàn)了靈敏的微核反應和相對應的劑量-效應關(guān)系，即使不完全清楚這些物品具體組分和含量，也能判斷其遺傳毒性，并且能運用到幾乎全部的日常生活用品的檢測中。

4.3 MCN在食品/添加劑檢測中的應用

食品和食品添加劑安全問題是當前的熱點研究問題之一。MCN技術(shù)能有效、快速的鑒別食品/添加劑的遺傳毒性效應。普洱茶、泡面、蘇丹紅、香煙煙霧水、辣條、明礬(硫酸鉀、硫酸鋁)、食物水提取液(西芹、大蒜)等均有利用MCN技術(shù)檢測的文獻報道。普洱茶濃度小于5.0 g/mL時，微核效應不明顯；大于8.0 g/mL時，微核數(shù)和PI值均顯著增大，飲用低濃度的茶水更有益于身體健康[15]。香煙煙霧水溶液在0.5～8支/mL的濃度范圍內(nèi)，大蒜的微核千分率隨著濃度的增加而極顯著增加，PI值均大于3.5，能在0.5支/mL的低濃度和較少處理時間(12 h內(nèi))就對植物遺傳物質(zhì)產(chǎn)生嚴重損傷[16]。明礬在0.1～1.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，微核千分率隨濃度呈先上升后下降的趨勢，濃度為0.5 mg/mL時達到峰值[17]。0.1～1.0 g/mL西芹水提液對蠶豆微核千分率的產(chǎn)生沒有誘導作用，西芹水提液具有抑制遺傳毒性的作用，可作為抗突變保健品進一步開發(fā)利用[18]。

4.4 MCN在環(huán)境監(jiān)測中的應用

5 應用MCN技術(shù)對武漢城區(qū)自然水體的監(jiān)測

5.1 樣品處理及實驗方法

水樣采集：分別在2020年11月(秋季)和2021年5月(春季)，對武漢市的三角湖(SJ)、龍陽湖(NY)、南太子湖(NTZ)、內(nèi)沙湖(NS)、舉水河(JS)、道觀河(DG)、北湖(BH)、菱角湖(LJ)和湯遜湖(TX)采集水體樣本，樣本為混合樣，每個樣品測定3次、6個平行，取平均值?？瞻讟悠窚y定20次取平均值。

實驗方法：按HJ 1016-2019在實驗室中進行。記錄各水樣微核千分率(MCN試樣)；計算其污染指數(shù)(PI=MCN試樣/MCN空白)和顯著性差異的統(tǒng)計量值(H值，Kruskal-Wallis法)，若 H≥3.84(顯著性水平α=0.05)，反之則差異不顯著。當MCN試樣≤實驗室歷史累積MCN空白上限(參考值6.6‰)，則該試樣不存在致突變性(-，陰性)；當MCN試樣>MCN空白上限，且本次MCN試樣較MCN空白顯著增加/非顯著增加，則該試樣存在致突變性(+，陽性)/疑似存在致突變性(±，疑似陽性)。

5.2 實驗結(jié)果

本次實驗的空白值MCN空白為2.9‰；MCN空白上限取HJ 1016-2019中參考值6.6‰。將春、秋兩季9個自然水體混合樣監(jiān)測和計算結(jié)果列于表1。結(jié)果顯示：無論是春季還是秋季，選取的9個自然水樣點均未發(fā)現(xiàn)其致突變性，水質(zhì)狀況良好。相比于空白，各水樣均發(fā)生了微核反應，PI值范圍是1.01～1.44之間，均劃分為基本無遺傳性污染。H值均顯示與空白無顯著性差異。南太子湖和內(nèi)沙湖比較接近臨界值，應引起關(guān)注。

表1 武漢市9個自然水體的MCN檢測結(jié)果

6 結(jié)論與展望

通過應用MCN技術(shù)對武漢市自然水體采樣、測試分析結(jié)果表明：所有的水體樣本都發(fā)生了微核反應，PI值均小于1.5，未顯示出遺傳毒性和致突變性。蠶豆根尖微核檢測技術(shù)已在污染物檢測和環(huán)境監(jiān)測應用領(lǐng)域展示著強大的生命力。隨著HJ 1016-2019的發(fā)布與實施，該技術(shù)逐漸做到了規(guī)范化、標準化和系列化，是較好的鑒定遺傳毒性的試驗方法。然而，MCN技術(shù)依然只適用于測試潛在的染色體損傷因子，從植物細胞傷害推斷到人群健康，必然還存在不確定性和局限性，需要在更微觀的層次上揭示其毒性機理，在擴寬MCN技術(shù)應用的同時，對其超顯微結(jié)構(gòu)和致突變分子機制等領(lǐng)域值得深入研究。