張聰正 梁晨 梁婷 孫雪函 郝書鵬

摘要：目的 評(píng)價(jià)羥基磷灰石（HA）涂層鎂鋁合金（AZ31B）的體外生物相容性。 方法 實(shí)驗(yàn)分為3組：HA涂層AZ31B浸提液組（H組）、陽性對(duì)照組（P組）和空白對(duì)照組（N組）。將L929細(xì)胞與各組混合液培養(yǎng)3、5和7 d，采用WST-1法檢測細(xì)胞活力并進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(jí)。各組混合液與稀釋兔血混勻，測定吸光度（OD）并計(jì)算溶血率。采用各組混合液對(duì)白化豚鼠分別進(jìn)行皮內(nèi)誘導(dǎo)、局部誘導(dǎo)和激發(fā)，觀察去除貼敷片24、48、72 h動(dòng)物激發(fā)部位皮膚情況。 結(jié)果 3、5和7 d N組和H組細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)為0級(jí)，P組部分細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)為3級(jí);各時(shí)間點(diǎn) H 組、N 組細(xì)胞活力均高于 P 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。H 組、P 組和 N 組 OD 值分別為（0.004 ±0.001）、（0.648 ± 0.050）和（0.008 ± 0.003）;H組溶血率為—0.6%，無溶血反應(yīng)。去除貼敷片24、48、72 h H組皮膚無明顯改變，P組可見中度至重度融合性紅斑。 結(jié)論 體外實(shí)驗(yàn)提示HA涂層鎂鋁合金具有良好的體外生物相容性。

關(guān)鍵詞：鎂;鋁;合金;羥基磷灰石類;骨代用品;生物相容性材料;組織相容性實(shí)驗(yàn)

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑和材料

酶標(biāo)儀（澳大利亞，Biocell公司），Du530分光光度計(jì)（美國，Beckman 公司）;CO2培養(yǎng)箱（美國，Thermo Scientific公司）;高糖DMEM培養(yǎng)液、優(yōu)等胎牛血清、胰蛋白酶（美國，Hyclone公司），WST-1（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），草酸鉀（廣州化學(xué)試劑廠），二甲基亞砜（DMSO）、完全氟氏佐劑（美國，Sigma 公司）;HA 涂層鎂鋁合金（AZ31B）。

圓盤型樣品，直徑10 mm、厚3 mm（中國科學(xué)院金屬所提供）;小鼠成纖維細(xì)胞L929（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科細(xì)胞庫提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新鮮抗凝兔血取自新西蘭大白兔[廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SCXK（粵）2008-0002]，白化豚鼠購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（粵）2008-0002]。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

分別于培養(yǎng)3、5、7 d取各組6孔觀察細(xì)胞形態(tài)，按細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定毒性分級(jí)。培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入10 μL WST-1溶液后置于搖床上搖動(dòng) 1 min，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀在420和620 nm下測量吸光度（optical density，OD）值，檢測細(xì)胞活力。

1.4 溶血實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為 HA 涂層 AZ31B 浸提液實(shí)驗(yàn)組（H組）、蒸餾水陽性對(duì)照組（P組）以及生理鹽水陰性對(duì)照組（N組）。各組平行操作3個(gè)樣本。其中H組將 HA 涂層 AZ31B 樣品完全浸泡于生理鹽水（濃度為0.9%）中，37 ℃恒慍水浴保持30 min。取0.1 mL草酸鉀溶液（濃度為20 g/L）加入干燥管中。取新西蘭白大白兔血2 mL加入干燥管，2.5 mL生理鹽水（濃度為0.9%）稀釋。AZ31B浸提液、蒸餾水、生理鹽水（各 2 mL）中分別加入 0.02 mL 稀釋兔血，混勻后37℃水浴繼續(xù)保溫60 min，取出后以 1 000 r/min 離心 5 min。比色皿中移入各組上清液，分光光度計(jì)于545 nm波長處測定OD值。

實(shí)驗(yàn)樣品溶血率按以下公式計(jì)算：實(shí)驗(yàn)樣品溶血率 =（實(shí)驗(yàn)組OD值—陰性對(duì)照組OD值）（陽/性對(duì)照組OD值—陰性對(duì)照組OD值）。陰性對(duì)照組的OD值不應(yīng)大于0.03，陽性對(duì)照組的OD值應(yīng)在0.5～1.0之間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x- ± s）表示，多組細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)OD 值的比較采用Factorial ANOVA分析，組間兩兩比較采用 S-N-K 法;多組溶血試驗(yàn) OD 值的比較采用One-way ANOVA。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)3、5、7 d N組和H組細(xì)胞貼壁生長良好，無細(xì)胞懸浮，毒性反應(yīng)分級(jí)為0級(jí);P組部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞量較少，毒性反應(yīng)分級(jí)為3級(jí)。N組和H組培養(yǎng)3 d細(xì)胞密度較低，細(xì)胞伸展良好，呈長梭形或多邊形;培養(yǎng)5 d細(xì)胞密度增加，細(xì)胞間較為擁擠，絕大部分細(xì)胞伸展良好，呈長梭形或多邊形，部分細(xì)胞因細(xì)胞密度增加而形成圓形;培養(yǎng)7 d細(xì)胞密度極高，細(xì)胞間極其擁擠，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，細(xì)胞難以伸展，細(xì)胞形態(tài)變小，出現(xiàn)大量圓形細(xì)胞。

H組和N組各觀察期OD值均較P組為高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）;H組和N組隨時(shí)間推移細(xì)胞活力逐漸增大，5 d時(shí)達(dá)到最高峰后開始下降（P <0.05）。

2.2 溶血試驗(yàn)

N 組、P 組平均 OD 值分別為（0.008 ± 0.003）和（0.648 ± 0.050），本組實(shí)驗(yàn)有效;H組溶血率為—0.6%，無溶血反應(yīng)。

3 討論

鎂合金具有與人體相匹配的力學(xué)特性，以及其它金屬所不具有的可降解性，可望成為一種新型骨科植入材料。我們既往的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，無涂層鎂鋁合金具有嚴(yán)重的溶血反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HA涂層鎂鋁合金溶血率為—0.6%，無溶血反應(yīng)。

孟祥翔等報(bào)道，表面進(jìn)行階躍式陽極氧化改性后的鎂合金 （AZ-1 和 AZ-3）材料溶血率<5%，具有良好的血液相容性;郭磊等對(duì)氧化鎂表面膜處理的AZ31B鎂合金材料進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，與AZ31B鎂材料較高的溶血率相比，經(jīng)氧化鎂表面膜處理的AZ31B鎂合金材料其溶血率符合生物材料標(biāo)準(zhǔn)，表明涂層處理可大大減少鎂合金的溶血作用。

盡管我們的既往研究提示鎂鋁合金無皮膚致敏作用，但畢竟涂層改變了鎂鋁合金的性狀，因此我們對(duì)HA涂層鎂鋁合金作了進(jìn)一步的皮膚致敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示豚鼠皮膚無明顯改變，該涂層材料無致敏作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉魁， 郭磊， 黃晶晶， 等. AZ31B鎂合金植入小鼠的生物相容性考察[J] . 中國生物工程雜志， 2008， 28（3）： 59-63.

[2] 陳旭瓊， 尹慶水， 張余， 等. 鎂合金材料的溶血率及影響因素[J] . 中國組織工程研究， 2012， 16（25）： 4632-4636.

課題項(xiàng)目：

1、河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：192102210162;

2、河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：21A4300 28。