宋文英,王 臻,唐 浩,丁 慧

(陜西省人民醫(yī)院麻醉科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:DinHuSR@126.com)

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的常見原因,是由圍產期新生兒缺氧和窒息相關的多種因素引起的[1]。圍產期HIBD可導致慢性殘疾和急性死亡,并導致長期的神經(jīng)行為障礙,例如癲癇、認知障礙和嬰幼兒腦癱,甚至新生兒死亡[2]。

AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種三聚體絲氨酸/蘇氨酸激酶,由α催化(α1或α2)、β調節(jié)劑(β1或β2)和γ調節(jié)劑(γ1,γ2或γ3)亞基組成[3]。AMPK是細胞能量儲備的主要傳感器,例如葡萄糖缺乏、局部缺血、饑餓和氧化應激等一系列病理狀況都會增加AMPK的活性[4]。當細胞面臨能量應激時,AMPK可通過磷酸化激活,進行分解代謝/合成代謝途徑調節(jié)以增加細胞ATP水平[5]。AMPK也是參與神經(jīng)保護的重要因素,大量證據(jù)表明,增加神經(jīng)元中的AMPK活性可以保護神經(jīng)元免受各種傷害[6]。AMPK可以通過缺血預處理激活,并發(fā)揮有益作用[7]。已有研究證明AMPK介導caspase-3依賴性神經(jīng)元凋亡,是缺血性損傷期間神經(jīng)元死亡的主要機制之一[8],說明AMPK激活或抑制是治療腦缺血的一種方法。

由于缺血缺氧性腦損傷的發(fā)病機制復雜,臨床上沒有有效的治療方案,且缺少有效的治療藥物。因此,本研究的目的在于研究AMPK對缺血缺氧腦損傷作用的機制,為進一步研究開發(fā)安全有效的HI治療方案和藥劑的研制提供一些見解和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

甲醛(北京化學試劑公司,50406)、生理鹽水(西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司,170324 3A)、無水乙醇(天津市天力化學試劑有限公司,20180408)、TUNEL染液(德國Roche公司,11684817910)、30%丙烯酰胺/胺溶液(Arc-Bis)(雙螺旋生物科技有限公司,L3202A)、兔抗AMPK多克隆抗體(美國Proteintech公司,20584-1-A)、抗p-AMPK多克隆抗體(美國Proteintech公司,20589-6-P)、5×蛋白上樣緩沖液(北京康為世紀生物科技公司,L10406)、TTC染液(廣州齊云生物技術有限公司,D025)、RIPA裂解緩沖液(北京沃凱生物科技有限公司,N653)、化學發(fā)光HRP底物(北京瑞爾欣德科技有限公司,34080)、compound C(Sigma-Aldrich Inc,AB120843)、Autophagy Assay試劑盒(abcam,ab139484)。

1.2 方法

1.2.1 缺血缺氧性腦損傷動物模型的構建和分組 由陜西省人民醫(yī)院[許可證號:SYXK(陜)2016-006]提供健康的7日齡新生SD大鼠(雌雄各半),平均體質量為(14±1.51)g,采用母乳喂養(yǎng)。保持在自然光(12 h/12 h明暗循環(huán))、18-22 ℃的溫度和40%-70%的相對濕度環(huán)境下,且噪音保持在50 dB以下,小鼠自由飲水和進食。飼養(yǎng)3 d后將這些大鼠隨機分為3組,即假手術組(sham組)、缺血缺氧腦損傷6 h模型組(HI6 h組)和缺血缺氧腦損傷12 h模型組(HI12 h組)。HI模型的建立使用改進的Rice等[9]的方法。大鼠腹膜內注射0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,在頸部切開約0.5 cm的切口,仔細分離頸動脈用雙結扎線將其永久結扎以阻斷血液流動,采用4號針縫合切口,手術持續(xù)時間不超過5 min,以防止由于手術時間延長而導致的非手術因素對新生大鼠造成任何傷害。待大鼠完全蘇醒后放入20 ℃恒溫的密封50 ml低氧容器中。缺氧2 h后,將大鼠送回母親進行母乳喂養(yǎng)。在模型組中如果大鼠表現(xiàn)出緩慢移動、穩(wěn)定性差并且翻身困難則認為該模型的建立成功。在HI模型建立6 h時處死大鼠進行后續(xù)實驗研究,即為HI6 h組;HI建模成功后12 h將大鼠處死進行后續(xù)實驗,即為HI12 h組;假手術組的大鼠僅進行頸動脈分離,無結扎或缺氧。

1.2.2 TUNEL染色檢測神經(jīng)元細胞凋亡 各取3個組的大鼠腦組織用4 ℃的10%甲醛固定,然后進行脫水透明處理,再將其浸入60 ℃石蠟中2 h包埋,取出組織置于冰上,待完全冷卻凝固后,放入-20 ℃冰箱凍硬置于切片機切片(5 μm),然后將切片于50 ℃水面上展開,撈片、干燥。將干燥后的切片進行脫蠟、復水等處理后,用蛋白酶K工作液30 ℃孵育20 min,然后用PBS清洗3-5次,每次5 min。將清洗好的切片置于TUNEL反應液中,37 ℃黑暗孵育1 h,再用PBS清洗3次,每次5 min。最后在切片中滴入適量DAPI,蓋好蓋玻片封片,室溫放置10 min后于激光共聚焦顯微鏡下觀察并統(tǒng)計陽性細胞數(shù)量。

1.2.3 腦含水量的檢測 各取3個組的大鼠麻醉后置于冰上立即取腦,去除小腦,取損傷部分稱濕重,然后將其至于100 ℃烘箱烘干24 h,直到干重到達恒重為止,稱其干重。腦含水量的檢測參照公式:腦含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.2.4 腦梗死體積的檢測 各取3個組的大鼠的腦組織,加入組織冷凍包埋劑(-20 ℃,15 min),切2 mm厚大腦冠狀面切片,于37 ℃的2% TTC染液中孵育15 min,用10%甲醛溶液固定(pH7.4),過夜脫水,采用Image pro plus 5.1軟件檢測腦梗死體積。

1.2.5 蛋白質免疫印跡檢測p-AMPK和AMPK蛋白的表達 各取3個組的大鼠的右半球大腦皮層并均質化,并通過RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。采用8%-12% SDS-PAGE電泳上分離出具有等量蛋白質的不同樣品,轉移到硝酸纖維素膜上,并于含5% BSA和0.1% Tween 20的1×Tris緩沖鹽(TBS)中(1×TBST)室溫孵育2 h。將膜與抗p-AMPK的小鼠單克隆抗體(Thr172)(1∶600),AMPK(1∶800)一起孵育,然后用1×TBST洗滌;并與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h。洗滌后在室溫下用化學發(fā)光HRP底物檢測蛋白帶5 h,然后將其暴露于X射線膠片(Fujifilm Inc.)。使用Quantity One軟件4.6.2(Bio-Rad Laboratories Inc.)分析一抗結合的信號強度,并以上樣對照GAPDH蛋白(1∶1 000)標準化條帶。

1.2.6 AMPK抑制劑處理 將compound C(AMPK抑制劑)溶于注射用鹽水中,compound C的劑量(20 mg/kg)和給藥途徑(腹膜內注射)參照McCullough等[10]的研究結果選擇,在所用劑量下compound C不會顯著影響大鼠的其他生理參數(shù)[10]。將相同劑量compound C分別注射到假手術組(sham+CC組)和建模成功后的HI6 h組(HI6 h+CC組)和HI12 h組(HI12 h+CC組)的大鼠,并做后續(xù)檢測。

1.2.7 大鼠自噬細胞檢測 用過量CO2處死大鼠,用無菌器械取出腦組織,放在盛有4 ml含Ca2+和Mg2+的平衡鹽溶液(BSS)的無菌培養(yǎng)皿中。在顯微鏡下剝離腦膜,取下海馬體,并置于新配制的0.25%胰酶BSS溶液中37 ℃孵育15 min。隨后小心吸掉胰酶溶液,加入5 ml BSS,層流柜中室溫放置5 min,重復此步驟3次。分離細胞并計數(shù)以確定細胞密度,再將細胞懸浮于poly-L-lysine處理的培養(yǎng)皿。2 h后,將蓋玻片轉移至含有單層神經(jīng)膠質的培養(yǎng)皿中用于后續(xù)實驗。

本實驗使用Autophagy Assay試劑盒(ab139484)進行自噬細胞的檢測,按照說明書步驟操作。首先用400 μl 1×Assay Buffer清洗細胞,棄上清后重懸細胞,并調節(jié)至細胞濃度為106個/ml,取200 μl細胞懸液至新得EP管中,加入20 μl綠色檢測試劑(Green Detection Reagent)在37 ℃下孵育細胞,避光染色30 min。800g離心5 min后收集細胞,重懸細胞后滴1滴細胞懸液在玻璃載玻片上,并覆蓋蓋玻片,再用熒光顯微鏡進行核染色定量檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本實驗獲得的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。多組間比較采用單因素方差分析及LSD事后檢驗進行統(tǒng)計分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 缺血缺氧性腦損傷大鼠腦含水量和腦梗死體積指標變化

結果顯示,缺血缺氧性腦損傷模型組大鼠中腦含水量顯著高于sham組(P<0.05),其中HI12 h組大鼠中腦含水量雖然高于HI6 h組大鼠,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而通過對3組大鼠腦梗死體積的檢測發(fā)現(xiàn),HI6 h組和HI12 h組大鼠腦梗死體積顯著大于sham組的大鼠腦梗死體積,且HI12 h組大鼠腦梗死體積顯著大于HI6 h組大鼠腦梗死體積(P<0.05,見圖1)。

2.2 缺血缺氧性腦損傷大鼠神經(jīng)元細胞凋亡情況

通過TUNEL染色法檢測了各組大鼠腦神經(jīng)元的凋亡情況。結果表明,與sham組大鼠相比,HI6 h組和HI12 h組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著增加,且隨著缺血缺氧腦損傷時間的增長,其凋亡數(shù)量也相應增加(見圖2)。

圖2 TUNEL染色法檢測大鼠腦神經(jīng)元凋亡情況

2.3 缺血缺氧性腦損傷大鼠腦組織中p-AMPK和AMPK蛋白的表達

與sham組大鼠相比,HI6 h組的大鼠中p-AMPK/AMPK相對表達量升高(P<0.05);與HI6 h組大鼠相比,HI12 h組的大鼠中p-AMPK/AMPK相對表達量升高(P<0.01,見圖3)。其結果表明缺血缺氧性腦損傷大鼠中AMPK被激活,且表達量顯著上調。

與sham組比較,*P<0.05;與HI6 h組比較,#P<0.05

2.4 AMPK抑制劑處理對缺血缺氧性腦損傷大鼠p-AMPK/AMPK表達和腦梗死體積的影響

結果顯示,與HI12 h組的大鼠相比,HI12 h+CC組大鼠p-AMPK/AMPK的相對表達量顯著降低(P<0.01),大鼠的腦梗死體積顯著變小(P<0.01,見圖4)。這些結果表明,AMPK途徑是缺血缺氧性腦損傷大鼠神經(jīng)元的新型信號通路。

與HI12 h組比較,**P<0.01

2.5 AMPK抑制劑處理對大鼠自噬體形成的影響

結果顯示,未使用AMPK抑制劑CC處理的大鼠中自噬體的數(shù)量顯著高于使用了抑制劑CC處理的大鼠的自噬體的數(shù)量(見圖5)。該結果表明AMPK可能對細胞自噬具有重要的調控作用。

圖5 AMPK激活或抑制對HI大鼠自噬體形成的影響

3 討論

缺血缺氧是由于腦血壓急劇下降以及隨后的氧氣和葡萄糖供應中斷而引起的腦損傷。缺血性損傷與各種類型的細胞應激有關,包括谷氨酸興奮性中毒[11]、氧化/亞硝基應激[12]、細胞凋亡[13]和壞死[14]。

先前的研究表明,AMPK的激活能夠誘導自噬,并隨后激活心臟、肝臟、腎臟和肌肉組織抗缺血性損傷的保護作用[15],這在HI發(fā)展過程中具有重要的作用。然而,自噬在腦缺血發(fā)病機制中的作用仍存在爭議和不確定性[16]。多項研究結果表明,中風發(fā)作而引起的自噬激活加劇了缺血性神經(jīng)元損傷程度[17]。但是也有更多的研究結果表明,自噬在大腦中的預激活顯著增強了對缺血性損傷的耐受性,在于自噬的激活促進了細胞能量的產生,并進一步導致缺血暴露期間的神經(jīng)元細胞凋亡減少[18]。在本研究中,我們探究了HI激活AMPK后在大腦中誘導細胞的自噬作用。此外,我們還研究了缺血缺氧大鼠模型中AMPK依賴性自噬對神經(jīng)保護的作用。研究結果表明,缺血缺氧性腦損傷大鼠的敏感區(qū)域激活了自噬途徑的發(fā)生,適度的自噬對缺血缺氧具有保護作用,過度的自噬則會造成神經(jīng)元的損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)HI通過AMPK依賴性途徑誘導自噬,隨后導致缺血性腦含水量的增加和神經(jīng)元細胞凋亡的加劇。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在調節(jié)全身細胞能量的穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用[19]。盡管有新的證據(jù)表明AMPK可以被缺血處理激活,并作為缺血性代謝適應的潛在介質發(fā)揮有益作用[20],但迄今為止,關于AMPK在缺血缺氧性腦損傷中的作用機制研究仍然有限。因此,本研究檢測了磷酸化的p-AMPK蛋白的表達水平變化,結果表明隨著HI的時間增加(6-12 h),其蛋白表達水平顯著上調,這一結果與前人報道的結果一致,HI使AMPK激活并發(fā)揮重要作用。新的研究證據(jù)表明缺血會導致周圍器官中AMPK的激活,在心臟中缺血預處理后p-AMPK/AMPK比例顯著增加,這說明AMPK活性上調[21]。Peralta等[22]在肝臟中發(fā)現(xiàn)缺血預處理會導致AMPK活化,從而保護了肝臟免受缺血再灌注損傷。這些研究結果表明AMPK可能充當缺血性代謝適應的介體,介導缺血損傷在周圍器官中下游保護性信號的傳導。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HI上調了大鼠腦中的p-AMPK/AMPK的表達水平,該結果表明HI誘導了大腦AMPK的激活。

本研究還發(fā)現(xiàn)缺血缺氧性腦損傷(HI)誘導的AMPK激活會導致自噬的增強。同時,通過抑制AMPK可以完全消除這種現(xiàn)象,這表明HI以AMPK依賴性途徑顯著增強了腦細胞的自噬。與我們的研究結果一致,通過降血糖藥二甲雙胍激活AMPK可以增強大鼠腦細胞的自噬[23]。在來自糖尿病OVE26小鼠的心肌細胞中,AMPK的藥理激活導致自噬激活,使糖尿病性心肌病發(fā)生率降低[24]。Pauly等[25]最近的一項研究表明,AICAR(一種AMPK激活劑)的使用導致患有杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠肌肉中自噬的增加。此外,Wang等[26]發(fā)現(xiàn)AMPK的激活導致腎臟腎小管細胞自噬活性的上調。AMPK可以通過多種信號通路激活自噬,AMPK激活可通過抑制mTOR(一種保守的Ser/Thr激酶,對自噬起負調節(jié)作用)來增強自噬作用[27]。AMPK激活大腦自噬的確切途徑還有待在未來進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)AMPK介導的自噬對缺血缺氧性腦損傷大鼠的神經(jīng)起到一定的保護作用,本研究結果顯示HI誘導的梗死體積和神經(jīng)元細胞凋亡可以通過抑制AMPK或自噬而實現(xiàn)完全逆轉。這種保護機制可能是由于HI誘導的自噬可以通過降解細胞蛋白、脂質和糖原來恢復細胞內ATP和氨基酸,從而增加神經(jīng)元對致死性缺血暴露的耐受性[28]。除了能促進細胞能量產生外,自噬還提供了一種通過去除功能異常的線粒體而有效利用這些底物的機制[29]。

總之,我們的研究結果表明缺血缺氧性腦損傷大鼠在AMPK介導的途徑中誘導腦組織的自噬,并使神經(jīng)功能缺損得到適當?shù)木徑狻Ｕf明AMPK的激活對缺血缺氧性腦損傷疾病的治療具有重要意義,AMPK可能是缺血缺氧腦損傷引起的中風預防和治療的潛在靶標。