左 楊，張心寧，喬俊卿，李玥蓉，劉永鋒，劉郵洲*

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京 210014；2. 江蘇省睢寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，睢寧 221225；3. 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816）

由亞隔孢殼屬瓜類黑腐球殼菌Didymella bryoniae引起的蔓枯病是世界范圍內(nèi)的一種真菌土傳病害，可危害多種葫蘆科作物，如甜瓜、西瓜、黃瓜、哈密瓜等，嚴(yán)重影響瓜類蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。據(jù)報(bào)道，西甜瓜蔓枯病田間發(fā)病率一般為15%～25%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)60%～80%，減產(chǎn)可達(dá)30%以上[2]。病原菌以分生孢子器或子囊殼在宿主殘骸中越冬，亦可存活在種子中，一般帶菌率為 5%～30%，病菌在種子上可存活18個(gè)月以上[3]。蔓枯病在瓜類蔬菜的整個(gè)生育期都能危害，植株各部位均可受害，其中以葉片、莖蔓和果實(shí)受害為主，引起葉片、莖蔓枯死和果實(shí)腐爛。高濕及晝夜溫差大有利于蔓枯病的發(fā)生，在田間溫度20 ℃～25 ℃、相對濕度85%以上時(shí)，病原菌能夠迅速侵染寄主組織并大量繁殖，可在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致大量藤蔓枯死，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

國內(nèi)有關(guān)瓜類蔬菜蔓枯病的防治研究起步較晚，目前并無良好的高抗品種。生產(chǎn)上采取的防治方法主要是化學(xué)防治，長期、大量使用化學(xué)藥劑不僅增加農(nóng)產(chǎn)品有毒化學(xué)物質(zhì)殘留，影響農(nóng)產(chǎn)品安全和人類健康，而且造成生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重污染，病原菌易產(chǎn)生抗藥性等[5]。生物防治對人畜安全、環(huán)境兼容性好、病菌不易產(chǎn)生抗藥性，越來越受到人們的重視，并初見成效[6]。目前國內(nèi)外對蔓枯病菌研究和應(yīng)用較多的生防真菌主要是木霉菌[7,8]，生防細(xì)菌主要有芽胞桿菌屬Bacillus和假單胞菌屬Pseudomonas等[9-12]，利用辣椒溶桿菌Lysobacter capsici防治蔓枯病尚未見報(bào)道。此外，煙管菌Bjerkandera adustaM1對西瓜蔓枯病菌有較好的抑制作用，溫室盆栽防效高達(dá)74.3%，在掃描電鏡下觀察到煙管菌M1能夠直接穿透西瓜蔓枯病菌菌絲[6]。撕裂蠟孔菌Ceriporia lacerateHG2011的發(fā)酵液能防治黃瓜蔓枯病，降低發(fā)病率和病情指數(shù)，同時(shí)還可以提高土壤酶活性，促進(jìn)黃瓜幼苗吸收養(yǎng)分、健康生長[13]。

本研究以蔓枯病菌DB-20為靶標(biāo)菌，通過平板對峙、種子發(fā)芽、幼苗生長和溫室盆栽防治試驗(yàn)，篩選出理想的拮抗細(xì)菌有效防治瓜類蔬菜蔓枯病，為開發(fā)防治瓜類蔬菜蔓枯病的生物殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 拮抗細(xì)菌-辣椒溶桿菌Lysobacter capsiciNF87-2、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilisPTS-394、綠針假單胞菌Pseudomonas chlororaphisYL-1、萎縮芽胞桿菌Bacillus atrophaeusYL3、貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensisYL21和短小芽胞桿菌Bacillus pumilusZR3-2，病原真菌-蔓枯病菌Didymella bryoniaeDB-20均由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2 植物材料 西瓜品種：K3（感病品種，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供），京欣一號和早佳8424（市售常見品種）；黃瓜品種：研四黃瓜（市售常見品種）。

1.1.3 培養(yǎng)基及營養(yǎng)液 蔓枯病菌的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar , PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL；拮抗細(xì)菌的培養(yǎng)基為LB ( Luria-Bertani )培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、水1000 mL。

1.1.4 拮抗細(xì)菌發(fā)酵液和次生代謝產(chǎn)物的制備 挑取拮抗細(xì)菌的新鮮菌苔接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖培36 h，得到拮抗菌發(fā)酵液，用空白LB培養(yǎng)液調(diào)至菌含量109CFU/mL（下同），備用。采用酸沉淀法[14]，將芽胞桿菌發(fā)酵液于4 ℃、10000 r/min離心15 min，上清液用6 mol/L HCl調(diào)pH至2.0，4 ℃沉淀12 h，10000 r/min離心20 min，棄上清液，收集沉淀，得到的沉淀加入2 mL甲醇（MeOH）后用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，獲得芽胞桿菌脂肽類化合物的粗提物，放?20 ℃保存?zhèn)溆?。采用乙酸乙酯萃取法[15]，將辣椒溶桿菌NF87-2發(fā)酵液于4 ℃、10000 r/min離心15 min，上清液用6 mol/L HCl調(diào)pH至3.0，以等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取，上層萃取液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干濃縮，以2 mL甲醇-水溶液（MeOH-H2O，體積比2:1）溶解，獲得辣椒溶桿菌NF87-2發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物粗提物，放?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 蔓枯病菌的培養(yǎng)和孢子懸液的配制 蔓枯病菌在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)7 d 后，用滅菌的打孔器打孔直徑5 mm的圓形菌塊，隨后用滅菌手術(shù)刀在新鮮黃瓜上去除同等大小面積的表皮后放置圓形菌塊，室溫放置5～7 d。待蔓枯病菌的分生孢子長出后，用滅菌毛刷蘸取少量無菌水，輕輕將表面孢子刮下，放至無菌水中。血球計(jì)數(shù)板檢測孢子數(shù)目，配置成105孢子/mL的懸浮液。

1.2 拮抗細(xì)菌和代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌菌絲生長的室內(nèi)抑制試驗(yàn)

蔓枯病菌DB-20在PDA平板28 ℃培養(yǎng) 7 d 后，沿菌落邊緣用直徑 5 mm 打孔器打孔，將菌塊置于PDA 平板中央。培養(yǎng)皿四周呈“十”字形（距培養(yǎng)皿中心 30 mm）滴加拮抗菌發(fā)酵液（平板水平線，菌含量109CFU/mL）和清水對照（平板豎直線）各 5 μL。每處理重復(fù)3皿。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照處理病原菌菌落長滿平板時(shí)測量各處理菌落生長半徑，計(jì)算抑制率，抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

將5 mm的蔓枯病菌菌塊置于PDA 平板中央。培養(yǎng)皿四周呈“十”字形（距培養(yǎng)皿中心 30 mm）打孔，孔徑為5 mm?？變?nèi)分別滴加清水對照 10 μL、溶劑對照（甲醇或甲醇水）10 μL、拮抗菌代謝產(chǎn)物 5和10 μL，共計(jì)4個(gè)處理，每處理重復(fù)3皿。28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d后，測量各處理病原菌菌落生長半徑。

1.3 拮抗細(xì)菌和代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn)

試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理：3株拮抗細(xì)菌NF87-2、PTS-394和YL21的發(fā)酵液、代謝產(chǎn)物和清水對照。在滅菌凹玻片中分別滴加40 μL的拮抗菌發(fā)酵液10倍稀釋液（菌含量108CFU/mL）、代謝產(chǎn)物和清水（或甲醇），隨后加入40 μL的蔓枯病菌DB-20孢子液，混勻。將凹玻片放置含有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。當(dāng)清水（或甲醇）對照處理的孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時(shí)，調(diào)查各處理孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率，抑制率（%）＝（對照孢子萌發(fā)數(shù)－拮抗細(xì)菌發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物處理后孢子萌發(fā)數(shù)）/對照孢子萌發(fā)數(shù)×100，調(diào)查孢子總數(shù)設(shè)定為300個(gè)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 拮抗細(xì)菌與蔓枯病菌同時(shí)接種處理對西瓜種子發(fā)芽的影響

采用培養(yǎng)皿中放置保濕濾紙進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。選取3個(gè)西瓜品種，每個(gè)品種選取500粒飽滿的種子，每個(gè)處理100粒，分別浸于無菌水(CK水)、DB-20孢子懸浮液＋無菌水（體積比1:1）（CK?。┖虳B-20孢子懸浮液＋拮抗菌發(fā)酵液10倍稀釋液(體積比1:1，菌含量108CFU/mL)中，共計(jì)5個(gè)處理，24 h后取出，將種子分別擺放在直徑為15 cm的培養(yǎng)皿上，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3和7 d后分別調(diào)查種子發(fā)芽率。試驗(yàn)重復(fù)3次。值得注意的是，拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的菌含量如果過高（＞108CFU/mL）會影響西瓜種子正常的發(fā)芽和出苗，因此本研究中均采用拮抗細(xì)菌發(fā)酵液10倍稀釋液（菌含量108CFU/mL）。發(fā)芽率（%）＝（發(fā)芽種子粒數(shù)／供試種子總粒數(shù)）×100。

1.5 拮抗細(xì)菌與蔓枯病菌同時(shí)接種處理對西瓜出苗的影響

選取3個(gè)西瓜品種，每個(gè)品種選取出芽且芽長基本一致的500粒種子，每個(gè)處理100粒，分別浸于無菌水(CK水)、DB-20孢子懸浮液＋無菌水（體積比1:1）（CK?。┖虳B-20孢子懸浮液＋拮抗菌發(fā)酵液10倍稀釋液(體積比1:1，菌含量108CFU/mL)中，共計(jì)5個(gè)處理，30 min后取出，播于育秧盤中，常規(guī)管理，7 d后調(diào)查出苗情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 拮抗細(xì)菌和代謝產(chǎn)物防治黃瓜蔓枯病的溫室盆栽試驗(yàn)

將長至兩片真葉的健康黃瓜幼苗移栽至裝有200 g無菌土的花盆中（1棵/盆），緩苗15 d，共計(jì)240盆。試驗(yàn)設(shè)8個(gè)處理：40 mL無菌水（CK水），同時(shí)接種20 mL DB-20孢子懸浮液＋20 mL無菌水（CK?。瑫r(shí)接種20 mL DB-20孢子懸浮液＋20 mL拮抗菌發(fā)酵液（3株拮抗菌NF87-2、PTS-394和YL21，菌含量109CFU/mL），同時(shí)接種20 mL DB-20孢子懸浮液＋20 mL拮抗菌代謝產(chǎn)物（3株拮抗菌NF87-2、PTS-394和YL21）。每個(gè)處理10株黃瓜幼苗，試驗(yàn)重復(fù)3次。各處理液用噴壺均勻噴施在黃瓜植株的莖和葉片上，7 d后再噴施拮抗菌發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物一次。14 d后調(diào)查病情指數(shù)，計(jì)算防效。分級標(biāo)準(zhǔn)[6]：0級：植株健康，莖葉處無病斑，或發(fā)病葉小于1%；1級：莖葉有小塊病斑。發(fā)病葉為1%～25%；2級：莖葉有大塊病斑，發(fā)病葉為26%～50%；3級：莖葉有大量病斑,枯萎卷曲，發(fā)病葉為51%～75%；4級：植株有大量病斑，發(fā)病葉片為76%～90%；5級：發(fā)病葉片占到90%以上或全株病死。病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌和代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌菌素生長的室內(nèi)抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果表明（圖1，表1），6株拮抗菌對蔓枯病菌菌絲生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但不同細(xì)菌的抑制能力有所不同。辣椒溶桿菌NF87-2的抑菌效果最好，可以形成明顯的抑菌帶，抑制率為 81.6%；其次是貝萊斯芽胞桿菌YL21和枯草芽胞桿菌PTS-394，抑制率分別為56.5%和55.5%；其余3株拮抗細(xì)菌的抑制率為 38.4%～42.6%，6株拮抗菌對蔓枯病菌菌絲生長的抑制率由低到高是 ZR3-2＜YL3＜YL-1＜PTS-394＜YL21＜NF87-2。選取效果良好的辣椒溶桿菌 NF87-2、枯草芽胞桿菌 PTS-394和貝萊斯芽胞桿菌YL21開展后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 拮抗細(xì)菌對蔓枯病菌菌絲生長的室內(nèi)抑制作用Fig. 1 Inhibition efficacy of six antagonistic bacteria on D. bryoniae

拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌的平板對峙生長試驗(yàn)結(jié)果表明（圖2，表1），辣椒溶桿菌NF87-2用乙酸乙酯提取的代謝產(chǎn)物、芽胞桿菌PTS-394和YL21酸沉淀提取的脂肽類粗提物對蔓枯病菌菌絲生長均具有抑制作用，清水對照和溶劑對照均無抑制作用。當(dāng)對照處理的病原菌生長半徑達(dá)30 mm時(shí)，拮抗菌代謝產(chǎn)物處理的病原菌生長半徑為11.0～12.1 mm。各菌株代謝產(chǎn)物5 μL處理和10 μL處理的病原菌生長半徑基本無差異。

表1 拮抗細(xì)菌及代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌菌絲生長的室內(nèi)抑制作用Table 1 Inhibition efficacy of antagonistic strains and secondary metabolites against D. bryoniae in vitro

圖2 3株拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌菌絲生長的室內(nèi)抑制作用Fig. 2 Inhibition efficacy of secondary metabolites produced by three antagonistic bacteria on D. bryoniae

2.2 拮抗細(xì)菌和代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

清水對照處理6 h后，幾乎所有的蔓枯病菌孢子均正常萌發(fā)，形成細(xì)長芽管，萌發(fā)率為95.3%。3株拮抗細(xì)菌發(fā)酵液10倍稀釋液處理均對蔓枯病菌的孢子萌發(fā)表現(xiàn)出一定的抑制作用，其中辣椒溶桿菌NF87-2處理的抑制作用最強(qiáng)，蔓枯病菌孢子萌發(fā)率僅為38.7%，抑制率為59.4%；枯草芽胞桿菌PTS-394和貝萊斯芽胞桿菌YL21處理后，蔓枯病菌孢子萌發(fā)率分別為69.3%和71.7%，抑制率分別為27.3%和24.8%（表2）。

甲醇溶劑處理后，蔓枯病菌的孢子萌發(fā)率為 90.3%，略低于清水對照處理。3株拮抗細(xì)菌分泌的次生代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌孢子萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)，與各自對應(yīng)的發(fā)酵液相比，孢子萌發(fā)均呈下降趨勢。辣椒溶桿菌NF87-2、枯草芽胞桿菌PTS-394和貝萊斯芽胞桿菌YL21代謝產(chǎn)物處理后，蔓枯病菌的孢子萌發(fā)抑制率分別為67.2%、37.3%和35.8%（表2）。

表2 3株拮抗細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物對蔓枯病菌孢子萌發(fā)的抑制作用Table 2 Inhibition efficacy of three antagonistic bacteria and secondary metabolites on spore germination of D. bryoniae

2.3 拮抗細(xì)菌與蔓枯病菌同時(shí)接種處理對西瓜種子發(fā)芽的影響

3個(gè)西瓜品種清水對照處理無差異，3 d后發(fā)芽率為46%～49%，7 d后發(fā)芽率為78%～82%。蔓枯病菌孢子液處理西瓜種子后，發(fā)芽率明顯下降，3和7 d后發(fā)芽率分別為15%～20%和31%～48%（表3）。

拮抗細(xì)菌與蔓枯病菌同時(shí)接種處理對種子發(fā)芽有明顯的影響，其中辣椒溶桿菌NF87-2處理后7 d，感病品種K3、京欣一號和早佳8424的發(fā)芽率分別為69%、83%和75%，與病原菌DB-20處理組相比，發(fā)芽率提高了122.6%、72.9%和70.5%（表3）。

貝萊斯芽胞桿菌YL21和枯草芽胞桿菌PTS-394處理組的種子發(fā)芽率相當(dāng)，處理后3 d感病品種K3、京欣一號和早佳8424的發(fā)芽率分別為23%～25%、36%～38%和30%～32%，處理后7 d感病品種K3、京欣一號和早佳8424的發(fā)芽率分別為49%、66%～69%和59%～61%，與病原菌處理組相比，發(fā)芽率提高了58.1%、37.5%～43.8%和34.1%～38.6%（表3）。

表3 3株拮抗細(xì)菌與蔓枯病菌同時(shí)接種處理對西瓜種子發(fā)芽的影響Table 3 Seed germination rate after inoculated with antagonistic strains and D.bryoniae

2.4 拮抗細(xì)菌與蔓枯病菌同時(shí)接種處理對西瓜出苗的影響

感病品種K3清水對照處理組的出苗率為83%，但接種蔓枯病菌DB-20孢子懸浮液后，發(fā)病非常嚴(yán)重，出苗率僅為6%，即使施用辣椒溶桿菌NF87-2、枯草芽胞桿菌PTS-394和貝萊斯芽胞桿菌YL21處理，出苗率仍然較低，分別為21%、11%和8%（圖3）。

京欣一號品種試驗(yàn)中清水對照處理組的出苗率為89%，蔓枯病菌DB-20孢子懸浮液處理組的出苗率為38%，顯著低于對照處理。辣椒溶桿菌NF87-2與蔓枯病菌同時(shí)接種處理組的出苗率為82%，與清水對照處理效果相當(dāng)，枯草芽胞桿菌PTS-394與蔓枯病菌同時(shí)接種處理的出苗率和貝萊斯芽胞桿菌YL21處理組相當(dāng)，分別為53%和51%，比病原菌處理組分別提高了39.5%和34.2%（圖3）。

早佳8424品種清水對照處理組的出苗率為88%，蔓枯病菌DB-20孢子懸浮液處理組的出苗率下降為30%，3株拮抗細(xì)菌（辣椒溶桿菌NF87-2、枯草芽胞桿菌PTS-394和貝萊斯芽胞桿菌YL21）與蔓枯病菌接種處理后，西瓜幼苗的出苗率明顯提高，分別為76%、48%和43%，比病原菌處理組分別提高了153.3%、60.0%和43.3%（圖3）。

圖3 拮抗細(xì)菌與蔓枯病菌同時(shí)接種處理對西瓜幼苗生長的影響Fig. 3 Seedling growth after inoculated with antagonistic strains and D. bryoniae at the same time

2.5 拮抗細(xì)菌和代謝產(chǎn)物對黃瓜蔓枯病的盆栽防治效果

3株拮抗細(xì)菌發(fā)酵液處理對黃瓜蔓枯病具有明顯的防治效果，空白培養(yǎng)基對照處理的病情指數(shù)較低，第2次施藥后14 d的病情指數(shù)為0.8，單獨(dú)接種蔓枯病菌孢子液的黃瓜苗發(fā)病嚴(yán)重，第2次施藥后14 d的病情指數(shù)為 39.3。辣椒溶桿菌 NF87-2發(fā)酵液處理后的防效最好，病情指數(shù)顯著低于病原菌處理，防治效果為81.6%，貝萊斯芽胞桿菌YL21和枯草芽胞桿菌PTS-394發(fā)酵液處理的防治效果相當(dāng)，分別為71.4%和67.4%；辣椒溶桿菌NF87-2、貝萊斯芽胞桿菌YL21和枯草芽胞桿菌PTS-394分泌的次生代謝產(chǎn)物對黃瓜蔓枯病也有一定的防治效果，但均比各自的發(fā)酵液防治效果低，分別是66.5%、57.2%和54.8%（表4、圖4）。

圖4 辣椒溶桿菌NF87-2、枯草芽胞桿菌PTS-394和貝萊斯芽胞桿菌YL21及其代謝產(chǎn)物對黃瓜蔓枯病的防治效果Fig. 4 Control effects of three antagonistic strains and their secondary metabolites on cucumber gummy stem blight in pot experiment

表4 3株拮抗細(xì)菌發(fā)酵液及其代謝產(chǎn)物對黃瓜蔓枯病的溫室盆栽防效試驗(yàn)Table 4 Control effects of three antagonistic strains and their secondary metabolites on cucumber gummy stem blight in pot experiment

3 討論

溶桿菌屬是20世紀(jì)70年代末新建立的一個(gè)屬，屬于黃單胞科Xanthomonadaceae，γ-變形菌門Gramma proteobacteria。革蘭氏陰性細(xì)菌，無芽胞，菌體桿狀，無鞭毛。該屬的細(xì)菌一般都能產(chǎn)生黃色至黃褐色色素，細(xì)菌基因組中G＋C含量很高，一般為65%～70%[16]。這類細(xì)菌能產(chǎn)生胞外酶、抗生素及表面活性物質(zhì)，對許多微生物包括真菌、細(xì)菌及線蟲等都表現(xiàn)出拮抗活性[17]。目前研究應(yīng)用較多的菌株包括產(chǎn)酶溶桿菌L. enzymogenes[18-20]、膠狀溶桿菌L. gummosus[21]、抗生素溶桿菌L. antibioticus[22,23]和辣椒溶桿菌[24-27]。前期研究結(jié)果表明，辣椒溶桿菌 NF87-2可以很好地抑制多種病原真菌菌絲生長，并且對辣椒猝倒病有很好的田間防效[15]。本文室內(nèi)外抑菌試驗(yàn)的結(jié)果表明，菌株NF87-2能有效防控瓜類蔬菜蔓枯病，是一株非常有應(yīng)用前景的生防菌。

蔓枯病作為危害瓜類蔬菜的一種重要病害，當(dāng)前研究大部分集中在病原菌鑒定、簡單的抗病遺傳規(guī)律、抗病材料篩選和防治方法等方面[4]。通過觀察、試驗(yàn)、模擬、定性或定量分析，探明不同環(huán)境下寄主—病原菌相互作用而形成的時(shí)空動(dòng)態(tài)規(guī)律，可有助于實(shí)現(xiàn)病害的準(zhǔn)確預(yù)測和綜合治理[28]。Punja等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蔓枯病的藥劑防治時(shí)間很重要?？莶菅堪麠U菌QST713制劑能夠有效防治黃瓜蔓枯病，如果先接種蔓枯病菌，24 h后噴施枯草芽胞桿菌發(fā)酵液，黃瓜蔓枯病發(fā)生嚴(yán)重，防效幾乎為0；反之，如果先接種枯草芽胞桿菌發(fā)酵液，24 h后接種蔓枯病菌孢子液，則發(fā)病率明顯下降。Santos等[28]研究發(fā)現(xiàn)，蔓枯病菌對濕度有很強(qiáng)的敏感性，建議生產(chǎn)上避開雨季種植西甜瓜，可以有效防治蔓枯病的發(fā)生。Rennberger等[29]研究了蔓枯病菌子囊孢子在空氣中的傳播動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)西瓜植株接種蔓枯病菌后，292～313 d后在植株殘余組織上仍然可以檢測到子囊孢子；平板上的子囊孢子7 d后釋放了90%，蔓枯病的發(fā)病率隨著接種源地理位置距離的增加而下降?？傊?，蔓枯病菌的子囊孢子是該病害流行的主要工具，葫蘆科作物的殘余組織可以作為其長期存活的介體，因此在生產(chǎn)上應(yīng)該及早、徹底地清除或燒毀殘余組織，阻斷蔓枯病菌的生存條件[29]。本文的研究結(jié)果表明，蔓枯病菌在植物生長的全生育期都應(yīng)該注意防控，首先是種子處理，帶菌種子的發(fā)芽率僅為48%，菌株NF87-2同時(shí)接種處理后種子發(fā)芽率提高為83%，與清水對照相當(dāng)；其次在苗床階段，接種蔓枯病菌后西瓜出苗率僅為38%，而用菌株NF87-2同時(shí)接種處理后可以明顯減緩發(fā)病率，出苗率提高為82%；黃瓜幼苗移栽后，菌株NF87-2和蔓枯病菌同時(shí)接種處理，防效顯著。上述的試驗(yàn)結(jié)果對于生產(chǎn)上開發(fā)利用辣椒溶桿菌NF87-2，確定其最佳防治時(shí)間、使用劑量和防治效果提供數(shù)據(jù)支撐。

前人研究結(jié)果表明，蔓枯病菌脅迫下，西甜瓜體內(nèi)的防御酶-苯丙氨酸解氨酶 PAL、多酚氧化酶 PPO和過氧化物酶POD會發(fā)生明顯變化，并且這種變化與西甜瓜品種的抗性直接相關(guān)[30]。除此之外，西甜瓜品種內(nèi)源激素含量的變化及其相關(guān)基因的表達(dá)也與其對蔓枯病的抗病能力是相關(guān)的，比如抗蔓枯病甜瓜抗源PI420145葉片中低濃度的乙烯以及高濃度的茉莉酸和水楊酸提高了其對蔓枯病的抗病能力，葉片中EIN 2、PDF1.2、EDS 5和NPRI在接種早期的高表達(dá)促使其比感蔓枯病甜瓜“白皮脆”（對照）更早一步對蔓枯病菌的侵染作出反應(yīng)[31]。任海英等[32]研究發(fā)現(xiàn)，對蔓枯病抗性不同的甜瓜品種感染蔓枯病后 APX的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化，與對照相比，有的抗性品種APX轉(zhuǎn)錄水平升高，但是有的抗性品種APX轉(zhuǎn)錄水平降低，推測APX在甜瓜與蔓枯病菌的互作過程中可能與其他多種信號網(wǎng)絡(luò)交叉互作。Ruangwong等[8]發(fā)現(xiàn)木霉菌PSU-P1對西甜瓜蔓枯病有很好的防效，同時(shí)發(fā)現(xiàn)木霉菌處理后，寄主體內(nèi)的POD、PPO、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶均明顯提高，這可能與防御反應(yīng)直接相關(guān)。本文中菌株NF87-2分泌的次生代謝產(chǎn)物室內(nèi)抑制蔓枯病菌孢子萌發(fā)的效果優(yōu)于菌株發(fā)酵液，表明菌株NF87-2分泌的次生代謝產(chǎn)物是其發(fā)揮抑菌活性所必須的。但在盆栽試驗(yàn)中，菌株NF87-2發(fā)酵液對蔓枯病的防效比其次生代謝產(chǎn)物高，呈顯著性差異，這其中是否也包含菌株NF87-2處理后，引起寄主植株體內(nèi)防御酶系、激素的變化，從而激發(fā)了寄主的抗病性？后續(xù)將研究拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物對西瓜種子發(fā)芽和出苗的影響，同時(shí)監(jiān)測拮抗細(xì)菌或代謝產(chǎn)物與病原菌同時(shí)接種處理后西瓜種子、幼苗或植株體內(nèi)各種防御酶系、激素的變化，為闡明拮抗細(xì)菌的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。